干细胞内耳移植的研究进展

感音神经性聋是耳鼻咽喉头颈外科常见的疾病之一，其主要病理改变为内耳毛细胞、螺旋神经节神经元的损伤。如果能找到一种可以修复毛细胞与螺旋神经节神经元的方法，将为感音神经性聋患者带来福音。迄今为止，干细胞内耳移植相关实验研究已取得较好的成果，本文从干细胞来源、移植途径以及免疫排斥等方面进行综述。

1. 干细胞来源

干细胞(stem cell)是指来自胚胎或成体内、在一定条件下可以无限自我更新与增殖分化的一种细胞^[1]。了解不同干细胞的特性，总结目前各类干细胞在实验中的异同点与优劣势，并在实验之前选出合适的干细胞，将是干细胞内耳移植实验研究的良好开端。

1.1. 胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是来自发育中的囊胚的多能、自我更新的细胞^[2]。2003年就有学者通过实验，成功将小鼠ESCs分化发育成内耳祖细胞，并且证明培育所得的细胞能完整表达出一套决定内耳发育的标记基因，而且这些细胞可与内耳受损组织相结合，并能在体内的耳蜗或前庭感觉上皮中逐渐表达毛细胞标记^[3]。这一成果表明ESCs在内耳移植领域的潜力是巨大的。

随着科技的进步与实验条件的完善，有学者将ESCs进行16~20 d的培育，得到了包含内耳毛细胞和支持细胞的组织，并证实这个方法是可复制、扩展的，非常适用于内耳生物学和再生的基础研究^[4]。Nie等^[5]通过模拟内耳发育过程中关键信号通路的激活和抑制，最终将ESCs诱导分化为毛细胞。这次实验从更微观的角度证明了ESCs增殖分化成毛细胞的可能性，为将来体内实验提供了参考。

1.2. 诱导多功能干细胞

Takahashi等^[6]通过引入Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4这四种因子，从小鼠胚胎或成纤维母细胞中成功培养出诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，并且验证了其增殖分化能力，这为后续的iPSCs诱导培养奠定了良好的基础。2010年，有学者用一种逐步诱导的方法，使iPSCs分化形成了毛细胞样细胞和具有静纤毛束的上皮簇，簇中有些细胞能在机械刺激下产生电流，这与未成熟毛细胞的转导电流如出一辙^[7]，说明iPSCs在内耳移植领域同样极具潜力。

近年有关iPSCs内耳移植的文献有限，但在其他领域的成果值得借鉴。有研究者将iPSCs与小鼠视网膜神经节细胞共培养，发现iPSCs能促进移植的视网膜神经节细胞的存活和神经突的扩展^[8]。如果将iPSCs与小鼠内耳细胞共培养会不会也有类似结果，值得期待。

1.3. 间充质干细胞

间充质干细胞的来源与种类繁多，不同来源的细胞适应能力不尽相同。2017年，Mahmoudian-Sani等^[9]比较骨髓、脂肪和脐带来源的间充质干细胞内耳移植的潜力时发现，骨髓间充质干细胞的免疫调节与适应内耳环境的能力均优于其他两种间充质干细胞，即骨髓间充质干细胞很适合用于内耳移植领域。早些时期，Kamiya等^[10]将骨髓间充质干细胞移植到急性感音神经性听力损失大鼠的外侧半规管中，在损伤区域可以检测到大量的干细胞，同时经对比发现，移植了骨髓间充质干细胞的大鼠听力恢复率明显高于对照组，即骨髓间充质干细胞可用作治疗感音神经性聋。

1.4. 神经干细胞

Parker等^[11]将克隆的神经干细胞(neural stem sell，NSCs)移植到经噪声暴露处置的小鼠和豚鼠的鼓室中，间隔一段时间后发现鼓室中出现了兼具神经组织和Corti器细胞特征的新细胞。另外，他们在实验中发现，NSCs移植到耳蜗之后，可以生存、分化并替代受损的原始细胞。而Huang等^[12]首次证明了牛磺酸能显著改善NSCs移植后的细胞增殖情况，并确定Shh通路在牛磺酸与NSCs共同作用时的正向效应，这为以后的NSCs移植提供了特异的方法与手段，极大促进了NSCs在内耳移植方向上的研究发展。

1.5. 内耳干细胞

2003年，Li等^[13]首次在成年小鼠椭圆囊感觉上皮中分离得到内耳干细胞，并证实其具有自我更新能力和多能性，可以分化成类似毛细胞的细胞，这也为寻找可以替代受损的毛细胞和螺旋神经节神经元的细胞提供了一条全新的道路。2007年，Oshima等^[14]证实在内耳感觉上皮中存在具有多能性的细胞。另外还有研究发现，除了前庭系统和听觉神经节外，耳蜗中也有细胞形成球体，表明这些组织中都包含具有干细胞特性的细胞^[15]。这些成果为内耳干细胞的存在和增殖分化能力提供了更有力的证据。Senn等^[16]通过实验证明，成人椭圆囊中的某些细胞在没有有丝分裂原的情况下，可以自我分化发育出毛细胞样细胞，即它们具有多能性，但成人耳蜗细胞则缺乏分化为主要内耳细胞类型的能力，增殖潜力有限。这为内耳干细胞的定位和取材提供了新的依据。如果能更精确地定位内耳干细胞并提取培养，内耳干细胞作为内耳移植的细胞来源同样值得期待。

2. 移植途径

干细胞移植途径的选择同样至关重要，为了能最大限度地发挥干细胞增殖分化的能力，有些问题值得思考，例如移植的过程是否会对宿主自身造成损伤、移植后的干细胞会进入什么样的内耳环境、干细胞能否经选定的途径移植后在内耳环境中生存繁殖等。如果能探究出一种让干细胞能在宿主体内生存并恢复内耳功能，同时又不会影响宿主解剖结构与生理功能的移植途径，则是干细胞内耳移植领域的重大突破。

2.1. 耳蜗底转

Pandit等^[17]将成人嗅觉黏膜源性干细胞经耳蜗底转注入A/J小鼠的鼓阶后观察到，移植干细胞可以存活2周并表现增殖分化能力，他们认为，在早期进行性感音神经性聋患者中，移植成人嗅觉黏膜源性干细胞可能有助于保持听觉功能。而也有学者证实^[18]，在药物致聋的情况下，经耳蜗底转注入SD大鼠鼓阶的ESCs不仅可以在淋巴管周围存活，还可以在内淋巴管内存活，但是移植6周后存活的细胞数量较2周后的数量明显减少。另外，Matsuoka等^[19]将蒙古沙鼠致聋后，对比了经耳蜗底转的鼓阶注射与蜗轴注射的不同，发现骨髓间充质干细胞可能需要通过蜗轴注射才能起到代替受损螺旋神经节神经元的作用，这为后续相关的实验提供了很好的思路。

2.2. 圆窗

Coleman等^[20]将小鼠ESCs经圆窗注射到豚鼠内耳后发现，有一定数量的ESCs能够存活长达4周，而且不会引起炎症组织反应，同时认为，经圆窗注射对宿主自身听力的影响有限。陈静(2015)报道将iPSCs经圆窗移植到感音神经性聋小鼠耳蜗后，小鼠ABR阈值得到明显改善。另外，Zhu等^[21]发现，iPSCs移植到小鼠耳蜗后，可分化为毛细胞样细胞和螺旋神经节样细胞。这说明圆窗入路具有一定的可行性。

2.3. 耳蜗外侧壁

Xu等^[22]经耳后入路暴露大鼠右耳蜗侧壁，找到基底弯、颞骨、鼓膜三角区，将嗅上皮干细胞经耳蜗外侧壁注入鼓阶，发现这些细胞不仅可以存活，甚至还能向Rosenthal管迁移，表现出不错的活力，并且可以有效地改善因噪声引发的听力损失。这为以后不同的移植路径的对比探究提供了新的方向。

2.4. 中阶

一般情况下，移植的干细胞在进入中阶后，会因高钾环境而迅速死亡。Lee等^[23]用速尿静脉注射和癸酸钠冲洗内淋巴之后，将人ESCs移植到豚鼠内耳后观察到，第1天ESCs分布较广且表现良好，但在第7天，ESCs的分布情况已不尽人意，细胞数量与存活率也明显低于第1天。这也表明，预先降低中阶内钾浓度，可提高移植细胞存活率。但在一周这样的时间段内，干细胞是否开始发挥作用并能改善宿主听力，仍需要更多实验来证明。

除了上述比较常用的移植入路，还有一些其他的已投入研究的路径，例如经半规管入路^[24]、经前庭入路^[25]、动物胚胎时期的耳囊注射^[26-27]、静脉注射^[28-29]、新型外淋巴灌注^[10]等。我们还需要在不同动物、不同模型上找到最佳的移植路径与方法，将内耳干细胞移植领域推向新的高峰。

3. 移植后免疫排斥反应

当干细胞进入内耳微环境时，难免会发生排斥反应。如何最大限度地降低干细胞移植到宿主体内发生的免疫排斥反应仍是一个值得关注的问题。

Lopez-Juarez等^[30]将iPSCs诱导得到的内耳祖细胞移植到成年耳毒性豚鼠模型后，很快就发生免疫排斥反应，于是他们又加入了环孢素对照试验，结果显示，经环孢素处理的动物，移植细胞的数量和活性较对照组均明显增加，说明免疫抑制剂的应用可以降低移植后免疫排斥反应的影响程度。不过，不少学者逐渐把目光投向了骨髓间充质干细胞在移植过程中的免疫调节作用^[31-33]。Naito等(2004)率先提出利用自体骨髓间充质干细胞进行移植的方法，不仅容易获取，而且还能降低免疫排斥反应。Ishikawa等^[34]将骨髓间充质干细胞与iPSCs来源的细胞共移植到内耳后发现，共移植组的细胞存活率及存活时间均优于对照组(仅移植iPSCs来源的细胞)。另外，也有很多学者提倡多使用内耳干细胞，因为其源于内耳，更适应内耳环境，利于生存^[35]。

一些新兴的用于降低免疫排斥反应的方法同样值得关注。日本拟定利用iPSCs来源的免疫调节细胞来延长同种iPSCs来源的同种异体移植物的存活时间^[36]。也有研究人员想利用一种纳米粒子锚定水凝胶支架持续释放免疫抑制剂，以达到提高移植物存活率的目的^[37]。如果能将这些手段应用于干细胞内耳移植领域，或许可收到不错的成效。

4. 问题与展望

随着现代科技的发展与人类生活质量的提升，影响听力的因素也越来越多^[38]：耳毒性药物的应用、耳机的过度使用、频繁的噪声暴露、外伤、遗传、病原体感染等。目前关于耳聋治疗方法的报道很多，包括佩戴助听器、植入人工耳蜗、糖皮质激素^[39]、高压氧治疗^[40]、传统中医药疗法^[41]等，虽然部分患者接受以上治疗后可以获得听力和生活质量的改善，但对于非常严重的听力损失，效果仍不理想。2004年，Li等^[42]便提出了使用干细胞治疗受损内耳的不同方法，并指出了相关工作的潜在障碍与困难。现已证明干细胞疗法具有广阔前景^[43]，但是目前仍有一些实际存在的问题不容忽视，例如，干细胞的成瘤性^[1]、移植的免疫排斥问题等。如果可以选择出合适的细胞，配合有效的植入途径，并能最大限度地降低免疫排斥反应，提升移植细胞存活时长以及优化干细胞分化效果，相信干细胞内耳移植疗法可以得到更大的突破。