红景天苷对急进高原大鼠肺组织的保护作用

Abstract

Objective

: To study the protective effect and mechanism of salidroside on lung tissue of rats exposed rapidly to high altitude.

Methods

: Thirty-six Wistar male rats were randomly divided into blank control group, model control group, Rhodiola rosea capsule (137 mg/kg) group, salidroside low-dose (14 mg/kg), medium-dose (28 mg/kg) and high-dose (56 mg/kg) groups, with 6 rats in each group. After 5 continuous days of drug administration in the plain lab, rats were rapidly moved to 4010 m plateau field lab. After exposure to hypoxia condition for 3 days the blood gas indexes were detected; the serum levels of inflammatory factors were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA); the oxidative stress index of lung tissue was measured; the pathological changes of lung tissue were observed by microscopy with hematoxylin and eosin (HE) staining; and the expression of occludin in lung tissues was determined by western blotting.

Results

: Compared with blank control group, arterial oxygen saturation (SaO ₂), arterial oxygen partial pressure (PaO ₂), blood pH, standard bicarbonate (SBC) and actual bicarbonate levels in model control group were significantly decreased, and hemoglobin level was significantly increased (all P<0.05). In the model control group, the contents of mast cell protease (MCP) 1, interleukin (IL)-6 and IL-1β were significantly increased, while the contents of interferon-γ were significantly decreased (all P<0.01). The contents of glutathione and total superoxide dismutase in the lung tissues of model control group were significantly decreased, while the content of malondialdehyde was significantly increased (all P<0.01). After Rhodiola rosea and salidroside were given, SaO ₂, pH, hemoglobin, SBC and actual bicarbonate were improved compared with the model control group. Compared with the model control group, the Rhodiola rosea group and salidroside groups had different degrees of improvement in the contents of the above inflammatory factors and oxidative stress indexes, and the salidroside groups had better improvement in MCP-1 and IL-6 than the Rhodiola rosea group. HE staining showed that, after the administration of Rhodiola rosea capsules and salidroside at low, medium and high doses, the hypoxic injury was significantly improved, the cell wall gradually became thinner, and the alveolar wall gradually became complete. The expression of occludin in the model control group was lower than that in the blank control group ( P<0.05), while the expression of occludin in the salidroside high-dose group was significantly higher than that in the model control group ( P<0.01).

Conclusion

: Salidroside can improve the abnormality of blood gas index, hypoxia symptoms and acid-base balance disorder, dysregulation of inflammatory factors caused by hypoxia in rats, and improve lung tissue injury and oxidative stress injury, which has a protective effect on lung tissue injury of rats exposed rapidly to the high-altitude plateau, and the effect is better than Rhodiola rosea capsule on the whole.

白介素（interleukin，IL);放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）;含吐温-20的Tris盐缓冲液（tris buffered saline with Tween-20，TBST）;总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）;丙二醛（malondialdehyde，MDA）;谷胱甘肽（glutathione，GSH）;肥大细胞蛋白酶（mast cell protease，MCP）;酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）;苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）;动脉血二氧化碳分压（arterial blood carbon dioxide partial pressure，PaCO ） ;动脉血氧分压（arterial oxygen partial pressure，PaO ） ;标准碳酸氢盐（standard bicarbonate，SBC）;动脉血氧饱和度（arterial oxygen saturation，SaO ） ;

高原低氧环境会使人体中动脉血氧分压和血氧饱和度下降，影响肺功能 ^[1] ，从而引发严重缺氧甚至高原肺水肿。红景天胶囊在高原低氧环境下有着明显的抗缺氧作用 ^[2] ，可以改善慢性阻塞性肺疾病所引起的氧化应激损伤和血氧保护度的下降 ^[3] 。有研究发现，红景天的主要活性成分红景天苷可改善慢性间断性缺氧模型小鼠的肺损伤 ^[4] ，降低低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中IL-6及肿瘤坏死因子α阳性细胞比例，改善平均肺动脉压、平均颈动脉压及右心室肥厚指数 ^[5] 。野生红景天资源匮乏，但红景天苷可以酪醇为原料，经保护、成苷、脱保护等步骤合成 ^[6] ，方法较简便、绿色环保、合成产率高。因此，用红景天苷产品代替红景天胶囊具有一定的社会及经济价值。

本文通过研究红景天苷对急进高原（在 1 d内急进海拔 4010 m的高原实地）大鼠血气指标、氧化应激指标、炎症指标等的影响，评价其对大鼠肺组织在高原缺氧损伤后的保护作用，为红景天苷开发为红景天胶囊的替代或升级产品奠定实验基础。

材料与方法

实验试剂和仪器

红景天胶囊（批号200705）为西藏军区总医院产品；红景天苷（批号HS181211S1，纯度至少98%）为宝鸡市辰光生物科技有限公司产品；0.9%氯化钠注射液为石家庄四药集团产品；多聚甲醛固定液为武汉赛维尔生物科技有限公司产品；肝素钠为南京新百药业有限公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒、高效RIPA组织裂解液、30%制胶液、10×TBST缓冲液为北京索莱宝科技有限公司产品；T-SOD试剂盒、MDA测定试剂盒、GSH试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；大鼠IL-1β、γ干扰素、MCP-1和IL-6 ELISA试剂盒为上海酶联生物科技有限公司产品；闭合蛋白抗体为艾博抗（上海）贸易有限公司产品。

PrimeCCSComp全自动血气分析仪为美国Nova生物医学公司产品；SpectraMax i3型全自动荧光酶标仪为美国Molecular公司产品；全能型凝胶成像分析系统为美国Bio-Rad公司产品；Tissuelyser-24多样品组织研磨机为上海净信实业发展有限公司产品；涡旋混匀器为海门市其林贝尔仪器制造公司产品；倒置显微镜为日本Olympus公司产品；MDF-U2086S超低温冰箱为日本三洋公司产品；3K15型 4 ℃高速台式冷冻离心机为德国Sigma公司产品。

实验动物及分组

36只（200±20）g雄性Wistar大鼠来源于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院实验动物科，动物许可证号为SCXK（军）2017-0023。将实验大鼠随机分成6组，每组6只，分别为空白对照组（0.9%氯化钠注射液）、模型对照组（0.9%氯化钠注射液）、红景天胶囊组（0.9%氯化钠注射液+红景天胶囊 137 mg/kg）、红景天苷小剂量组（0.9%氯化钠注射液+红景天苷 14 mg/kg）、红景天苷中剂量组（0.9%氯化钠注射液+红景天苷 28 mg/kg）、红景天苷大剂量组（0.9%氯化钠注射液+红景天苷 56 mg/kg）， 红景天苷剂量设置参考文献 [5]。除空白对照组外，其他各组按上述方案预防性灌胃给药 5 d后急进青海玉树巴塘全军高原环境损伤防治重点实验室（海拔 4010 m）， 运送途中果冻补水。抵达高原后，缺氧暴露 3 d， 期间继续每日按剂量给药，自由获取食水，于缺氧暴露第3天末次给药后 1 h开始实验。严格按照“3R”原则设计动物实验，方案通过中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会审查（2021KYLL182）。

血气分析仪测定各组血气分析指标

末次给药 1 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉实验大鼠，取其腹主动脉血，避免接触空气，立即使用血气分析仪进行检测。主要血气分析指标有酸碱度、PaCO ₂、PaO ₂、实际碳酸氢盐、SBC、SaO ₂和血红蛋白等。

ELISA测定血清炎症因子水平

将收集于离心管里的全血标本在室温放置 2 h或4℃过夜，然后1000× g离心 20 min， 取上清液，置于–20℃或–80℃保存（避免反复冻融），采用ELISA测定血清中MCP-1、IL-6、γ干扰素和IL-1β等炎症因子水平。

采用试剂盒测定肺组织氧化应激水平

称取大鼠肺组织，加入相应体积的等渗氯化钠溶液制备10%组织匀浆。用BCA试剂盒测定各组织匀浆的蛋白浓度后通过试剂盒检测T-SOD活性、MDA含量和GSH含量。

HE染色观察肺组织病理学改变

末次给药后 1 h， 通过腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，处死动物，进行中线剖腹术和门静脉切开术，然后剪开腹主动脉排出血液。切除肺组织，用冰冷等渗氯化钠溶液冲洗，称重并收集，用多聚甲醛固定液固定，使组织充分展开。组织固定好后切成 4 μm切片，洗涤，脱水，并透明化处理，石蜡包埋后HE染色，脱水，最后树脂封片。

蛋白质印迹法检测肺组织中闭合蛋白表达量

用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗组织，去除残留血液，加入适量高效RIPA组织和蛋白酶抑制剂。充分裂解后4℃、14 462× g离心 10 min， 收集上清液。采用BCA法测定蛋白质浓度后，开水煮沸 5 min使蛋白质变性，冷却至室温，7378× g离心 5 min， 取上清液即为样品。将上清液上样、电泳、转膜后，用5%脱脂牛奶于室温封闭 2 h， 加入一抗（稀释比例闭合蛋白为1∶1000，β-actin为1∶5000），于4℃下孵育过夜，用1×TBST缓冲液漂洗，加入二抗（稀释比例为 1∶5000 ），于室温下孵育 90 min， 用1×TBST缓冲液漂洗。用凝胶成像分析系统显影，使用ImageJ软件以目的条带与 β-actin的吸光度值之比反映蛋白质表达量。

统计学方法

使用SPSS 22.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验， P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

各组血气分析指标检测结果

与空白对照组比较，模型对照组SaO ₂、PaO ₂、血液酸碱度、SBC和实际碳酸氢盐水平显著下降，血红蛋白水平显著上升（均 P<0.05）；红景天胶囊组和红景天苷组SaO ₂、血液酸碱度、血红蛋白、SBC和实际碳酸氢盐较模型对照组均有一定改善，除红景天苷小剂量组血红蛋白改善情况明显不如红景天胶囊组外，其他各项指标的改善情况红景天苷组与红景天胶囊组差异均无统计学意义。见 表1 。结果提示，红景天苷能缓解模型大鼠的缺氧症状和酸碱平衡紊乱，红景天苷中、大剂量组的效果总体优于小剂量组。

表1 各组血气分析指标检测结果比较

Table1 Results of blood gas indexes of rats in each group

（ n=6， $\overline{x}\pm s$ ）

组　别	SaO 2（%）	PaCO 2（mmHg）	PaO 2（mmHg）	血液酸碱度	血红蛋白（g/L）	SBC	实际碳酸氢盐（mmol/L）
空白对照组	95.90±1.86	40.53±6.60	83.27±12.65	7.42±0.05	125.83±8.42	26.83±5.36	26.73±6.37
模型对照组	86.05±3.54 *	39.05±7.07	63.20±11.24 *	7.22±0.24 *	137.50±3.02 *	18.55±8.39 *	18.72±9.20 *
红景天胶囊组	88.75±1.14 #*	37.03±4.27	58.63±1.77 *	7.35±0.01 #	122.50±8.60 #	21.10±1.78 *	20.67±2.53 *
红景天苷小剂量组	87.87±2.26 *	41.87±3.19	56.87±3.58 *	7.36±0.03 #	132.83±8.42 △	23.70±2.34	24.15±2.62
红景天苷中剂量组	89.08±1.73 #*	42.55±2.14	58.08±3.42 *	7.39±0.03 #	125.83±10.82 #	25.30±2.23 #	25.78±2.46 #
红景天苷大剂量组	89.83±2.40 #*	41.78±3.62	60.53±6.20 *	7.38±0.01 #	130.50±9.18	24.47±1.89 #	24.83±2.42 #

与空白对照组比较， ^* P<0.05；与模型对照组比较， ^# P<0.05；与红景天胶囊组比较， ^△ P<0.05. SaO ₂：动脉血氧饱和度；PaCO ₂：动脉血二氧化碳分压；PaO ₂：动脉血氧分压；SBC：标准碳酸氢盐.

各组血清炎症因子含量比较

与空白对照组比较，模型对照组MCP-1、 IL-6和IL-1β含量显著增加，γ干扰素含量显著减少；红景天胶囊组和红景天苷各剂量组上述炎症因子含量较模型对照组均有不同程度改善，其中红景天苷组MCP-1、IL-6改善情况优于红景天胶囊组，γ干扰素、IL-1β改善情况与红景天胶囊组差异无统计学意义。见 表2。结果提示，红景天苷对缺氧引起血清中炎症因子MCP-1、IL-6、 IL-1β的升高和γ干扰素下降有明显改善作用，改善效果总体优于红景天胶囊。

表2 各组血清炎症因子含量和肺组织氧化应激相关指标检测结果比较

Table2 Contents of serum inflammatory factors and oxidative stress-related indexes in lung tissues of rats in each group

（ n=6， $\overline{x}\pm s$ ）

组　别	MCP-1（ng/mL）	IL-6（pg/mL）	γ干扰素（pg/mL）	IL-1β（pg/mL）	GSH（g/L）	T-SOD（U/mg蛋白）	MDA（nmol/mL）
空白对照组	10.34±3.28	30.19±10.67	70.69±23.64	8.65±3.05	9.04±1.23	3.66±0.35	1.08±0.08
模型对照组	35.38±2.28 *	142.54±43.89 *	21.87±12.23 *	22.70±7.40 *	5.62±0.21 *	2.37±0.57 *	1.32±0.10 *
红景天胶囊组	33.03±4.59	123.30±63.13 *	38.26±22.35	10.23±6.10 #	7.46±1.87 *#	2.95±0.51 *#	0.95±0.07 #
红景天苷小剂量组	19.27±3.24 #△	35.70±22.22 #△	27.11±9.87 *	7.23±2.93 #	7.44±0.57 *#	3.54±0.39 #△	1.15±0.18 #
红景天苷中剂量组	27.43±2.00	49.64±18.84 #△	58.76±28.84	13.56±5.65 #	8.94±1.45 #△	3.28±0.44 #	1.15±0.06 #
红景天苷大剂量组	17.88±3.66 #△	20.55±8.93 #△	34.07±25.64 *	8.51±4.84 #	10.14±0.92 #△	3.40±0.32 #	0.92±0.12 *#

与空白对照组比较， ^* P<0.05；与模型对照组比较， ^# P<0.05；与红景天胶囊组比较， ^△ P<0.05. MCP：肥大细胞蛋白酶；IL：白介素；GSH：谷胱甘肽；T-SOD：总超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛.

各组肺组织氧化应激指标检测结果比较

与空白对照组比较，模型对照组肺组织中GSH和T-SOD含量显著减少，MDA含量显著增加；红景天胶囊组和红景天苷组上述氧化应激指标较模型对照组均改善，其中红景天苷中、大剂量组GSH改善情况优于红景天胶囊组，红景天苷小剂量组T-SOD改善情况优于红景天胶囊组。见 表2。 结果提示，红景天胶囊和红景天苷均能改善缺氧引起大鼠肺组织的氧化应激损伤，且红景天苷的改善效果总体优于红景天胶囊。

各组肺组织病理学变化比较

空白对照组肺泡腔内无分泌物，肺泡壁完整，壁薄，无充血、水肿，无炎性细胞浸润及红细胞渗出。模型对照组肺泡腔内可见渗出物及大量炎症细胞、红细胞渗出，部分肺隔间增厚，支气管上皮杂乱，支气管腔狭窄、变形，大量炎性细胞聚集。与模型对照组比较，红景天胶囊组肺泡腔内分泌物减少，炎性细胞和红细胞减少，细胞壁较缺氧模型组相比较薄，肺泡壁相对完整。红景天苷小、中剂量组肺组织损伤明显缓解；红景天苷大剂量组细胞壁明显变薄，细胞壁完整，肺泡腔内少量分泌物，少量红细胞渗出。随着红景天苷剂量的增加，肺组织形态逐渐趋于正常。红景天苷大剂量组改善肺组织损伤效果优于红景天胶囊组。见 图1。上述结果提示，红景天胶囊和红景天苷各剂量均能改善缺氧引起的大鼠肺组织病变，其中大剂量红景天苷保护效果最好。

图1 .

各组肺组织苏木精-伊红染色结果

A：空白对照组肺泡腔内无分泌物，肺泡壁薄而完整（箭头所示）；B：模型对照组肺泡腔内可见大量渗出物，细胞壁变厚，支气管腔变形（箭头所示）；C：红景天胶囊组肺泡腔内分泌物减少，肺泡壁相对完整（箭头所示）；D：红景天苷小剂量组肺泡腔内分泌物减少，细胞壁变薄（箭头所示）；E：红景天苷中剂量组肺泡腔内分泌物减少，细胞壁变薄，肺泡壁较完整（箭头所示）；F：红景天苷大剂量组肺泡腔仅少量分泌物，肺泡壁薄而完整（箭头所示）. 标尺 =50 μm.

各组肺组织肺泡上皮闭合蛋白表达比较

空白对照组、模型对照组以及改善肺组织缺氧损伤效果最好的红景天苷大剂量组肺泡上皮闭合蛋白的表达情况见 图2。模型对照组闭合蛋白表达量（ 0.68±0.16）较空白对照组（1.04±0.21）减少（ P<0.05），而红景天苷大剂量组闭合蛋白表达量（1.33±0.20）较模型对照组显著 增加（ P< 0.01）。上述结果提示，红景天苷可以逆转由于缺氧引起闭合蛋白表达的减少。

图2 .

各组肺组织中闭合蛋白电泳图

讨论

急进高海拔地区时易诱发急性高原病，急性高原反应的发生率为40%~90% ^[7] ，其中5%会发展为更为严重的高原肺水肿和高原脑水肿 ^[8] 。如何防治高原肺损伤及高原肺水肿备受高原科研人员的关注。生理上的高原缺氧是指在海拔 2500 m以上高原发生的缺氧反应 ^[9] 。本研究中，空白对照组饲养于兰州市（海拔 1500 m）进行实验，而模型对照组饲养于玉树市（海拔 4010 m）进行实验。实验结果显示，急进高原缺氧 3 d后大鼠出现血红蛋白代偿性增加，PaO ₂、PaCO ₂、SBC和实际碳酸氢盐均下降，出现氧合不足，血氧饱和度下降，影响了机体肺氧合功能并出现呼吸性碱中毒合并代谢性酸中毒，使动脉血酸碱度下降。代谢性酸中毒增强了肺血管收缩 ^[10] ，进而发展为肺动脉高压。预防性给予红景天苷小、中、大剂量均能提高缺氧大鼠的SaO ₂，减少动脉血中血红蛋白含量，并使血液的酸碱度值恢复至正常范围。可见红景天苷可改善血液中酸碱失衡和代谢性酸中毒，进而改善肺血管收缩肺组织损伤和血气指标，缓解大鼠的低氧血症。

机体从平原进入高原后，红细胞过度增生，组织内血液缺氧，导致氧自由基和活性氧的释放增多，引起内皮细胞脂质过氧化和酶羟基化，从而损伤内皮细胞，使炎症因子生成增多 ^[11] 。血清炎症因子是机体缺氧后细胞增殖与坏死时被激活、释放的一系列细胞因子。红景天苷可减少机体由于缺氧引起的MCP-1、IL-6、IL-1β炎症因子的升高，增加γ干扰素含量。缺氧 3 d后，大鼠肺组织中出现氧化应激损伤，给予红景天苷和红景天胶囊后，氧化应激各指标归于正常，且随着红景天苷剂量的升高，保护效果整体更好，提示红景天苷对于大鼠肺组织的氧化应激损伤具有一定的剂量依赖性。HE染色结果显示，急进高原缺氧 3 d后大鼠肺组织受到损伤，肺血管收缩，肺支气管狭窄。急性高原暴露可导致缺氧性肺血管收缩，引起肺血管阻力增加以及肺动脉压力升高，损伤严重者会诱导高原肺水肿 ^[12] 。高原肺水肿的特征是液体从肺的血管内腔向血管外腔渗出 ^[13] 。由于肺泡上皮屏障非常紧密，正常情况下毛细血管流出的液体不能从血管内皮细胞的微小间隙进入肺泡间隙，相反该液体可从基质层中的淋巴管返回体循环。肺泡上皮屏障破坏，进而导致肺泡液泛滥的机制有以下两种，即肺毛细血管静水压力增加和肺血气屏障通透性增加 ^[14] 。给予红景天胶囊和红景天苷后，模型鼠肺组织的损伤部位得到改善，细胞壁明显变薄，肺泡腔内渗出物减少。根据病理结果可知，缺氧后肺泡上皮屏障遭到破坏，从而导致炎性因子、红细胞渗透，紧密连接主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连接复合体中，相邻细胞膜紧靠在一起形成环绕细胞的物理屏障结构，具有封闭上皮细胞间隙，防止可溶性物质从细胞一侧扩散到另一侧的屏障功能 ^[15] 。闭合蛋白是组成紧密连接结构的关键蛋白 ^[16] ，本研究通过蛋白质印迹法测定闭合蛋白的表达，发现大剂量红景天苷可以通过增加闭合蛋白的表达来保护肺组织结构的稳定。

综上所述，红景天苷可改善大鼠由于缺氧所致的血气指标失调、缺氧症状和酸碱平衡紊乱，改善由于缺氧导致的炎症因子失调，改善肺组织损伤、氧化应激损伤等，对急进高原大鼠肺组织损伤具有保护作用，且效果整体上优于红景天胶囊。本研究结果为红景天苷开发为红景天胶囊的替代或升级产品奠定了理论基础，为红景天苷预防和治疗高原肺水肿提供了思路。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（81673508，82173738）; 军队后勤科研项目（CLB19J049）; 中央高校基本科研业务费专项（3192020009）; 甘肃省青年科技基金计划（20JR10RA014）; 联勤保障部队第九四〇医院院内应急医学科研项目（20yjky017）