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. 2020 Dec 25;49(6):714–724. [Article in Chinese] doi: 10.3785/j.issn.1008-9292.2020.12.06

基于网络药理学和分子对接技术探讨葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤的潜在作用机制

Study on the mechanism of Flos Puerariae and Semen Hoveniae in treatment of alcoholic liver injury based on network pharmacology and molecular docking

Yanan WANG 1, Xiaoming YAN 2, Qingyu ZHANG 1, Aihua SONG 1, Fei HAN 1,*
PMCID: PMC10412418  PMID: 33448174

Abstract

目的:

利用网络药理学和分子对接技术对葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤（ALI）的潜在作用机制进行研究。

方法:

先利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和Swiss数据库搜集与葛花、枳椇子药材相关的化学成分及作用靶点，并以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18对化合物进行筛选；同时，使用GeneCard、DrugBank数据库获取与ALI相关的靶点，借助韦恩图映射葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用靶点，再采用String数据库和Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用网络及“药材-潜在活性成分-作用靶点”相互作用网络；接着在DAVID和Reactome数据库中对潜在作用靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；最后，使用AutoDock Vina软件将潜在活性成分与核心靶点进行分子对接验证。

结果:

在葛花-枳椇子中，共筛选出21个与疾病相关的潜在活性成分和431个潜在作用靶点，涉及蛋白结合、ATP结合等273种生物功能及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、TNF信号通路等90条KEGG代谢通路和信号转导、免疫系统等362条Reactome通路。分子对接结果显示，21个潜在活性成分与核心靶点蛋白激酶B（Akt）1、肿瘤蛋白p53（TP53）、IL-6均有较好的亲和力。

结论:

本研究结果揭示了葛花-枳椇子治疗ALI的多成分、多靶点、多途径的作用特点，并预测了可能的药效物质、关键靶点和作用通路，为其新药开发和作用机制研究提供了理论基础。

酒精性肝损伤(alcoholic liver injury，ALI)是由于长期过量饮酒导致的一种慢性肝病。该病初期表现为酒精性脂肪肝，随着病情的发展会逐渐演化为酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌 [ 1- 2] 。由于过度饮酒现象的普遍化，ALI已成为仅次于病毒性肝炎的第二大导致肝损伤的病因，全球每年约有200万人因该病而死亡 [ 3- 5] 。由于该病发病机制复杂，影响因素较多，目前仍无疗效较佳的药物，且晚期ALI的可治愈方法只有肝移植 [ 6- 7] 。所以，迫切需要找到一种可有效治疗或防治ALI的药物。

中医药从整体观出发，辨证论治，因人而异，在治疗ALI方面显示出独特的优势。葛花和枳椇子为我国传统的解酒中药，葛花(Flos Puerariae)为豆科植物野葛[ Pueraria lobata( Wild.) Ohwi]或甘葛藤( Pueraria thomsonii Benth.)的干燥花 [ 8] ，始载于《名医别录》，具有解酒醒脾及治伤酒发热烦渴、饮食不思、呕吐酸痰等功效，是最具代表性的解酒保肝药物。枳椇子(Semen Hoveniae)为鼠李科植物枳椇( Hovenia dulcis Thunb.)的干燥成熟种子，始载于《唐本草》，有清热利尿、止渴除烦、解酒毒之功效，主治呕逆、酒精中毒、热病烦渴、二便不利等症 [ 9- 10] 。已有文献证实，葛花、枳椇子二者配伍较单味给药具有更好的ALI防治作用，且以2 :1配伍效果最佳 [ 11- 12] 。但葛花-枳椇子对防治ALI的作用机制仍不明确。网络药理学的方法与中医药的辨证论治思路较契合 [ 13] ，通过对生物系统网络的分析，以多成分、多靶点、多通路手段揭示中药复方的作用机制。而分子对接技术能够从分子水平阐明中药药效的原理，研究药物分子与靶蛋白之间的几何结构和空间相互作用，使中药研究微观化、科学化 [ 14- 15] 。因此，本研究结合网络药理学和分子对接技术，以葛花-枳椇子治疗ALI为切入点，通过对葛花-枳椇子的潜在活性成分、作用靶点、代谢通路及分子对接的分析探索其发挥疗效的作用机制，为其新药开发和作用机制研究提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1. 葛花-枳椇子化学成分信息的归纳和筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜集归纳葛花、枳椇子药材的化学成分信息，并以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30 %、类药性(drug likeness, DL)≥0.18为阈值进行筛选，然后利用ChemDraw软件保存化学成分结构的Smiles格式。

1.2. 获取葛花-枳椇子治疗ALI的靶点

首先，利用Swiss数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，并结合TCMSP数据库中的作用靶点信息, 预测葛花-枳椇子潜在活性成分的作用靶点；通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)进行基因校正；将两个数据库所得靶点合并去重后即得葛花-枳椇子潜在活性成分的靶点信息。

其次，以“Alcoholic liver injury”为关键词在GeneCard(https://www.genecards.org/)、DrugBank (https://www.drugbank.ca)数据库中检索，获取与ALI相关的靶点信息，汇总整理后即得疾病相关靶点。将潜在活性成分的靶点与疾病靶点上传至韦恩绘图平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行映射，获得葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用靶点。

1.3. 构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

将潜在作用靶点输入String数据库(https://string-db.org/)，限定物种为智人( Homo sapiens)，获得PPI关系，以TSV文件保存。然后，将文件中的node1、node2和Combined Score信息导入Cytoscape 3.4.0软件，构建PPI网络。

1.4. 构建活性成分-作用靶点网络

在Cytoscape 3.4.0软件中导入包含潜在活性成分及作用靶点信息的文件，构建葛花-枳椇子治疗ALI的“药材-潜在活性成分-作用靶点”网络模型，并通过度值和介数值等拓扑学参数对上述模型进行系统分析。

1.5. 靶点富集分析潜在作用

利用DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对潜在作用靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，限定基因物种和背景为人。设定 P＜0.05、错误发现率(false discovery rate, FDR)＜0.05，采用OmicShare在线平台(http://www.omicshare.com/tools/)对前20条KEGG代谢通路进行可视化处理。同时，利用Reactome数据库(https://reactome.org)对潜在作用靶点进行Reactome通路注释分析( P＜0.05、FDR＜0.05)，并汇总前20条Reactome通路基本信息。

1.6. 分子对接潜在作用靶点与活性成分

采用AutoDock Vina软件将PPI网络中度值前三的靶蛋白与21个潜在活性成分进行分子对接验证。首先，在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载靶蛋白的三维结构。其次，利用AutoDock Tools软件为靶蛋白除水、分离配体、加氢及计算电荷，再保存为pdbqt文件，作为受体大分子。然后，在ChemOffice软件中构建潜在活性成分的三维结构并进行能量最小化优化后以mol2文件导出，再将其导入AutoDock Tools软件中，为潜在活性成分添加电荷，分配原子类型，确认柔性键均可旋转，并保存为pdbqt文件，作为配体小分子。最后，运行AutoDock Vina软件进行分子对接，并对结果进行可视化处理。

2. 结果

2.1. 葛花-枳椇子的潜在活性成分

通过TCMSP数据库检索葛花和枳椇子两味药材获得177个化学成分，筛选获得21个潜在活性成分( 表 1)，其中14个成分只属于葛花，3个成分只属于枳椇子，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇是两味药材的共有成分。

表表 1 葛花-枳椇子的21个潜在活性成分及其基本信息

序号

MOL ID

名称

分子式

口服生物利用度(%)

类药性

度值

介数值

来源

1

MOL000098

槲皮素

C 15H 10O 7

46.43

0.28

201

0.3888

葛花、枳椇子

2

MOL000422

山柰酚

C 15H 10O 6

41.88

0.24

130

0.1328

葛花、枳椇子

3

MOL004328

柚皮素

C 15H 12O 5

59.29

0.21

101

0.1293

枳椇子

4

MOL004957

异芒柄花素

C 16H 12O 4

38.37

0.21

96

0.1373

葛花

5

MOL001749

邻苯二甲酸二辛酯

C 24H 38O 4

43.59

0.35

92

0.1902

葛花

6

MOL001792

甘草素

C 15H 12O 4

32.76

0.18

86

0.0823

葛花

7

MOL012976

香豆雌酚

C 15H 8O 5

32.49

0.34

73

0.0697

葛花

8

MOL000358

β-谷甾醇

C 29H 50O

36.91

0.75

71

0.0664

葛花、枳椇子

9

MOL000392

刺芒柄花素

C 16H 12O 4

69.67

0.21

69

0.0505

葛花

10

MOL005916

尼泊尔鸢尾黄素

C 17H 14O 6

37.78

0.30

67

0.0382

葛花

11

MOL008400

黄豆黄素

C 16H 12O 5

50.48

0.24

65

0.0489

葛花

12

MOL000449

豆甾醇

C 29H 48O

43.83

0.76

64

0.0579

葛花、枳椇子

13

MOL000468

8-甲雷杜辛

C 17H 14O 5

70.32

0.27

60

0.0285

葛花

14

MOL002959

3′-甲氧基大豆苷元

C 16H 12O 5

48.57

0.24

55

0.0177

葛花

15

MOL000359

谷甾醇

C 29H 50O

36.91

0.75

43

0.0216

葛花

16

MOL008034

美洲茶酸

C 30H 46O 5

73.52

0.77

33

0.0339

枳椇子

17

MOL011793

葛花亭

C 16H 14O 5

55.25

0.24

24

0.0092

葛花

18

MOL011791

葛花苷

C 28H 32O 15

46.91

0.67

12

0.0051

葛花

19

MOL003629

大豆苷元-4, 7-二葡萄糖苷

C 27H 30O 14

47.27

0.67

8

0.0004

葛花

20

MOL013305

鹰嘴豆醇

C 15H 12O 5

83.67

0.21

4

4.830 -5

葛花

21

MOL002140

川芎哚

C 16H 12N 2O 2

65.95

0.27

3

6.703 -5

枳椇子
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2.2. 葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用靶点

将Swiss和TCMSP数据库中潜在活性成分的作用靶点整合去重后获得519个活性成分靶点。DrugBank和GeneCard数据库归纳整理得到与ALI相关的疾病靶点4950个。潜在活性成分的靶点与疾病靶点取交集共获得431个葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用靶点。

2.3. 葛花-枳椇子治疗ALI潜在作用靶点的PPI网络

利用String数据库获得了431个潜在作用靶点的相互作用关系，构建PPI网络见 图 1。其中节点大小和颜色表示度值大小，节点越大且颜色由绿色过渡到红色对应度值越大；而连线的颜色表示靶点间的结合分数(combined score)，线条颜色越深代表结合分数越大，即靶点间关联性越强。该网络中共包含431个节点和10 010条连线( P＜1.0 -16)，平均局部聚类系数为0.483，平均节点度值为46.5，且PPI富集 P值小于1.0 -16，说明葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用靶点之间富集作用显著。从 图 1可以看出，靶点蛋白激酶B(Akt)1、肿瘤蛋白p53(TP53)、IL-6、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)及血管内皮生长因子A(VEGFA)度值较大，分别为241、224、211、204、202，属于网络的核心靶点，提示这些靶点可能在葛花-枳椇子治疗ALI的过程中发挥枢纽作用。

图 1 .

图 1

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葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤的潜在作用靶点蛋白-蛋白相互作用网络

节点代表靶点，大小和颜色代表度值大小，节点越大且颜色由绿色过渡到红色对应度值越大；连线的颜色代表靶点间的结合分数(combined score)，线条颜色越深结合分数越大.

2.4. 葛花-枳椇子“药材-潜在活性成分-作用靶点”相互作用网络分析

构建葛花-枳椇子治疗ALI的“药材-潜在活性成分-作用靶点”网络模型见 图 2。该网络共包含455个节点(3味药材，21个化合物，431个作用靶点)和1383条连线。利用拓扑学参数对网络模型进行分析，即节点的度值和介数值越大代表该节点在网络中越重要。 表 1中列出了21个潜在活性成分的度值和介数值，其中化合物槲皮素度值最大，与201个靶点相连，介数值为0.3888；其次是山柰酚，与130个靶点相连，介数值为0.1328；然后是柚皮素，与101个靶点相连，介数值为0.1293。这些拥有较高度值和介数值的潜在活性成分可能是葛花-枳椇子治疗ALI的药效物质。此外，靶点前列腺素内过氧化物酶2(PTGS2)、雌激素受体2(ESR2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)也拥有较高的度值和介数值，度值分别为17、15、15，介数值分别为0.024 11、0.014 31、0.014 31。由此推断，这些靶点可能与葛花-枳椇子治疗ALI的药理作用密切相关。通过网络系统分析可知，每个化合物平均与64.62个靶点相关，每个靶点平均与3.15个化合物相关，提示葛花-枳椇子是以“多成分、多靶点”协同作用的机制发挥治疗ALI的药效作用。

图 2 .

图 2

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葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤“药材-潜在活性成分-作用靶点”相互作用网络

橘色节点代表药材；绿色节点代表枳椇子潜在活性成分；粉色节点代表葛花潜在活性成分；红色节点代表葛花、枳椇子共有的潜在活性成分；蓝色节点代表潜在作用靶点.

2.5. 潜在作用靶点富集分析结果

2.5.1. GO生物功能富集分析结果

GO富集分析共确定了1500个GO条目，限定 P＜0.05、FDR＜0.05，得到273个GO条目。其中，生物过程相关条目最多(186个)，主要涉及信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、药物应答等；其次是分子功能相关条目(52个)，主要涉及蛋白结合、ATP结合、酶结合等；最后是细胞组分相关条目(35个)，主要涉及质膜、胞浆、细胞质等。以该生物功能富集到的基因数排序，前20条富集结果见 图 3。结果可见，与葛花-枳椇子治疗ALI相关的关键靶标主要富集于质膜、细胞质基质、细胞质等部位及蛋白结合、ATP结合、信号转导等生物功能中。

图 3 .

图 3

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葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤前20条基因本体富集通路

橘色节点代表药材；绿色节点代表枳椇子潜在活性成分；粉色节点代表葛花潜在活性成分；红色节点代表葛花、枳椇子共有的潜在活性成分；蓝色节点代表潜在作用靶点.

2.5.2. KEGG代谢通路富集分析结果

KEGG代谢通路富集分析共获得147条代谢通路，限定 P＜0.05、FDR＜0.05，得到90条通路，并以该通路富集到的基因数排序，将前20条代谢通路及其相关信息利用OmicShare平台进行可视化处理，得气泡图( 图 4)。从图中可以看出，涉及基因数较多的代谢通路主要包括癌症通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖等。以上数据表明，葛花-枳椇子的潜在活性成分可能主要通过作用于上述代谢通路发挥治疗ALI的疗效。

图 4 .

图 4

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葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤前20条KEGG富集通路

PI3K-Akt:磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B; MAPK:丝裂原活化蛋白激酶; HTLV-Ⅰ：人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型; KEGG:京都基因与基因组百科全书; Richfactor:富集到的差异基因数占该通路基因总数的比例.

2.5.3. Reactome通路注释分析结果

对431个潜在作用靶点进行Reactome通路注释分析( 图 5)，限定 P＜0.05、FDR＜0.05，共获得362条通路，然后以该通路富集到的基因数排序，前20条Reactome通路见 表 2。 图 5中线条代表潜在作用靶点富集的Reactome通路，颜色随 P值增大由黄色渐变为棕色。结果显示，葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用靶点主要涉及信号转导、免疫系统、基因表达、基因转录途径、RNA聚合酶Ⅱ转录等多个Reactome通路。以上结果表明，葛花-枳椇子通过调控多个复杂的Reactome通路影响ALI。

图 5 .

图 5

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葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤的Reactome通路分析结果

PI3K-Akt:磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B; MAPK:丝裂原活化蛋白激酶; HTLV-Ⅰ：人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型; KEGG:京都基因与基因组百科全书; Richfactor:富集到的差异基因数占该通路基因总数的比例.

表表 2 葛花-枳椇子治疗酒精性肝损伤前20条Reactome通路

通路

名称

基因数

P值

错误发现率

R-HSA-162582

信号转导

246

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-168256

免疫系统

208

4.01 -14

4.81 -12

R-HSA-74160

基因表达

175

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-212436

基因转录途径

174

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-73857

RNA聚合酶Ⅱ转录

174

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-1280215

免疫系统中细胞因子的信号传导

156

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-1643685

疾病

136

1.77 -03

8.84 -03

R-HSA-449147

白细胞介素信号

124

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-556833

脂质代谢

91

4.50 -04

3.15 -03

R-HSA-168249

先天免疫系统

85

4.41 -04

3.09 -03

R-HSA-9006934

受体酪氨酸激酶信号转导

81

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-388396

G蛋白偶联受体下游信号

79

8.35 -03

3.12 -02

R-HSA-6785807

IL-4和IL-13信号转导

78

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-1266738

发育生物学

75

4.12 -03

1.65 -02

R-HSA-8953897

细胞对外界刺激的反应

65

4.22 -08

1.35 -06

R-HSA-109582

止血

64

1.28 -05

1.41 -04

R-HSA-2262752

细胞应激反应

64

3.75 -08

1.20 -06

R-HSA-9006931

核受体信号传递

62

1.11 -16

1.73 -14

R-HSA-1640170

细胞周期

60

5.46 -06

6.55 -05

R-HSA-5663202

生长因子受体和第二信使信号转导的疾病

57

1.62 -10

1.06 -08

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2.6. 分子对接分析

采用AutoDock Vina软件进行半柔性分子对接，将PPI网络中度值前3位的靶蛋白分别与21个潜在活性成分进行分子对接验证，结果见 表 3。结果显示，结合能最高的是-21.74 kJ/mol，最低的是-45.56 kJ/mol，平均结合能为-32.35 kJ/mol，说明葛花-枳椇子的潜在活性成分与3个核心靶点均能较好地结合。与Akt1结合最好的化合物是葛花苷，结合能为-45.56 kJ/mol，可以与Akt1的氨基酸残基ASN-54、ARG-273、GLU-17形成3个氢键( 图 6A)；与IL-6结合最好的化合物也是葛花苷，结合能为-32.19 kJ/mol，与IL-6的氨基酸残基TYR-101、GLN-153、THR-150可形成4个氢键( 图 6B)；与TP53结合最好的是化合物槲皮素和大豆苷元- 4, 7-二葡萄糖苷，结合能均为-33.02 kJ/mol，其中槲皮素与TP53的氨基酸残基ARG-196、ASP-186、ASN-200可以形成3个氢键( 图 6C)；而大豆苷元- 4, 7-二葡萄糖苷能够与TP53的氨基酸残基LYS-139、ASP-268、ASN-131、SER-269、TYR-126形成5个氢键( 图 6D)。综上所述，葛花-枳椇子的潜在活性成分与3个核心靶点均能较好地结合，进而发挥治疗ALI的药理作用。

表表 3 葛花-枳椇子核心化合物与靶蛋白AK1、TP53和IL-6的分子对接结果

MOL ID

化合物

结合能

Akt1

TP53

IL-6

MOL000098

槲皮素

-38.04

-33.02

-31.35

MOL000358

β-谷甾醇

-33.44

-28.01

-26.75

MOL000359

谷甾醇

-44.31

-28.01

-30.10

MOL000392

刺芒柄花素

-40.13

-28.42

-28.84

MOL000422

山柰酚

-38.46

-30.10

-30.93

MOL000449

豆甾醇

-33.44

-28.84

-29.68

MOL000468

8-甲雷杜辛

-39.29

-26.33

-28.42

MOL001749

邻苯二甲酸二辛酯

-32.60

-21.74

-24.24

MOL001792

甘草素

-35.53

-30.10

-28.01

MOL002140

川芎哚

-40.13

-31.77

-29.68

MOL002959

3′-甲氧基大豆苷元

-40.13

-30.10

-29.68

MOL003629

大豆苷元-4, 7-二葡萄糖苷

-43.05

-33.02

-30.93

MOL004328

柚皮素

-31.35

-29.26

-28.42

MOL004957

异芒柄花素

-39.29

-28.42

-28.84

MOL005916

尼泊尔鸢尾黄素

-38.46

-29.26

-26.75

MOL008034

美洲茶酸

-34.28

-31.77

-30.93

MOL008400

黄豆黄素

-39.71

-30.10

-31.35

MOL011791

葛花苷

-45.56

-30.10

-32.19

MOL011793

葛花亭

-37.20

-28.84

-28.42

MOL012976

香豆雌酚

-43.47

-28.84

-31.35

MOL013305

鹰嘴豆醇

-36.37

-30.51

-30.10
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Akt：蛋白激酶B；TP53：肿瘤蛋白p53.

图 6 .

图 6

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葛花-枳椇子潜在活性成分与核心靶点的分子对接分析

A：葛花苷与蛋白激酶B(Akt)1的分子对接模式；B：葛花苷与IL-6的分子对接模式；C：槲皮素与肿瘤蛋白p53(TP53)的分子对接模式；D：大豆苷元-4, 7-二葡萄糖苷与TP53的分子对接模式.黄色虚线代表化合物与靶蛋白的氨基酸残基所形成的氢键.

3. 讨论

WHO发布的2018年全球饮酒与健康报告指出，2005年到2016年中国人均酒精消费量由4.1 L上升到7.2 L，增幅高达76 % [ 16] 。ALI已成为危害我国人民身体健康的严重问题。临床上治疗ALI的药物有还原性谷胱甘肽、水飞蓟素、美他多辛、S-腺苷甲硫氨酸、糖皮质激素等，但疗效不佳且伴随诸多不良反应 [ 2, 17] 。中药复方不仅具有多成分、多靶点、多途径的优势，且不良反应小、安全性高，在抗炎、抗脂肪变性、抗肝纤维化、调节免疫系统等方面均能发挥良好的疗效 [ 18] 。因此，本研究采用网络药理学和分子对接技术，探索了葛花-枳椇子治疗ALI的可能作用机制。

本研究经过TCMSP数据库搜集和筛选后共获得了21个潜在活性成分，并将其与PPI中度值前3位的核心靶蛋白进行了分子对接验证。其中槲皮素、山柰酚等化合物相关的靶蛋白较多且与核心靶点均能较好地结合；同时，槲皮素与山柰酚均为黄酮类化合物，该类化合物都有较好的抗炎、抗氧化、保护肝组织等药理作用。众所周知，酒精主要在肝内代谢，当酒精摄入量较大时肝脏就会产生大量的活性氧自由基，引起肝细胞膜脂质过氧化，同时内毒素水平增加诱导NF-κB激活，产生大量的炎症介质和炎症级联放大效应，导致重要细胞器受损，引发肝细胞功能紊乱甚至造成肝细胞凋亡或坏死，最终影响肝功能并形成ALI [ 19- 20] 。槲皮素是一种强抗氧化剂、直接自由基清除剂，同时具有一定的抗炎作用 [ 21] 。研究表明，槲皮素能够显著抑制血浆NF-κB的激活和PI3K/Akt信号通路表达，降低TNF-α和IL-6释放，增加IL-10水平，减轻肝脏炎症反应并发挥抑制肝细胞凋亡的作用，有效改善ALI [ 22] 。此外，山柰酚是一种强有力的超氧化物清除剂，也是CYP2E1表达的底物和抑制剂，在体内外均具有抗炎、抗氧化和免疫调节等特性 [ 23] 。其不仅在一定程度上促进乙醛的清除，还能降低CYP2E1的活性和表达，从而导致活性氧生成减少，有效阻断酒精介导的脂质过氧化，增强抗氧化防御系统保护，达到良好的治疗效果 [ 24- 25] 。另外，分子对接结果显示核心靶点Akt1和IL-6与潜在活性成分均能较好地结合，其中Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在ALI发生、发展过程中发挥重要作用。Akt不但参与了细胞的生长和增殖，是细胞存活的信号和必要因素 [ 22] ，而且其信号所涉及的主要靶点Bax/Bcl-2和caspases在一定程度上既能反映细胞凋亡的程度也能体现脂质过氧化水平 [ 26- 27] 。同时，Akt1也能够抑制肝细胞和肝星状细胞的纤维生成 [ 28] ，有利于防治肝纤维化的发展。此外，IL-6是一种急性和慢性炎症的主要调节因子，是造成细胞因子风暴的典型促炎因子，其跨膜信号转导主要包括经典信号传导通路和反式信号传导通路，其抗炎、再生及肝脏的急性期抗菌活性均由经典信号通路介导 [ 29] 。且肝细胞的坏死程度与IL-6密切相关，IL-6的高表达可反应肝衰竭的严重程度 [ 30] 。而 TP53 是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因之一，能够诱导细胞周期停滞、DNA修复、细胞衰老和凋亡，避免细胞进一步恶性发展 [ 31] 。 TP53 突变会导致其肿瘤抑制功能的丧失和肝细胞不受控制的增殖，从而引发肝癌 [ 31] 。因此，这3个核心靶点在ALI的不同阶段中均发挥着重要的作用，当槲皮素、山柰酚等潜在活性成分与Akt1、IL-6、TP53等核心靶点结合时，有望通过发挥良好的抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡和肝纤维生成、抑制肝癌的发生等药理作用达到有效预防和治疗ALI的效果。

靶点富集结果显示，葛花-枳椇子可能主要通过蛋白结合、信号转导、免疫系统等生物功能及PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路等炎症性相关代谢通路发挥治疗ALI的作用。其中KEGG所涉及的主要炎症通路PI3K/Akt信号通路在治疗ALI过程中可能发挥着关键作用。邓进巍等 [ 32] 报道，PI3K/Akt通路在肝星状细胞活化、肝脏细胞外基质形成、胶原合成及肝纤维化的发生发展过程中具有重要意义。PI3K作为重要的第二信使，被激活后可使其下游的Akt磷酸化，并进一步调节下游激酶使肝星状细胞活化，促使肝脏纤维化发生进展性加重 [ 33] 。另外，肝纤维化的产生是细胞外基质合成/降解失衡的过程，PI3K/Akt信号通路还可影响与细胞外基质降解相关的主要基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子的平衡，其中基质金属蛋白酶具有降解胶原和细胞外基质的作用，而金属蛋白酶组织抑制因子可抑制基质金属蛋白酶的作用。通过干预PI3K/Akt信号通路可恢复基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子平衡，改善肝脏纤维化程度 [ 34] 。此外，葛花-枳椇子治疗ALI所涉及的另一条重要的炎症性通路是TNF信号通路，该通路的关键靶点为TNF-α。TNF-α是一种强效促炎细胞因子，能促使NF-κB的活化，通过不同的方式参与脂质过氧化与氧化应激，诱发肝脏炎症反应，还能诱导其他炎症因子的释放，导致体内炎症反应失衡 [ 35] 。高浓度的TNF-α还可减少外周组织脂肪的分解，并促进肝细胞中三酰甘油的合成及聚集，增加肝内游离脂肪酸，加强TNF-α等细胞因子的毒性，进而诱发线粒体功能不全以致肝细胞损伤 [ 36] 。因此，葛花-枳椇子可通过作用于以上炎症性相关代谢通路等发挥较好的抗ALI药理作用。

综上所述，本研究借助网络药理学和分子对接技术探究了葛花-枳椇子治疗ALI的可能作用机制，从分子层面初步阐明了葛花-枳椇子治疗ALI的潜在作用机制，有望为ALI的防治提供了新的思路与依据。

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