Abstract
高升降温速率是实现细胞无冰冻融的关键技术途径。本研究研制了一套基于蓝宝石的超快速固体表面冷冻-激光复温冻融可视化系统，开展了不同冷冻保护剂组分和体积以及不同激光能量下的液滴冻融实验研究。结果表明：冷冻操作时该系统可实现1 μL体积混合低温保护剂［1.5 mol/L丙二醇（PG）+ 1.5 mol/L乙二醇（EG）+ 0.5 mol/L海藻糖（TRE）］的降温速率高达9.2×103 ℃/min，且1～8 μL容积范围的液滴均可实现玻璃化冷冻；经过比对多种冷冻保护剂配比浓度，等比例混合渗透性保护剂和海藻糖的组合具有最好的玻璃化冷冻效果和更均匀的结晶特性。在复温操作时，首次测得400～1 200 W激光功率作用下含有金纳米颗粒的玻璃态液滴的升温曲线，速率高达106 ℃/min量级。依据不同功率复温过程的液滴图像，明确了实现微米级分辨率无冰复温的激光功率范围为1 400～1 600 W。本文工作同步实现了液滴的超高速升降温、瞬态可视化观察和温度测量，为判断液滴无冰冻融提供了技术手段，有利于促进生物细胞和组织超快速冻融技术的发展。
Keywords: 细胞低温保存, 玻璃化, 固体表面冷冻, 激光复温
Abstract
Ultra-rapid cooling and rewarming rate is a critical technical approach to achieve ice-free cells during the freezing and melting process. A set of ultra-rapid solid surface freeze-thaw visualization system was developed based on a sapphire flim, and experiments on droplet freeze-thaw were carried out under different cryoprotectant components, volumes and laser energies. The results showed that the cooling rate of 1 μL mixed cryoprotectant [1.5 mol/L propylene glycol (PG) + 1.5 mol/L ethylene glycol (EG) + 0.5 mol/L trehalose (TRE)] could be 9.2×103 °C/min. The volume range of 1–8 μL droplets could be vitrified. After comparing the proportions of multiple cryoprotectants, the combination of equal proportion mixed permeability protectant and trehalose had the best vitrification freezing effect and more uniform crystallization characteristics. During the rewarming operation, the heating curve of glassy droplets containing gold nanoparticles was measured for the first time under the action of 400–1 200 W laser power, and the rewarming rate was up to the order of 106 °C/min. According to the droplet images of different power rewarming processes, the laser power range for ice-free rewarming with micron-level resolution was clarified to be 1 400–1 600 W. The work of this paper simultaneously realizes the ultra-high-speed temperature ramp-up, transient visual observation and temperature measurement of droplets, providing technical means for judging the ice free droplets during the freeze-thaw process. It is conducive to promoting the development of ultra-rapid freeze-thaw technology for biological cells and tissues.
Keywords: Cell cryopreservation, Vitrification, Solid surface vitrification, Laser warming
0. 引言
生物材料的低温冻融技术主要涉及冷冻、保存和复温三个过程。冷冻过程通过降温方式抑制处于冷冻保护剂（cryoprotectant agent, CPA）溶液中的细胞代谢活动，如在–196 ℃液氮温度下生物材料内部化学反应几乎停滞，进而让生物材料在保存过程中实现延时的保存。目前冷冻过程主要采用玻璃化快速冷冻的方式[1]，通过高浓度CPA以及快速的非平衡冷却将生物样品从液态直接转化为玻璃态。然而高浓度的CPA意味着较高的生物毒性[2-3]。与采用阶梯式降温的传统慢速冷冻相比，玻璃化冷冻避免了冷冻过程中冰晶的产生，可最小化乃至消除低温损伤[4-5]。复温是指在需要的时候对已经冷冻好的生物样本进行复温解冻，使之恢复到正常生理状态的技术。目前研究人员通过降低样品体积以及应用多物理场方式，进一步降低了复温过程中重结晶带来的细胞损伤。冻融技术的出现，消除了获取和使用生物材料之间的时间、空间差距[6-7]，缓解了生物样本在辅助生殖、干细胞治疗、再生医学等生物医学应用中的供需矛盾[8]。
细胞低温冻融的核心目标之一在于先最小化生物样本再玻璃化冷冻和复温，降低低温损伤，确保其活性和生理功能正常。而以往的研究表明，升降温速率是影响冰晶生长的主要因素，因此广大研究者致力于通过不同的冷冻和复温策略来提高升降温速率，并希望结合可视化和测温手段探究冻融过程中的结晶规律。目前，采用最小体积法强化冷冻速率的方式仍无法满足临床医学大体积样本的冷冻需求，而采用冷冻载体法则使可视化和测温变得尤为困难[9-10]；此外，传统恒温水浴复温方式无法达到无冰冻融所需的临界升温速率。
本文基于蓝宝石固体表面接触式冷冻和激光复温组合方式，搭建了具有高变温速率、微尺度观察及测温能力的低温冻融可视化系统，以不同组分的冷冻保护剂液滴为对象，在确保升降温速率能够满足无冰冻融要求的同时，实现冻融全过程的可视化观测和温度测量，并探究了实现无冰冻融的外部影响因素，提高了液滴无冰冻融的综合判断方法的可靠性，为深入研究采用表面冷冻法和激光复温法的液滴提供了新的技术手段。
1. 冻融可视化系统及方案
1.1. 固体表面冷冻-激光复温可视化系统设计
根据上述研究目标，设计并搭建的系统包含以蓝宝石载物台为核心的多个子系统，其构成如图1所示。
图 1.
Schematic design drawing of visualization system based on solid surface vitrification and laser rewarming
基于固体表面冷冻和激光复温冻融可视化系统
a. 整体可视化冻融系统；b. 热电偶布置示意；c. 蓝宝石片及液滴
a. integrated visual freeze-thaw system; b. schematic arrangement of thermocouple; c. sapphire film and droplets
如图1a所示，整套冻融平台置于光学平台上以减小轻微震动对可视化观察的影响，高频数据采集仪（单通道采样频率为50 kHz）实现对液滴在微秒分辨率下的温度记录，高速相机结合氙灯冷光源实现对液滴在微米空间分辨率和毫秒级时间分辨率下的状态记录。滑动丝杆可通过转动和升降二个自由度，将蓝宝石载物台在加热工位（激光加热）和冷冻工位（液氮杜瓦冷却）之间互相切换。冷冻工位下，如图1b～c所示，载物台由10 mm直径、0.2 mm厚的蓝宝石片制成，蓝宝石片装载在聚四氟乙烯碗具中间，与液氮杜瓦中的液氮直接接触，从而预冷蓝宝石片至77 K，再利用蓝宝石片在低温下的高热导率特性实现对样品液滴的玻璃化冷冻。同时，线径50 μm的热电偶置于待滴液处的中部区，将测温探头布置于液滴纵向中部位置，液滴中部的温度近似为液滴的平均温度[11]。热电偶的测温头直径50 μm，将测温头近似为半径25 μm的球体，其体积为 
= 65 449.8 μm3，约占液滴体积的0.02%。为了减少热电偶对液滴的影响，尽量仅使测温探头头部和极少部分的热电偶引线接触液滴，保守估计测温头和热电偶丝的总体积约占1 μL液滴体积的0.1%以内。加热工位下，系统采用2 000 W单模连续光纤激光器，输出的高斯激光波长为（1 064±10）nm。由于蓝宝石玻璃本身的高透光性（约90%），样品台反射给液滴的激光能量可忽略不计，确保玻璃化液滴的受热均匀性和升温可控性，从而实现系统的冷冻复温一体化操作。同时，冷冻保护溶液以及生物细胞的主要成分是水，对红外激光的吸收率低，对1 064 nm激光吸收率仅为3.5%[12]。为了实现玻璃化液滴在激光复温过程中均匀且快速的受热，在溶液中均匀添加长67 nm、直径10 nm的高生物相容性的金纳米颗粒（gold nanorods，GNR），具有高稳定性的金纳米颗粒在冷冻前均匀分散于液滴内部且无沉降，可作为空间内热源在液滴内部均匀传热。由于本文旨在关注冻融瞬间液滴的温度和样态变化，时间尺度极短，均在10 s内，因此采用开放式冻融系统时，外界环境内的结霜对本文所要研究的液滴冷冻和复温瞬间的影响较小，且便于高速相机更清晰无阻挡地捕捉到样品的冻融过程。更多本系统涉及的设备信息如表1所示。
表 1. Details and uncertainties of the main devices.
主要系统设备及其不确定度
| 设备 | 型号 | 误差范围 |
| 移液器 | Joanlab M20 | 精度误差：± 3% μL；重复误差：± 2% μL |
| 载物台 | 非标定制 | 尺寸误差：± 0.1 mm |
| 高精度电子秤 | 8028-series | 称量误差：± 0.001 g |
| 热电偶 | COCO-002 | 测量误差：± 0.1 ℃ |
| 激光器 | SMATLas 4S 2 000W单模连续光纤激光器 | 光束质量M2 < 1.3；功率稳定性 < ± 2% W |
| 数据采集仪 | Keysight DAQ970A | 测量误差：± 0.1 ℃ |
1.2. 冻融实验条件及判定依据
基于蓝宝石玻璃载物台的固体表面冷冻及纳米激光复温策略，以玻璃化冷冻和无冰复温为目标，通过改变液滴体积、保护剂组分和激光能量，探究不同因素对液滴冻融状态的影响，并确定实现无冰冻融的外部条件。
1.2.1. 冷冻保护剂
冷冻保护液由GNR溶液、渗透性CPA和海藻糖组成。GNR溶液采用安比奇生物BR-10-1064号产品，浓度为3.63 × 1011 NPs/mL。此外，考虑到细胞毒性问题[13]，冷冻保护液中渗透性CPA采用毒性较小的丙二醇（propylene glycol，PG）和乙二醇（ethylene glycol，EG）组合液，同时纯度 ≥ 98.5%的α-海藻糖（trehalose，TRE）作为非渗透性CPA。配比标准采用物质的量浓度（mol/L），TRE浓度固定为0.5 mol/L，GNR溶液的体积占比固定为溶液总体积的25%。具体组分配比以5 mL的溶液总体积为例，如表2所示。
表 2. Solution fraction at different concentrations.
不同浓度下的溶液组分配比
| 组别 | 浓度参数 | EG/mL | PG/mL | GNR溶液/mL | TRE/g | 蒸馏水/mL |
| GNR | 25% | / | / | 1.25 | / | 3.750 |
| 2M PG | 2 mol/L PG | / | 0.58 | 1.25 | / | 3.170 |
| 2M 混合 | 1 mol/L PG + 1 mol/L EG | 0.28 | 0.29 | 1.25 | / | 3.180 |
| 2M + 0.5 | 1 mol/L PG + 1 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE | 0.28 | 0.29 | 1.25 | 0.946 | 2.230 |
| 3M + 0.5 | 1.5 mol/L PG + 1.5 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE | 0.42 | 0.44 | 1.25 | 0.946 | 1.944 |
| 4M + 0.5 | 2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE | 0.56 | 0.58 | 1.25 | 0.946 | 1.660 |
1.2.2. 无冰冻融判定方法
通过可视化图像与温度曲线综合给出无冰冻融的判定标准。在可视化图像方面，冷冻效果主要由高时间和高空间分辨率的高速相机捕捉稳定后的状态来实现。可视化冰晶的观测原理是液滴内部产生的结晶现象将导致局部折射率发生较大变化。Zhan等[14]通过拉曼散射和X光衍射等手段证明了微米级空间分辨率的可视化设备观测是判断是否实现玻璃化冷冻的高效方法，即视野中未捕捉到明显的白色结晶现象可认为玻璃化冷冻成功。通过此判别方式，本文在冷冻过程中获得的冷冻状态可分为如图2所示的三类：完全结晶、部分结晶和玻璃化。完全结晶液滴的固液界面至液滴顶部全部被白色冰晶覆盖，液滴与蓝宝石玻璃表面发生粘连，无法完整分离冷冻液滴。冷冻全过程肉眼和图像处理软件都未捕捉到白色结晶，且液滴保持清澈透明，可以判定为成功实现玻璃化冷冻。在玻璃化和完全结晶状态之间，存在一种局部玻璃化、局部结晶的过渡状态，玻璃化区域一般处于液滴下方即传热路径更小而降温速率更高的部分，结晶位置则从液滴顶部区域开始生成，随后扩散至外部。
图 2.
Three cooling states of liquid droplets based on solid surface vitrification method
液滴基于固体表面冷冻的三种冷冻状态
温度曲线通过极细热电偶和高频数据采集仪获得。对2 μL的液滴在不同冷冻效果下的降温曲线如图3所示，三种不同冷冻状态下的降温在速率和平滑性上有较大的不同：液滴玻璃化的程度越高，相比于结晶态的降温速率就越慢，在150～250 K左右的危险温区内，完全结晶、局部玻璃化和玻璃化的降温速率分别为7.8 × 103、5.3 × 103、3.3 × 103 ℃/min。对于发生结晶的冷冻过程而言，其曲线会由于溶液热力学参数的剧变而出现明显的降温台阶，而玻璃化程度越高，其降温曲线就越平滑。由此可以将可视化方法结合温度曲线的平滑性综合判定被测液滴的玻璃化程度。
图 3.
Cooling curve of 2 μL droplet under different freezing effects
2 μL液滴在不同冷冻效果下的降温曲线
2. 结果分析
基于上述实验系统和实验方案，开展了不同组分、不同体积和不同激光能量下的液滴冻融实验，分析结晶现象，并探究实现无冰冻融的外部条件。
2.1. 玻璃化冷冻影响因素
2.1.1. 溶液组分对玻璃化冷冻的影响
为了探究不同组分对液滴玻璃化冷冻的影响以及系统的极限冷冻性能，对无冷冻保护液的GNR溶液、2M PG、2M混合、2M + 0.5、3M + 0.5和4M + 0.5六组工况进行独立实验，液滴体积固定为2 μL，当溶液达到平衡状态（10 s）后的可视化图像如图4所示。
图 4.
Final freezing state of 2 μL droplet under different protectant components
2 μL液滴在不同保护剂组分下的最终冷冻状态
当溶液未添加冷冻保护剂时，只含有GNR的液滴呈现出完全结晶现象，而随着单组分冷冻保护剂PG的加入，液滴呈现出不同的结晶过程，并在最终达到平衡状态时呈现底部玻璃化而上半部分结晶的分化现象，如2M PG组所示。将两种渗透性CPA混合加入后，局部结晶的冷冻状态被进一步强化，结晶起始位置发生在2M混合组的液滴腰部。在2M+0.5组中，随着非渗透性保护剂海藻糖的加入，液滴的玻璃化区域进一步扩大，液滴的最终结晶程度大幅降低，结晶状态从区域性的晶态分布转变至上腰部区域的点状分布。该组实验证明了非渗透性CPA海藻糖结合一定浓度的混合渗透性CPA组合可以有效提高玻璃化冷冻效果。其原因在于海藻糖和混合CPA组合都能够提高溶液整体的玻璃转变温度，进一步降低溶液的结晶温区ΔTcrystallization范围，减少冻融过程中的结晶现象。在总浓度达到3M+0.5后液滴实现完全玻璃化冷冻，此时继续增加渗透性保护剂的浓度至4M+0.5，液滴仍然呈现完全玻璃化状态。
不同组分溶液结晶方式不同。添加单组分渗透性CPA后的液滴结晶如图5a所示，呈现点状随机分布、自下而上放射性生长的特点。在0.2 s左右，液滴底部边缘出现随机分布的冰晶成核点，随后成核点的数量沿液滴边缘自下而上逐渐增多，冰晶的体积也呈现圆形、放射状的增长趋势。0.4 s左右时，固液接触面附近大部分被冰晶覆盖，0.5 s时液滴的大部分区域都已经结晶，结晶区域逐渐扩散至液滴顶部，并在1.0 s左右完成结晶过程。与GNR溶液的最终结晶状态相比，2M PG液滴在固液接触面附近仍存在局部的玻璃化区域，且整体结晶并不均匀，呈现锯齿状的边缘形态。
图 5.
Crystallization process of droplets
液滴结晶过程图
a. 组分为2M PG的液滴; b. 组分为2M混合的液滴
a. concentration of 2M PG; b. concentration of 2M mixture
在混合CPA工况下，尽管总浓度未发生变化，但液滴的结晶过程和最终结晶状态都发生了较大变化。如图5b所示，在混合CPA的作用下，玻璃化与结晶的分界点为液滴腰部的某一平面位置，随后冰晶以该界面为出发点，沿液滴外缘侧均匀向上生长至顶部，最后的结晶状态表现为具有清晰的玻璃态与晶态交界面，且晶态分布较为均匀规律。
对于2 μL体积的液滴而言，当组分浓度为3M + 0.5时不再观测到冰晶，即认为实现玻璃化冷冻，随着溶液中渗透性CPA浓度的进一步提高，4M + 0.5工况同样如此。因此可以认为本系统能够实现低浓度（≤ 4 mol/L）下液滴的快速玻璃化冷冻过程。
2.1.2. 液滴体积对玻璃化冷冻特性的影响
为了进一步探究冷冻过程中的结晶状态以及系统的冷冻性能，在溶液组分浓度确定的基础上进一步开展了不同体积下的玻璃化冷冻实验。受限于单次可滴落液滴的体积限制，针对3M + 0.5之后的每种浓度工况分别进行了1、2、4、6、8 μL体积的液滴玻璃化冷冻实验.
不同体积的液滴最终结晶状态如图6所示。液滴与预冷表面的接触角随着体积的增大而减小，且1～6 μL体积都可实现玻璃化冷冻。当液滴体积增大至8 μL时，仍然没有观测到明显的晶态区域，但此时液滴顶部区域以及整体的透光度略微下降，认为是处于即将结晶的状态。
图 6.
Final crystallization state of droplets with different volumes at 3M+0.5 concentration
3M+0.5浓度下不同体积液滴的最终结晶状态
3M + 0.5浓度下不同体积液滴的降温曲线和降温速率如图7所示。由于液滴在1～8 μL都可以实现较高程度的玻璃化，因此液滴的初始温度变化较为迅速。随着液滴体积增大，整体的降温速率会呈现如图7b所示的指数下降的趋势。1 μL时降温速率可高达9.2 × 103 ℃/min，但当体积达到8 μL后，降温速率会降低至1.1 × 103 ℃/min。需要注意的是，尽管降温速度随着体积的增加而大幅下降，但在3M + 0.5的浓度下仍然可以实现最大6 μL液滴的成像清澈透明。
图 7.
Cooling curve and cooling rate of different volume droplets at 3M+0.5 concentration
3M+0.5浓度下不同体积液滴的降温曲线和降温速率图
a. 降温曲线图；b. 降温速率点线图
a. temperature varies with the cooling time; b. cooling rate varies with volumes of droplets
表3总结了不同保护剂浓度配比及液滴体积组合的结晶和非结晶冷冻情况，为了更清晰地展现玻璃化状态，表中将局部结晶和完全结晶均归类为结晶状态“I（Icing）”，玻璃化状态归类为非结晶状态“V（Vitrification）”。结果表明不同浓度液滴的冷冻过程均会受体积的影响，且随着体积的增大而更难实现玻璃化。在2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE的保护剂浓度下，本蓝宝石片表面冷冻法能实现的最高玻璃化体积为8 μL。
表 3. Vitrification state at different droplet volumes and component concentrations.
不同液滴体积和组分浓度下的冷冻情况
| 浓度组别 | 1 μL | 2 μL | 4 μL | 6 μL | 8 μL |
| GNR | I | I | I | I | I |
| 2M PG | I | I | I | I | I |
| 2M混合 | I | I | I | I | I |
| 2M + 0.5 | V | I | I | I | I |
| 3M + 0.5 | V | V | V | V | I |
| 4M + 0.5 | V | V | V | V | V |
2.2. 激光复温影响因素分析
在确保液滴具有较高玻璃化程度的前提下，获得了不同激光功率照射10 ms后的液滴复温状态图，如图8所示。
图 8.
Droplet rewarming state diagram under different laser power
不同激光功率下的液滴复温状态图
改变激光能量输入，液滴的最终复温状态会发生较大变化，除理想情况下的无冰复温外，还有对流结晶、加热不充分以及过度沸腾状态。在不注入额外激光能量时，液滴仅通过对流方式与常温空气进行换热，此时液滴表面先出现由空气中水气凝结而成的颗粒状冰晶，随后随着主体温度的升高，内部结晶程度也会逐渐增加直至整体呈现白色的晶态球形；当激光注入功率在1 400～1 600 W范围内时，液滴周围会产生可观测到的汽化烟雾现象，由于复温位置的切换而下降的透明度也将回升至液态时的状态，此时玻璃态液滴将升温至熔化温度Tm以上并重新变为液态；当激光注入功率小于1 400 W时，液滴内部主体区域会发生明显的重结晶现象，即由于加热不充分而使终温落在了结晶温区之内并发生内部结晶；当激光注入功率大于1 600 W时，液滴过热，表现为其内部瞬时产生大量气泡，并熔化为接触角极小的液体状态。
为了进一步获取复温过程中液滴的实际升温情况，利用热容极小的极细热电偶（50 μm）测得了中低激光功率下（400～1 200 W）的液滴升温曲线，如图9a所示。激光功率的增加将导致其复温结束后液滴终温的同步上升，1 200 W时终温将升至220 K，液滴将处于加热不充分的状态。如图9b所示，液滴的升温速率与激光功率呈现较好的线性关系，且在400～1 200 W的功率范围内升温速率都高于106 ℃/min数量级，比冷冻时的降温速率高出2～3个数量级。根据临界速率理论[15-18]，复温速率比相应的冷冻速率高2～3个数量级即可近似认为实现了无重结晶现象的无冰复温过程。然而，在激光功率为1 200 W时的成像过程显示，液滴的局部加热不充分仍为冰晶。因此，不可简单地将测温过程作为无重结晶无冰复温的单一判定依据。激光复温过程较为复杂，本系统将成像和测温耦合可提高判定被冷冻液滴激光复温的有效性。
图 9.
Warming curve and rate diagram of droplet under different laser power
不同激光功率下的液滴升温特性
a. 不同激光功率下的液滴升温曲线；b. 不同激光功率下的液滴升温速率
a. temperature varies with laser energy; b. rewarming rate varies with laser energy
3. 结论
本文以细胞冻融的实际临床应用为出发点，研制了基于固体表面冷冻和激光复温方法的细胞冻融可视化系统，并利用该系统开展了不同组分、不同体积保护剂和不同激光能量下的液滴冻融实验，得到了液滴的结晶特性、无冰冻融的判定方法以及实现无冰冻融的外部条件，可为相关研究提供一种新的工具。得到的主要结论如下：
（1）从可视化观测和温度曲线两个维度将液滴的冷冻效果分为完全结晶、局部结晶和玻璃态三个状态。
（2）在玻璃化冷冻阶段，本系统可实现体积为1 μL液滴9.2×103 ℃/min的降温速率（1.5 mol/L PG + 1.5 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE）；实现最低玻璃化冷冻保护剂浓度为1 mol/L PG + 1 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE；当低温保护剂为2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE时，本系统单次最大玻璃化冷冻体积为8 μL。
（3）在溶液组分方面，混合渗透性CPA和海藻糖的组合在玻璃化冷冻效果上最佳，且与单组分渗透性CPA的随机成核方式相比，其冰晶成核点分布在液滴腰部位置并向上均匀生长。
（4）在激光复温阶段，确定了1 400～1 600 W为可以实现无冰复温的激光功率范围，并利用极细热电偶和数据分析手段首次捕捉到了玻璃态液滴在激光复温过程中约为106 ℃/min数量级（高于水浴复温2～3个数量级）的升温速率以及与激光功率的线性关系。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：本文全体作者分工明确，朱文欣负责实验、数据分析及写作，潘平安负责实验台搭建和实验，黄永华负责实验规划和稿件审阅，陈威负责复温方法可行性分析，韩厦负责部分数据分析，李铮负责冷冻流程优化，程锦生负责冷冻设备技术支持。
Funding Statement
国家重点研发计划（2022YFC2703000）；上海市科委创新行动计划（20S31903400）；上海交通大学医工交叉研究基金（YG2021QN86）
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