血浆游离DNA Septin 9基因甲基化检测方法

Abstract

Objective

To explore the correlation between cytosine-phosphoric-guanylic (CpG) site of Septin 9 gene and colorectal cancer, and to develop a real-time PCR detection system in plasma in patients with colorectal cancer.

Methods

The methylation of training samples was detected by high-throughput sequencing technology, and the sites highly consistent with the clinical information of colorectal cancer were identified. Then the detection system of real-time PCR was designed to analyze the consistency of plasma and tissue based on methylationa sensitive enzyme digestion. Finally, 100 clinical trials were conducted to evaluate the performance of the detection system with the methylation sensitive enzyme digestion-real-time PCR.

Results

The highly consistent sites, which were selected by high-throughput sequencing from 71 training set samples, was the 38th CpG. Based on the detection region, the screened methylation sensitive enzymes were BstU1, HhaI and HinP1I. The limit for the detection of methylation sensitive enzyme digestion-real-time PCR was 0.5%, and the Ct value was 38.5. The sensitivity was 87.27%, the specificity was 91.49%, the positive predictive value was 92.31%, and the negative predictive value was 86.00%.

Conclusion

The 38th CpG site of Septin 9 detected by the detection system of methylation sensitive enzyme digestion-real-time PCR can highly predict the occurrence of colorectal cancer with great clinical application value.

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，全球每年新发病例数约为120万，年病死人数超过60万。发病率仅次于肺癌和乳腺癌，位居恶性肿瘤的第3位，病死率居第4位，近年来其发病率和病死率呈逐年上升的趋势^[1-2]。WHO的统计数据表明：结直肠癌患者的5年生存率在北美国家约为60%，而我国仅有32%。我国在CRC的诊断、治疗水平上，与发达国家相比还存在较大的差距^[2-3]。研究^[4-5]显示：5年生存率与诊断时疾病的严重程度具有明显的相关性，进展期患者的5年生存率不到10%，而早期诊断的CRC患者的5年生存率则可达90%以上。因此，早发现、早诊断、早治疗对于提高CRC的治疗效果具有重大的意义。

DNA甲基化是基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达^[6]。在哺乳动物中，DNA的甲基化仅发生于胞嘧啶-磷酸-鸟苷酸(cytosine-phosphoric-guanylic，CpG)岛(CpG islands，CGI)的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的作用下使CpG二核甘酸5'端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶，这种DNA修饰方式并未改变基因序列，但它可以调控基因的表达。在人类几乎所有类型的癌症中，都存在相关基因的异常甲基化^[7]。

Septin蛋白是一类具有鸟苷三磷酸激酶(GTPase)活性的蛋白家族，在人体内参与了一系列的重要生理过程，如细胞内物质运输、细胞分裂和细胞凋亡等^[8]。人体内编码septin蛋白的基因共有13种，其中Septin 9基因位于第17号染色体的17q25位置，全长219 kb，一共有18种剪接产物，可以编码15种多肽。这些变异剪接体的分布具有组织特异性^[9-11]。最近的研究^[12]结果显示：Septin 9基因的甲基化(尤其是位于Septin 9基因V2剪接体启动子区CpG岛的甲基化)与结直肠癌的发生和发展密切相关。它可以作为结直肠癌早期诊断的一个特异性分子标志。因此，检测Septin 9基因的甲基化状态，对结直肠癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。目前研究DNA甲基化的方法主要有：1)甲基化敏感性内切酶法；2)重亚硫酸盐修饰法；3)特异性识别甲基化抗体分析法；4)质谱或色谱分析法等。其中重亚硫酸盐修饰法是目前应用最为广泛的CpG甲基化检测方法。该方法采用Na₂S₂O₅处理样本DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的保持不变；经过PCR扩增后，U转变为胸腺嘧啶(T)，而甲基化的C转变为C，从而使基因组上的甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检测目标位点上的C/T状态，可以确定是否存在基因的甲基化^[11]。

从CRC的自然病程发展来看，早期发现肿瘤是影响CRC总体预后最重要的因素。早期CRC的5年生存率可达90%以上，因此CRC高危个体的识别和早期诊断显得尤其重要^[6]。研究^[7]表明DNA甲基化与肿瘤的发生关系密切。在散发性CRC中，甲基化是肿瘤发生的早期分子事件。近年有研究^[3]选用相关基因DNA甲基化作为检测CRC的分子标志物。尤其是外周血DNA的检测^[4-5]，既可以拥有比大便潜血试验(fecal occult blood test，FOBT)高的敏感度，又可以避免电子肠镜检查的不适，提高人群依从性，这不但有重要的临床诊断意义，而且在大规模人群筛查中有广阔的应用前景。在生物医学研究中，甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)和实时定量甲基化特异性PCR的应用最广^[9]。

本研究主要采用第二代测序技术研究不同分期CRC样本与Septin 9基因V2剪接体启动子区CpG岛中CpG位点的相关性，筛选高度相关性的CpG位点进行甲基化敏感性酶分析，通过CRC患者组织和血浆甲基化修饰的一致性建立方法学，从而开发和评估甲基化敏感性酶切法-real-time PCR体系的性能。

1. 资料与方法

1.1. 一般资料

收集2017年5月至2018年7月在湖南省肿瘤医院结直肠外科接受手术的48例CRC患者的组织和23例正常人组织(结肠镜确诊无结肠癌，为正常样本)及对应的10 mL外周血样本作为DNA提取和纯化的样本。训练组包括48例CRC组织样本(其中临床分期T1/T2样本偏多)和23正常人组织样本(结肠镜确诊无结肠癌，为正常样本)及对应的10 mL外周血样本，另取53例CRC组织样本和47例正常人组织样本纳入测试组(表1)。组织、外周血的收集和使用经湖南省肿瘤医院医学伦理委员会批准，并获得患者知情同意。所有患者术前均未接受放射治疗和化学药物治疗。取新鲜的CRC组织及正常人组织保存于含DNA稳定试剂的保存管中，在常温条件下运输至实验室，置于-20 ℃储存；10 mL外周血在常温条件下运输至实验室，立即于4 ℃离心(1 600 g，10 min)，吸取上清至新的10 mL离心管中，再于4 ℃离心(16 000 g， 10 min)，取上清血浆，保存至-80 ℃备用。CRC患者的分期均采用国际抗癌联盟发布的第8版恶性肿瘤的TNM分期标准。

表1.

临床样本特征表

Table 1 Character of training and test samples

分组	分期	n	性别		年龄/岁
			男	女	<50	50~59	60~69
合计		100	55	43	32	38	30
训练组
CRC	T1N0M0	2	1	1	0	0	2
	T2	11	4	7	2	3	4
	T3	18	11	7	6	3	8
	T4	17	11	6	5	6	5
正常样本	无	23	11	12	9	6	5
合计		71	38	33	22	18	24
测试组
CRC	T1N0M0	14	5	7	3	10	1
	T2	18	11	7	3	6	9
	T3	12	4	8	0	4	8
	T4	9	6	3	1	5	3
正常样本	无	47	29	18	25	13	9

1.2. 仪器和试剂

人CRC细胞系HCT116和正常结肠上皮细胞系NCM460购自中南大学湘雅医学院细胞库。DMEM培养基、RPMI 1640培养基和胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；引物探针包括Septin 9-bis-P5-F、Septin 9-bis-P7-R、Septin 9-M-F、Septin 9-M-R、Septin 9-M-FAM、ACTB-M-F、ACTB-M-R、ACTB-M-VIC、GAPDH-M-F、GAPDH-M-R、GAPDH- M-HEX，均由上海生工生物工程股份有限公司合成(其中P5和P7代表是否含有P5/P7序列，F和R分别代表正向引物和反向引物，FAM、VIC、HEX代表PCR中通路参数设置)；甲基化转化试剂盒(型号为EZ DNA Methylation-Lightning^TM Kit)购自美国Zymo研究公司；甲基化CpG敏感酶BstU1、HhaI、HinP1I购自美国New England Biolabs公司；Septin 9甲基化检测PCR扩增酶购自美国Kapa Biosystems公司，反应液AmpliTaq Gold^TM 360 Master Mix购自美国Thermo Fisher Scientific公司；组织/细胞/全血DNA提取试剂盒和血浆游离DNA购自北京天根生化科技有限公司；测序委托北京诺禾致源公司进行上机测序。

1.3. 方法

1.3.1. Septin 9甲基化位点的筛选

根据相关研究^[5]表明Septin9 v2 转录本启动子第3个CpG岛与CRC发生和发展密切相关。通过加州大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz，UCSC)数据库，以智人(homo sapiens)为搜索源，参考hg19版本，搜索Septin 9基因，查找转录本2，在UCSC数据库窗口选项中显示CpG岛，下载相应的序列，序列如下：TGCGAGACAGGGAGGCC-GGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGGAG-GCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGG-AGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCCATTCATT-CAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGG-CGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCG-GCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCG-CCGGG-GGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCG³³CG³⁴-CG³⁵AC-CCG³⁶CTGCCCACCAGCCATCATGTCG³⁷G-ACCCC-G³⁸CG³⁹GTCAACG⁴⁰CG⁴¹CAGCTGGATGGG-ATCATT-TCG⁴²GACTTCG⁴³AAGGTGGGTGCTGGGC-TGGCT-GCTGCG⁴⁴GCCG⁴⁵CG⁴⁶GACG⁴⁷TGCTGGAG-AGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGG-GGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGA-GGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCC-CGCTGA-GAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCC，并对CpG岛内的CpG位点进行编号，以CG33-46为甲基化筛选区域，作为研究对象，以CRC组织样本进行甲基化分析。

1.3.2. DNA提取及硫化纯化

以组织/细胞/全血gDNA提取试剂分别提取CRC组织标本48例、正常人组织标本23例、人结肠癌细胞系HCT116和正常结肠上皮细胞系NCM460的DNA，具体操作步骤按照说明书进行。血浆DNA提取按照试剂盒使用说明书进行提取。采用DNA硫化试剂盒对组织、细胞系的DNA进行硫化纯化。

1.3.3. 甲基化位点第二代测序分析

以Septin 9 V2 CG33-46为甲基化检测区域设计第二代测序扩增子引物(表2)，并分别对组织、细胞系样本硫化DNA进行建库。取5.00 μL硫化DNA， 1.50 μL浓度为10 μmol/L的引物探针Septin 9-Bis-P5-F和1.50 μL浓度为10 μmol/L的引物探针Septin 9-Bis-P7-R，25.00 μL引物探针2×Glod360 Master Mix，使用NF-H₂O稀释补足体积至50.00 μL，反应程序如下：95 $℃$ 5 min，95 $℃$ 15 s，72 $℃$ 1 min，18次循环；72 $℃$ 5 min，4 $℃$ 保存；将PCR产物用50.00 μL XP磁珠纯化，50.00 μL洗脱。取10.00 μL洗脱产物，加入25.00 μL的2×HiFi Master Mix 酶、1.50 μL的10 μmol/L的编码链TS-Primer 1酶、1.50 μL的10 μmol/L的编码链TS-INDEX Primer酶(1.50 μL指数用于样本区分)，使用NF-H₂O稀释补足体积至50.00 μL，反应程序如下：95 $℃$ 5 min，98 $℃$ 15 s，65 $℃$ 45 s，72 $℃$ 1 min；12次循环；将PCR产物用50.00 μL XP磁珠纯化，30.00 μL洗脱。纯化产物为上机文库，对文库进行电泳质控，每个样本按照双端150 bq，10 w读长(Reads)的测序模式(Pair end 150，10 w Reads)，采用illumina高通量测序仪进行测序，数据下机后，过滤除去低质量的读长和接头序列，通过BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件进行比对、评估关注位点的甲基化程度。筛选出跟CRC相关性高的CpG位点。甲基化程度计算公式：甲基化程度=mC/(mC+C)×100%。mC表示5'-甲基胞嘧啶；C表示胞嘧啶。

表2.

Septin 9 基因甲基化位点筛选建库引物

Table 2 Primer of library construction about methylation site screening on Septin 9 gene

引物名称	序列(5'-3')
Septin 9-Bis-P5-F	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT GGYGCTTTTTYGTYGTTGTTTTT
Septin 9-Bis-P7-R	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT CAAACCCACCCRCAAAATCCTCTCC
TS-Primer1	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTT TCCCTACACGA
TS-INDEX Primer	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[INDEX-i7]GT GACTGGAGTTCAGACGTGT

其中下划线序列为与Septin 9模板互补区域；其他序列为测序接头序列。

1.3.4. Septin 9酶切甲基化血浆样本检测体系的建立

以第二代测序[又称高通量测序(next generation sequencing，NGS)]检测甲基化位点并分析其结果，针对高特异性的CpG位点设计酶切甲基化引物探针。对CpG位点序列进行甲基化敏感性酶切位点分析，酶切位点分析见表3；再根据酶切位点分析结果，设计Septin 9甲基化检测的引物探针序列。为监控非甲基化模板是否酶切完全，本研究根据GAPDH基因非甲基化存在2个CpG酶切位点区域设计了引物探针，同时还设计内参基因ACTB的引物探针作为对照，序列见表4。将人CRC细胞系HCT116、正常结肠上皮细胞系NCM460、10%阳性细胞系核酸(10%人CRC细胞系HCT116核酸和90%正常结肠上皮细胞系NCM460核酸)、5%阳性细胞系核酸(5%人CRC细胞系HCT116核酸和95%正常结肠上皮细胞系NCM460核酸)、1%阳性细胞系核酸(1%人CRC细胞系HCT116核酸和99%正常结肠上皮细胞系NCM460核酸)加入BstU1酶0.50 μL，HhaI酶0.50 μL，HinP1I酶1.00 μL，以及5×cutsmart缓冲液8.00 μL，用40.00 μL的上述细胞系(约50 ng)配置酶切反应体系，置于热循环仪中按照如下步骤进行酶切：37 $℃$ 孵育1 h，65 $℃$ 孵育1 h，85 $℃$ 孵育15 min。取10.00 μL酶切产物、 10 μmol/L Septin 9-M-F引物1.50 μL，10 μmol/L Septin 9-M-R引物1.50 μL，10 μmol/L Septin 9-M-FAM引物0.42 μL，10 μmol/L ACTB-M-F引物2.25 μL，10 μmol/L ACTB-M-R引物2.25 μL，10 μmol/L ACTB-M-HEX引物0.63 μL，10 μmol/L GAPDH-M-F引物1.20 μL，10 μmol/L GAPDH-M-R引物1.20 μL，10 μmol/L GAPDH-M-VIC引物0.85 μL，用NF-H₂O稀释，补足体积至50.00 μL，将反应体系配置好后，置于ABI7500型real-time PCR测试仪中进行检测。分别统计相应比例细胞系核酸的Septin 9、ACTB和GAPDH的Ct值，评估相关体系的特异度和灵敏度。

表3.

Septin 9 CpG岛区域甲基化敏感性酶切位点数目

Table 3 Analysis of methylation sensitive enzyme cutting sites in CpG island region

基因名称	BstU1(CG/CG)	HhaI(GCG/C)	HinP1I(G/CGC)
Septin 9	3	2	2
ACTB	0	0	0
GAPDH	2	1	0

分析

表4.

Real-time PCR引物探针序列

Table 4 Primer probe of real-time PCR

引物名称	序列(5'-3')
Septin 9-M-F	GCTTCCTCGCCGCTGCCCTC
Septin 9-M-R	TCCGAAATGATCCCATCCAG
Septin 9-M-FAM	CGGACCCCGCGGTCAACGCGCAG
ACTB-M-F	CGCCTGCGGCCGGGCCGTGAGC
ACTB-M-R	CTGCCCCGGTCGGCTGGCCGGGCTTA
ACTB-M-HEX	GATCCGCCGCCCGTCCACAC
GAPDH-M-F	CCGTTAGGAAAGCCTGCCG
GAPDH-M-R	ACCTGACTTCCCCGCCACAC
GAPDH-M-VIC	ACTAACCCTGCGCTCCTGCCTC

取40.00 μL纯化的ctDNA，按上述反应体系配置，再置于ABI7500型real-time PCR测试仪中进行检测。分别统计每个样本的Septin 9、ACTB和GAPDH的Ct值。

1.3.5. 临床测试

根据上述的酶切体系和real-time PCR检测体系，对100例检测样本的血浆进行检测，临床样本特性见表1，统计相应的Ct值，根据阴性和阳性来判读标准评估体系的性能。

2. 结 果

2.1. Septin 9 甲基化位点的确定

对CRC组织和正常人组织样本进行第二代测序文库的构建、上机测序，分别统计CG33-46位点的甲基化程度，结果见图1所示。48例CRC组织和23例正常人样本在CG33位点甲基化程度为<5%和5%~19%，并且T4期的CRC组织大部分甲基化程度均<5%，说明CG33位点的特异性不强。研究还发现CG38位点的甲基化程度与病理信息高度一致，并且正常样本组织甲基化程度均<5%，说明该位点的特异性较强，确定为CRC高度相关性的甲基化位点。

图1.

Septin 9基因甲基化位点筛选结果

Figure 1 Results of screening methylation site on Septin 9 gene

T1N0M0: CRC of T1N0M0 stage; T2: CRC of T2 stage; T3: CRC of T3 stage; T4: CRC of T4 stage; NA: Normal sample.

在23例正常样本中，CG38甲基化程度为3.7%；CRC组织T1N0M0期甲基化程度为48.2%，T2、T3、T4期甲基化程度分别为86.4%、87.6%、88.2%。在人CRC细胞系HCT116中甲基化程度达到92.8%；在正常结肠上皮细胞系NCM460中甲基化程度仅为1.5%。

2.2. 甲基化敏感性酶切法检测体系的建立及血浆组织一致性分析

根据组织样本第二代测序结果分析确定甲基化位点，设计酶切法甲基化检测体系。首先对CRC阳性细胞系核酸和阴性细胞系核酸50 ng进行混合酶切消化。体系测试结果见图2所示。CRC阳性细胞系检测的灵敏度为0.5%甲基化，Ct值为38.5。

图2.

Septin 9 基因甲基化酶切法检测体系标准验证

Figure 2 Septin 9 gene methylation enzyme digestion system verificated by the standard cell line

A: Sequencing results of CRC cells and normal intestinal cells. 1: 10.0% CRC cells; 2: 5.0% CRC cells; 3: 2.5% CRC cells; 4: 1.0% CRC cells; 5: 0.5% CRC cells; 6: 100% normal intestinal cells; 7: Negative control cells. B: Sequencing results of ACTB. C: Sequencing results of GAPDH.

GAPDH均未出现扩增曲线，表明酶切体系已将非甲基化模板消化完成，避免了假阳性的产生。ACTB扩增曲线重复性较好，避免了点样导致的误差。50 ng正常结肠上皮组织细胞系未出现扩增曲线，表明该体系的特异度较好。

为进一步研究CRC组织与外周血中ctDNA一致性，将48例CRC样本和23例正常人样本组织和外周血分离的血浆ctDNA，提取核酸按照酶切法甲基化体系进行检测。检测结果统计见表2和图3，采用韦恩图进行一致性分析。结果表明组织样本和外周血一致性较好。

2.3. 临床血浆样本评估检测体系的性能

对采集到的100例(53例CRC患者和47正常人)血浆样本进行统计，统计结果显示该体系的灵敏度为87.27%，特异度为91.49%。阳性预测值为92.31%，阴性预测值为86.00%。

3. 讨 论

随着基因芯片和高通量技术的发展，基于表观遗传学的基因甲基化水平的研究越来越多。近期研究^[3]发现：Septin 9基因V2转录本启动子第3个CpG岛甲基化与CRC密切相关，并且发现血浆样本中Septin 9基因的甲基化与CRC组织样本的甲基化一致性较好。但Septin 9基因V2转录本启动子第3个CpG岛内具体的CpG位点尚不清楚。本研究首次通过高通量测序技术，以CRC和正常人样本的组织进行文库构建测序，研究启动子第3个CpG岛内的CpG位点的甲基化与临床样本不同分期之间的关系，结果显示第38号CpG位点在CRC患者组织中均表现出较强的甲基化；而在正常人样本组织中表现为低甲基化。因血浆样本中核酸碎片化、含量低等特点，本研究首次开发了甲基化敏感性酶切法-real-time PCR检测体系，根据对检测区域酶切位点分析筛选出BstU1、HhaI、HinP1I三种甲基化敏感性酶，并测试了优化后获得最佳的3种酶混合酶切体系及酶切反应条件。为有效检测酶切体系引物管家基因GAPDH的非甲基化区域，作者设计了其相应的引物探针，用以监测酶切体系的酶切效率。独创的三通道Septin 9基因甲基化敏感性酶切法检测体系分别以100%甲基化阳性细胞系和100%非甲基化阴性细胞系以及不同掺合比例的细胞系进行测试，以便评估体系的特异度、检测下限，确定阴阳性判断标准。测试结果表明：该检测体系的甲基化检测下限模板为含有0.5%甲基化程度的模板，阳性Ct值为38.5。与传统的重盐转化real-time qPCR检测技术相比，检测的灵敏度明显提高，同时解决了大体积血浆提取和重盐转化的问题。因而，通过对检测组的临床样本进行检测，以临床纤维肠镜结果进行对比，结果显示本研究中检测体系的特异度为91.49%，灵敏度为87.27%，该体系的综合性能为89.38%。

综上所述，Septin 9甲基化敏感性酶切法检测体系能较好地用于血浆样本CRC患者的筛查。同时也有望成为CRC患者预后监测的新手段和方法。其临床应用有待于进一步扩大样本进行深入的研究。

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

Funding Statement

湖南省卫生与计划生育委员会科研计划项目(C20180348)。

This work was supported by the Scientific Research Project of Hunan Health and Family Planning Commission, China (C20180348).

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202102127.pdf