Skip to main content
NCBI home page
Journal of Central South University Medical Sciences logoLink to Journal of Central South University Medical Sciences
. 2021 Dec 28;46(12):1392–1402. [Article in Chinese] doi: 10.11817/j.issn.1672-7347.2021.210169

CRISPR-Cas9系统的发现

Discovery in CRISPR-Cas9 system

PAN Shaowei 1,2, ZHANG Huali 1,✉
Editors: 田 朴, 陈 丽文
PMCID: PMC10930580  PMID: 35232910

Abstract

The 2020 Nobel Prize in Chemistry was awarded to the American scientist Jennifer A. Doudna and the French scientist Emmanuelle Charpentier, in recognition of their discovery in one of the greatest weapons in genetic technology: CRISPR-Cas9 gene scissors. The CRISPR-Cas system is a bacterial defense immune system against exogenous genetic material. Because the system can specifically recognize and cut DNA, this technology is widely used for precise editing of animal, plant, and microbial DNA. The discovery of CRISPR-Cas9 gene scissors enables the tedious and complicated cell gene editing work to be completed in a few weeks or even less, which has promoted the development of gene editing technology in various fields and brought revolutionary influence to the field of life sciences. At the same time, CRISPR gene editing technology has become one of the new therapies for tumors because of its large number of targets and relatively simple operation, and it also makes gene therapy possible. Although the technology still needs to solve technical problems such as off-target and promoter inefficiency, the CRISPR-Cas system will show its unique advantages in more fields with the continuous development of life science and basic medicine.

Keywords: CRISPR-Cas9 system, sgRNA, PAM sequence, gene editing

自欧洲文艺复兴与工业革命以来，科技的力量使得人类社会与生活方式发生了巨大的变化，特别是在计算机与信息化革命之后，生命科学技术发展到了一个新的高峰，基因编辑技术开始出现在人们的视野之中。1986年，Smithies等[1]提出染色体同源重组能应用于人类的疾病治疗；1994年5月，人类历史上第一个基因工程食物Flavr Savr番茄在美国上市。迄今，基因编辑技术已经历了从锌指蛋白(zinc finger protein，ZFP)技术到转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技术，再到成簇而规律地间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技术三代技术的革新。基因编辑技术的基本思路大体相同，都是通过人工编辑过的核酸内切酶精准地剪切DNA双链，形成特异性的DNA双链断裂(double-strand break，DSB)，再通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和基于同源DNA片段的重组修复(homology-directed repair，HDR)这2种细胞的天然修复机制进行修复。细胞通常通过NHEJ进行修复，这种修复途径会在DSB位点随机产生碱基插入或者缺失，使得基因失活，从而产生敲除目的基因的作用。当研究人员导入一个同源DNA链作为模板链时，细胞会以同源重组的方式进行修复，从而实现目的基因的插入。

在CRISPR技术被发现以前，最常使用的基因编辑技术是ZFP和TALEN。ZFP技术存在很多的不足，例如严重的脱靶效应与繁琐的筛选，特别是锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFNs)的筛选，其费用昂贵而且对研究人员专业水平的要求较高，因此难以大规模地应用于实验室[2]。相对来说，TALEN技术更加成熟，不管是筛选还是特异性识别能力，TALEN技术都要优于ZFP技术，但是其依然存在缺陷，例如TALENs的蛋白质分子要远远大于ZFNs。过大的分子量会带来操作上的不便，不仅会增加目的基因与TALENs结合的难度，而且大分子物质进入机体可能会引起机体的免疫反应使得其作用降低。更重要的是，TALENs仍有脱靶问题，其应用仅集中在基因敲除方面[3]。

由法国科学家艾曼纽尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和美国科学家詹妮弗·杜德纳(Jennifer A. Doudna)共同设计的CRISPR-Cas(CRISPR-associated genes/proteins，CRISPR相关基因/蛋白质)系统是基因编辑的第3代技术，这项技术最早可以追溯到20世纪80年代。1987年，日本的微生物学家Ishino在大肠杆菌中发现其非编码区存在异常重复序列[4]；几年后，西班牙的一名博士生Mojica在一种嗜盐古细菌中也发现了类似的重复序列，并与Jansen一起将其正式命名为CRISPR[5]。对CRISPR-Cas系统而言，一个重要的里程碑是法国科学家Barrangou等[6]在2007年证明了CRISPR-Cas是一种细菌获得性免疫系统，细菌通过对入侵的外源DNA进行特异性识别，利用Cas蛋白进行剪切，从而达到对自身的免疫作用。自此，许多研究团队都认识到这个系统的重要性，极大地促进了CRISPR-Cas分子机制的研究。2008年，荷兰科学家范德欧斯特(John van der Oost)团队[7]研究出了CRISPR-Cas I型分子机制，为后续基因编辑打下了基础。

2011年，法国科学家艾曼纽尔·卡彭蒂耶在化脓性链球菌中发现了一种新型的反式激活RNA (trans-activating RNA，tracrRNA)，证明了该RNA是CRISPR-Cas的组成部分。同年艾曼纽尔·卡彭蒂耶与美国科学家詹妮弗·杜德纳合作，成功地在试管中重建了CRISPR-Cas9系统，并且简化了其分子成分。随后，她们做了一个划时代的实验，她们对CRISPR-Cas9系统进行重新编辑，制造出来可以控制的基因剪刀，理论上该基因剪刀可以在预定位置剪切任何DNA分子，并可以在剪切位置插入目标DNA。自此，一种高效、准确的基因编辑技术被广泛应用于生命科学领域中。因其在基因编辑技术与医学基础研究方面做出的巨大贡献，艾曼纽尔·卡彭蒂耶与詹妮弗·杜德纳共同获得了2020年诺贝尔化学奖。本文概述CRISPR-Cas系统的组成与功能，介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的进展、应用及其缺陷。

1. CRISPR-Cas系统的基本结构

CRISPR-Cas系统是一种RNA导向的针对外源性遗传物质的防御免疫系统。该系统根据其效应器可以分为2类[8]：以多亚基复合物为效应器的1类(包括I型、III型和IV型)和以单个蛋白质为效应器的2类(包括II型、V型和VI型，图1)，而不同类型的CRISPR-Cas又细分成多个亚型。因为2类系统的效应器均为单一蛋白质，在实际操作中较为简单，所以更适用于基因组工程。CRISPR-Cas系统由CRISPR基因座、Cas蛋白及5'端的tracrRNA 3部分组成，通过识别外源的原型间隔序列邻近基序(protospacer-adjacent motif，PAM)序列来发挥免疫防御作用，下面将分别介绍各个部分的功能。

图1.

图1

Open in a new tab

CRISPR分型与Cas蛋白功能

Figure 1 CRISPR typing and Cas protein function

1.1. CRISPR

原核生物如细菌与古细菌基因组中普遍存在长度为25~50 bp不等的回文重复序列，这些重复序列又被长度为26~72 bp的独特间隔序列隔开，这些序列整合在一起被称为CRISPR[9]。在重复及间隔序列的上游还存在前导序列，一般被认为是CRISPR簇的启动子序列。CRISPR的间隔序列来源较为广泛，均源自外源性遗传物质，如噬菌体DNA、质粒、转座子等，CRISPR-Cas系统就是通过这些间隔序列识别目的基因。

1.2. Cas蛋白

Cas蛋白是一类参与外源DNA识别剪切的酶，多位于CRISPR位点的附近。Cas蛋白的功能模块可以分为4种，分别是适配、表达、干扰以及辅助，其核心Cas蛋白为Cas1~10(图1)。

适配功能的作用是获取间隔序列，主要由Cas1与Cas2蛋白完成，也有核酸内切酶Cas4的参与[10]；而且在II型系统中，Cas9也会参与适配功能[11]。Cas1与Cas2都是金属依赖的二聚体核酸内切酶，二者通过结合形成稳定的复合体识别并剪切外源DNA来参与适配。通过晶体化学技术可以得知Cas1蛋白是一种不对称的同源二聚体，有Cas1a、Cas1b、Cas1c和Cas1d 4个亚基，每个单体具有N端的β折叠结构和C端α-螺旋结构；而Cas2蛋白是对称的同源二聚体，具有铁氧化还原蛋白质核心折叠的功能[12]。Cas1-Cas2复合体的结构是异源六聚体，Cas1a和Cas1c的C端分别在Cas2的左右与之接触，而Cas1b和Cas1d分别与Cas1a、Cas1c的N端接触，最后形成一个不对称的复合物[13]。Cas1的C端结构域包含一个二价金属离子的保守结合位点，该位点平时被碱性的残基包裹，形成带有正电荷的凹槽，作为结合底物DNA的位点[14]。

表达功能主要由Cas6介导。Cas6的分子结构特征是串联的铁氧化还原蛋白质折叠，然而Cas6除了有明显的回文特征外，即使是种族相近的生物体RNA也没有序列同源性[15]。在不同的细菌中，Cas6有不同的名称，其作用方式也不一样：1)在嗜热栖热菌中的Cas6被称为Cse3、Cas6e或者CasE，其与从CRISPR基因转录的前体CRISPR RNA(precursor CRISPR RNAs，pre-crRNA)形成复合物后，Cse3对pre-crRNA进行剪切形成crRNA(CRISPR-derived RNA，源于CRISPR的RNA)，根据结合位点不同这种复合物呈现3种状态，每种状态下Cse3中的β6-β7发夹结构都是识别RNA-A型螺旋的主要凹槽。此外RNA茎环3'端的磷酸骨架也与Cse的2个铁氧化还原蛋白质折叠结构域的正电荷裂隙有电荷相互作用[16]。2)在铜绿假单胞菌中的Cas6被称为Csy4或者Cas6f，这是一种分子量为21.4 kD(1 D=1 u)的蛋白质，它可以在目标RNA的五碱基对茎环的3'末端进行剪切生成crRNA[17]。这2种细菌生成crRNA的方式表明目标RNA的茎环结构在Cas6识别和剪切中起重要作用。在不同类型的CRISPR-Cas系统中，Cas6表达功能的实现也不一样：在I型系统和III型系统中，Cas6蛋白剪切形成crRNA，其中III型系统还需要pre-crRNA与Cas10形成中间体crRNA[18]再由Cas6进行剪切形成crRNA；在II型系统中，表达功能是通过RNase III实现的，在敲除编码RNase III的基因RNC后，48 nt的crRNA会缺失且pre-crRNA会产生积累，证明RNase III参与了crRNA的形成[19]。

行使干扰功能的Cas则由于CRISPR-Cas系统分型不同而差异较大：1)1类CRISPR-Cas系统中I型和III型CRISPR-Cas系统的干扰功能是通过多亚基效应复合体实现的，该复合体包括了Cas7、Cas5以及其他大小亚基蛋白质等多种蛋白质[20-22]，在I型系统被称为CRISPR相关复合物(CRISPR-associated complex for antiviral defence，Cascade)；在III型系统中，不同亚型对复合体的称呼不同，例如在III型-A与III型-B中分别称该复合体为Csm和Cmr。2)2类CRISPR- Cas系统中II型系统的干扰功能由Cas9蛋白完成[23]。Cas9蛋白的N端含有Ruvc核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，在Ruvc结构域内存在一个近450个氨基酸长的插入片段，这个片段就包括HNH结构域[24]。多亚基效应复合体或者Cas9将核酸酶功能模块与引导RNA相结合，对目标DNA进行特异识别后将其剪切，从而达到自我保护的目的。3)在V型中则是由Cpf1蛋白(又被称为Cas12a)实现干扰功能[25]。

辅助功能由多种蛋白质和结构域构成，相比前3种功能，辅助功能中的核心Cas较为简单，仅有Cas4蛋白[26]。除去核心蛋白质外，各种结构域在此功能中发挥重要作用，例如CRISPR相关的罗斯曼折叠(CRISPR-associated Rossmann fold，CARF)结构域，该蛋白质的主要功能是通过改变C端效应器活性来调节CRISPR-Cas系统的活性[27]。此外，VI型系统中Cas13蛋白的作用是对与crRNA互补的RNA进行剪切[28]。大多数的VI型系统存在于拟杆菌门和梭杆菌门中，这是人类发现的第一个也是迄今为止唯一一个专门剪切RNA的CRISPR-Cas系统[29]。

1.3. TracrRNA

TracrRNA是被偶然发现的一种反式编码小RNA，它由CRISPR基因座上游120 bp区域转录而来，位于CRISPR的互补链上，能与CRISPR基因座间隔子附近的重复区域几乎完美地互补。因此tracrRNA能与pre-crRNA形成互补的RNA双链体[30]，以此参与pre-crRNA的加工。Chylinski等[31]发现：尽管各菌种的tracrRNA长度和序列都不相同，但都具有与同源pre-crRNA相匹配的保守碱基序列。除了 3'端存有茎环结构外，tracrRNA序列没有任何其他保守的二级结构[32]。

1.4. PAM序列

PAM是一种短而保守的序列，一般长度为2~5 bp，存在于外源DNA的旁边。PAM广泛存在于各种生物的基因组中，以NGG的形式出现(N代表ATGC任意一个)，例如在人类基因组中平均每8 bp就会出现一个PAM[33]。PAM的意义在于能够使细菌区分自我和非自我DNA，以此避免发生自身免疫。

2. CRISPR-Cas9系统的分子机制

目前被广泛应用于基因编辑的是CRISPR-Cas9系统，相比于其他系统，Cas9系统组成较为简单，具体机制更加清晰，仅Cas9一种蛋白质就能完成多项功能。CRISPR-Cas9系统以序列特定的方式识别与剪切外源DNA或者RNA，其引起的细菌自身防御机制通过3个阶段来实现：捕获间隔序列、合成crRNA和靶向干扰噬菌体DNA。

2.1. 捕获间隔序列

在这一阶段中，源于噬菌体DNA或RNA的原型间隔序列(protospacer)将会被识别并且剪切，最终被整合到细菌基因组的CRISPR序列之中。这个过程分为剪切原型间隔序列和插入整合原型间隔序列两步，主要是由适配功能相关的Cas1、Cas2蛋白完成，Cas4则作为辅助蛋白质与Cas1、Cas2形成复合物参与适配[34]。

当噬菌体、质粒DNA等外源DNA进入细菌时，Cas1-Cas2复合体会识别其DNA上的PAM序列，对PAM临近的目的基因进行特异性剪切。外源DNA底物双链体的中央部分会与Cas1-Cas2复合物的中央带正电荷的Cas2二聚体结合，解旋的DNA 3'端会进入Cas1a亚基C端的特殊结构域，PAM序列则落入Cas1a与Cas1b所组成的特异性口袋内[35]，此时Cas1a亚基 C端的特殊结构域构象会发生改变，把目标DNA中与Cas1-Cas2复合体中央结合的原型间隔序列剪切下来[36](图2A)。同时，Cas9蛋白在选择PAM时也起一定作用，实验[37]表明Cas9识别PAM后可以指定DNA的一个区间作为目标间隔区，而Cas1则会对其剪切提取出原型间隔序列。

图2.

图2

Open in a new tab

Cas1-Cas2适配整合原型间隔序列

Figure 2 Cas1-Cas2 complex integration and adaptation protospacer

A: Cas1-Cas2 complex combines and cuts exogenous DNA to obtain theprotospacer. B: Cas1-Cas2 complex inserts the protospacer into CRISPR.

在Cas1-Cas2复合体选择性地切完原型间隔序列之后，新的原型间隔序列会被整合到CRISPR基因座之中，被整合的原型间隔序列则被称为间隔子(spacer)(图2B)。此外还有一种可能参与整合的Csn2蛋白，该蛋白质可以结合双链DNA[38]。研究[39]表明前导序列对间隔子的插入至关重要，且插入的间隔子总是从前导序列附近的第一个重复序列开始。目前把原型间隔序列作为新的间隔子插入CRISPR基因座的分子步骤尚不清晰，很可能Cas9、Cas1、Cas2、Csn2复合体全都参与了该过程[36]。

2.2. 合成crRNA

CrRNA的合成是由参与表达的Cas蛋白完成，在CRISPR-Cas9系统中则主要是由RNase III和Cas9蛋白完成。当原型间隔序列导入CRISPR序列中形成间隔子后，细菌会将其转录为前体crRNA转录物(precursor transcript RNA，pre-crRNA)。CRISPR-Cas9系统中的tracrRNA有部分碱基序列与pre-crRNA上的重复序列存在严格的碱基互补关系，两者形成双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)[40]。RNase III会剪切dsRNA形成中间crRNA(intermediate crRNA，int-crRNA)，完成crRNA的初加工[41](图3A)，这个过程发生在Cas9蛋白的表层上。二次加工是Cas9对int-crRNA 5'末端的重复序列和间隔区序列进行修剪，使其变为成熟crRNA(mature crRNA，mat-crRNA)，剪切形成的这种mat-crRNA被称为gRNA(guide RNA)，Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)[42](图3B，3C)。

图3.

图3

Open in a new tab

Cas9与crRNA形成RNP参与干扰功能

Figure 3 Cas9 and crRNA form RNP and participate in interference function

A: Cas9 and RNase III cut dsRNA to form int-crRNA. B: Cas9 cuts and modifies int-crRNA to form gRNA. C: gRNA together with Cas9 protein to form RNP. D: RNP recognizes PAM of foreign DNA for specific cutting.

2.3. 靶向干扰噬菌体DNA

当外源DNA再次进入细胞时，RNP可以通过2种方式识别外源DNA的原型间隔序列：一是RNP中的gRNA通过与目标DNA原型间隔序列互补的片段决定剪切的特异性[43]；二是Cas9蛋白也能识别外源DNA上的PAM序列，并且这可能是crRNA识别目标DNA的先决条件[44]。之后RNP通过Cas9蛋白的HNH和RuvC两个核酸内切酶结构域剪切目的基因(图3D)，其中HNH域剪切互补的DNA链，RuvC剪切非互补的DNA链，造成平末端剪切[45]。通过剪切可以引起目的基因DNA的双链断裂，从而干扰目的基因的表达。

3. CRISPR-Cas9基因编辑技术的进展与应用

在2012年，Jinek等[46]将crRNA-tracrRNA双链RNA复合体改造成了单链结构，这种人工合成的单链RNA称为单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)。在后续实验[47]中发现sgRNA不需要外源的RNase III也能指导Cas9蛋白对外源DNA进行剪切。另一个重要的发现是化脓性链球菌Cas9(SpCas9)的结构为改造或重构Cas9和sgRNA提供了重要支架，可以通过重组或者截短Cas9的α螺旋识别域2(REC2)使得Cas9蛋白最小化[48]，增加了使用Cas9进行基因编辑的可行性。目前CRISPR-Cas9系统中使用的sgRNA有2种结构：一种是Jinek等[46]所使用的仅将一部分crRNA与一部分tracrRNA拼接的嵌合RNA结构；另一种是Mali等[49]对嵌合RNA结构改良后的结构，该结构添加了完整的tracrRNA序列。而这一改良使得sgRNA的丰度增加，相应增加了其打靶效率[50]。

3.1. CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑

3.1.1. 应用于大鼠和小鼠

CRISPR-Cas9系统早已被广泛运用于大鼠、小鼠动物模型的构建。南京大学的Shen等[51]在对雄性纯合小鼠注入Cas9 mRNA与嵌合RNA复合物后，将纯合小鼠的基因型转变为杂合子，再将其与纯合小鼠进行交配，产下了5只杂合小鼠，证明CRISPR-Cas9系统可以在小鼠体内工作。Dash等[52]利用CRISPR-Cas9介导的基因工程对人源化小鼠亚群中的HIV-1进行了消除，为治疗艾滋病提供了新的思路。该研究使用CRISPR-Cas9系统对小鼠体内的长末端重复序列和Gag基因的HIV-1亚基因组DNA片段进行剪切，从而对整合的前病毒DNA进行清除以达到治疗的效果，结果显示CRISPR-Cas9剪切病毒DNA的效率可达60%~80%。

3.1.2. 应用于斑马鱼

斑马鱼因其胚胎透明而被作为实验模型动物，早在1930年，斑马鱼就成为生物医学研究中发育的常见模型[53]。Hwang等[54]对斑马鱼10个基因进行基因打靶，证明CRISPR-Cas9系统可以在斑马鱼体内发挥作用。Sun等[55]使用CRISPR-Cas9编辑技术对斑马鱼1号染色体上的所有基因(共1 333个)进行全基因编辑及系统性敲除，成功地突变了1 029个基因，并生成了1 039个与636个基因相对应的种系可传递的等位基因，产生了斑马鱼遗传突变体的第一个全染色体集合。Li等[56]使用一种内含子介导且不依赖于同源重组的新方法来导入基因，该研究设计了一个靶向斑马鱼酪氨酸羟化酶基因最后一个内含子的sgRNA，并将其与斑马鱼密码子优化的Cas9(zebrafish codon-optimized Cas9，zCas9)共同注入单细胞阶段的斑马鱼胚胎中。通过该方法可以不破坏目的内源基因，在增加敲入效率的同时也避免了对亲本斑马鱼的筛选。

3.1.3. 应用于人类细胞

Cong等[47]最先用CRISPR-Cas9编辑技术同时敲除人类细胞的EMX1和PVALB两个基因，还通过靶向导入同一个基因两个不同位点的gRNA对EMX1基因的一段196 bp片段进行了敲除。Nihongaki等[57]设计了一种光激活的Cas9蛋白，在蓝光激活下将人胚肾293T细胞利用非同源性末端连接和同源性定向修复途径来诱导靶向基因组序列修饰，实现了光控制的CRISPR-Cas9系统在人细胞中的基因编辑。Liang等[58]通过将设计的gRNA-Cas9表达载体导入人胚肾293T细胞中编辑HBB基因，发现CRISPR-Cas9可以对其进行剪切，但由于HBB基因双链断裂的同源重组优先使用非交叉的同源定向修复，使得脱靶作用较为显著。

Stadtmauer等[59]使用CRISPR-Cas9编辑技术对人类T细胞进行改造，增强人类T细胞抵抗癌症的能力。该研究敲除了人类T细胞中两个编码内源性T细胞受体(T cell receptor，TCR)链的基因TCRα(TRAC)和TCRβ(TRBC)，以减少TCR错配并增强合成的癌症特异性TCR转基因(NY-ESO)的表达；同时敲除第3个编码程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)的基因，以提高T细胞的抗肿瘤能力；之后将工程化的T细胞移植到难治性癌症患者体内，结果发现修饰的T细胞可持续存活长达9个月，证明了CRISPR基因编辑在癌症免疫疗法中的可行性。

3.1.4. 应用于检测病毒

Xiang等[60]将CRISPR-Cas系统作为新型冠状病毒的诊断工具，使用基于CRISPR的特异的高灵敏度酶报告分子解锁(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK)检测新型冠状病毒，这种方法仅有3个步骤：从患者样品中分离出RNA进行扩增、使用Cas13预测病毒RNA的扩增序列及观察试纸上条带位置，整个过程花费时间不到1 h。

3.1.5. 应用于其他生物

CRISPR-Cas9系统不仅可以用于动物，还可以用于植物(以单子叶植物水稻最为广泛)。Feng等[61]成功地将CRISPR-Cas9系统应用于水稻基因的定点突变，证明CRISPR-Cas9系统可以作为分子剪刀在植物基因组中使用。OsRhoGAP2基因是一种功能尚不明确的Rho GTP酶激活蛋白质编码基因，安文静等[62]采用CRISPR-Cas9技术构建了OsRhoGAP2基因单靶标敲除载体对该基因进行敲除，通过突变体与野生型表型变化推测该基因涉及的生物学功能。

除此之外，CRISPR-Cas9系统也被证实可以运用于猴、猪、羊等大型哺乳动物。Xie等[63]采用CRISPR-Cas9技术成功地在猪ROSA26(pROSA26)基因座上特异性插入猪RSAD2基因(pRSAD2)的位点，产生了pRSAD2基因敲入(pRSAD2-KI)PK-15细胞和猪胎儿成纤维细胞(PFF)，该基因的特异性整合使得猪对经典猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病病毒(PRV)的抵抗力大大增强。Crispo等[64]将MSTN基因的Cas9 mRNA显微注射到绵羊的受精卵胞质中，使得胚胎发育突变率达50%。

3.2. CRISPR-Cas9编辑技术的缺陷与改进

相比于前两代的基因编辑技术(ZFP和TALEN技术)，CRISPR-Cas9基因编辑技术具有高效性与简便性的优点，但是这项技术依然存在靶向特异性不足、脱靶率高等局限性。DNA的修复有同源修复和非同源修复两种不同途径，CRISPR-Cas9系统所形成的DNA双链断裂通常以NHEJ修复为主，这种修复方式基于断裂末端的结构进行修复而不需要模板，因此容易产生错误[65]。有研究[66-67]表明Cas9系统使用NHEJ进行基因修复的比例高达90%。Jiang等[68]在评价细菌中CRISPR-Cas9系统的打靶特异性时发现Cas9对PAM序列5'端的特异识别能较低，容易发生脱靶现象。同时Fu等[69]发现CRISPR-Cas9系统在人细胞中有较多的脱靶事件。此外，CRISPR-Cas9系统还存在着基因编辑后代稳定性不佳、启动子低效及定点插入外源性基因低效等不足[70]。

针对CRISPR-Cas9系统所存在的上述问题，目前有许多研究已经进行了改造，以实现更加高效的基因编辑。其中主要方法如下：

3.2.1. 改变gRNA或PAM序列的长度

研究[71]表明：适当缩短sgRNA的长度可以增加Cas核酸酶的特异性，降低脱靶率。Müller等[72]利用嗜热链球菌Cas9对人类基因进行编辑，发现其脱靶率显著低于SpCas9，这是因为嗜热链球菌Cas9可识别的PAM序列长于SpCas9使得其特异性更高。这两种方法均可以在不影响剪切活性的情况下降低脱靶率。

3.2.2. 改变Cas9蛋白结构

Cas9的HNH结构域构象对剪辑活性有调控作用，改善Cas9的构象可以影响CRISPR-Cas9系统的脱靶率。Slaymaker等[73]通过将Cas9蛋白带正电的氨基酸残基变为电中性来降低其与非目标链的互补作用，从而降低脱靶率。此外，研究[74]表明编程DNA结合结构域(programmable DNA-binding domain，pDBD)与Cas9结合产生Cas9-pDBD嵌合体，可提升Cas9精度与靶向范围。Nishimasu等[75]通过消除Cas9上第1 335位的Arg与第3个G之间的碱基特异性相互作用，再使用PAM双链体产生非碱基特异性相互作用来进行代替，从而设计出一种对于PAM序列识别更加宽泛的SpCas9变体(SpCas9-NG)，可以识别NG序列的PAM。相较于传统识别NGG序列PAM的Cas9，SpCas9-NG的识别位点更加丰富，拥有更多的靶点。

4. 结 语

CRISPR-Cas9基因编辑技术相较于ZFP和TALEN更加快速而高效，广泛适用于各种真核生物系统，该技术的操作较为简单且成本较低，可用于普通实验室，极大地推动了生命科学与医学基础研究中基因编辑的进步。CRISPR-Cas9基因编辑技术从诞生到现在，发展十分迅速，现已有全基因组范围打靶的CRISPR-Cas9系统，该系统基本包含了小鼠的胚胎干细胞以及人细胞的所有基因[76]。不仅如此，研究[77]发现CRISPR-Cas9系统可以对人高甲基化位点进行编辑，表明CRISPR-Cas9对靶点的识别不受DNA甲基化的影响，这大大扩大了CRISPR-Cas9系统的应用范围。

尽管靶向特异性和脱靶问题仍没有彻底解决，但近年来对CRISPR-Cas9系统进行改良的研究颇多，通过改变Cas9构象与sgRNA的长度等方法能一定程度上弥补CRISPR-Cas9系统的缺陷。近年有研究[78]发现Cas13系统可以对病毒RNA进行特异性识别剪切，能够应用于病毒核酸检测、RNA编辑及疾病的靶向治疗等方面，与CRISPR-Cas9系统形成互补。此外，CRISPR系统与单细胞RNA测序、单细胞追踪等多种技术结合，使得其在肿瘤的异质性分析方面有独特优势，能够揭示更多的肿瘤潜在治疗靶点[79]。相信随着CRISPR-Cas9基因编辑技术的不断优化，该技术日后会在生物、医学等领域发挥更大的作用，并有着更加广阔的舞台。

欢迎订阅2022年《中南大学学报(医学版)》

《中南大学学报(医学版)》原名《湖南医科大学学报》，创刊于1958年，为教育部主管、中南大学主办的医药卫生类综合性学术期刊。该刊已被美国医学文献分析和联机检索系统(Medline, PubMed)及其《医学索引》(IM)、荷兰《医学文摘》(EM)、Scopus、WHO西太平洋地区医学索引(WPRIM)、中国科学引文数据库(核心库) (CSCD)，《WJCI报告》等国内外多家重要数据库和权威文摘期刊收录；是中国科技论文统计源期刊、中文核心期刊及中国期刊方阵“双效”期刊；为中国高校百佳科技期刊、中国精品科技期刊、RCCSE中国权威学术期刊(A+)和湖南省十佳科技期刊。

本刊为月刊，国际标准开本(A4幅面)，每月月末出版。内芯采用进口亚光铜版纸印刷，图片彩色印刷。定价45元/册，全年540元。国内外公开发行。国内统一连续出版物号：CN 43-1427/R；国际标准连续出版物号：ISSN 1672-7347；国内邮发代号：42-10，国外邮发代号：BM422；欢迎新老用户向当地邮局(所)订阅，漏订或需增订者也可直接与本刊编辑部联系订阅。

欢迎投稿　　　　欢迎订阅 地址： 湖南省长沙市湘雅路110号湘雅医学院75号信箱　　　　邮编：410078 电话： 0731-84805495, 0731-84805496 Email: xbyxb@csu.edu.cn, xyxb2005@vip.163.com, xyxb2005@126.com

Http://xbyxb.csu.edu.cn

《中南大学学报(医学版)》编辑部

基金资助

国家自然科学基金(82073135)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (82073135).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2021121392.pdf

参 考 文 献

  • 1. Smithies O, Powers PA. Gene conversions and their relation to homologous chromosome pairing[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 1986, 312(1154): 291-302. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 2. 沈忠福. 锌指核酸酶在基因组编辑中的应用[J]. 价值工程, 2012, 31(11): 303-305. [Google Scholar]; SHEN Zhongfu. Application of zinc finger nuclease in genome editing[J]. Value Engineering, 2012, 31(11): 303-305. [Google Scholar]
  • 3. 张金脉, 任兆瑞. TALENs: 一种新的基因定点修饰技术[J]. 生命科学, 2013, 25(1): 126-132. [Google Scholar]; ZHANG Jinmai, REN Zhaorui. TALENs: a new genome site-specific modification technology[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2013, 25(1): 126-132. [Google Scholar]
  • 4. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J]. J Bacteriol, 1987, 169(12): 5429-5433. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 5. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. J Mol Evol, 2005, 60(2): 174-182. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 6. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 7. Brouns SJ, Jore MM, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]. Science, 2008, 321(5891): 960-964. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 8. Lander ES. The heroes of CRISPR[J]. Cell, 2016, 164(1/2): 18-28. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 9. Moore JE, Mason CK, Coulter WA, et al. Comparison of clustered, regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) in viridans streptococci (Streptococcus gordonii, S. mutans, S. sanguinis, S. thermophilus) and in S. pneumoniae [J]. Br J Biomed Sci, 2008, 65(2): 104-108. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 10. Hooton SP, Connerton IF. Campylobacter jejuni acquire new host-derived CRISPR spacers when in association with bacteriophages harboring a CRISPR-like Cas4 protein[J]. Front Microbiol, 2014, 5: 744. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 11. Wei Y, Terns RM, Terns MP. Cas9 function and host genome sampling in Type II-A CRISPR-Cas adaptation[J]. Genes Dev, 2015, 29(4): 356-361. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 12. Beloglazova N, Brown G, Zimmerman MD, et al. A novel family of sequence-specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats[J]. J Biol Chem, 2008, 283(29): 20361-20371. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 13. Nuñez JK, Kranzusch PJ, Noeske J, et al. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity[J]. Nat Struct Mol Biol, 2014, 21(6): 528-534. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 14. Wiedenheft B, Zhou K, Jinek M, et al. Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-mediated genome defense[J]. Structure, 2009, 17(6): 904-912. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 15. Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J]. Genome Biol, 2007, 8(4): R61. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 16. Sashital DG, Jinek M, Doudna JA. An RNA-induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by the endoribonuclease Cse3[J]. Nat Struct Mol Biol, 2011, 18(6): 680-687. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 17. Haurwitz RE, Sternberg SH, Doudna JA. Csy4 relies on an unusual catalytic dyad to position and cleave CRISPR RNA[J]. EMBO J, 2012, 31(12): 2824-2832. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 18. Hale CR, Majumdar S, Elmore J, et al. Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs[J]. Mol Cell, 2012, 45(3): 292-302. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 19. Zhang Y, Heidrich N, Ampattu BJ, et al. Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation in Neisseria meningitidis [J]. Mol Cell, 2013, 50(4): 488-503. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 20. Agari Y, Sakamoto K, Tamakoshi M, et al. Transcription profile of Thermus thermophilus CRISPR systems after phage infection[J]. J Mol Biol, 2010, 395(2): 270-281. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 21. Staals RHJ, Agari Y, Maki-Yonekura S, et al. Structure and activity of the RNA-targeting type III-B CRISPR-Cas complex of Thermus thermophilus [J]. Mol Cell, 2013, 52(1): 135-145. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 22. Tamulaitis G, Kazlauskiene M, Manakova E, et al. Programmable RNA shredding by the type III-A CRISPR-cas system of Streptococcus thermophilus [J]. Mol Cell, 2014, 56(4): 506-517. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 23. Jinek M, Jiang F, Taylor DW, et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation[J]. Science, 2014, 343(6176): 1247997. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 24. Makarova KS, Aravind L, Wolf YI, et al. Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems[J]. Biol Direct, 2011, 6(1): 1-27. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 25. Yan WX, Hunnewell P, Alfonse LE, et al. Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems[J]. Science, 2019, 363(6422): 88-91. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 26. Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems[J]. Nat Rev Microbiol, 2015, 13(11): 722-736. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 27. Makarova KS, Anantharaman V, Grishin NV, et al. CARF and WYL domains: ligand-binding regulators of prokaryotic defense systems[J]. Front Genet, 2014, 5: 102. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 28. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Essletzbichler P, et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13[J]. Nature, 2017, 550(7675): 280-284. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 29. Makarova KS, Wolf YI, Iranzo J, et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants[J]. Nat Rev Microbiol, 2020, 18(2): 67-83. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 30. Fonfara I, Richter H, Bratovič M, et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA[J]. Nature, 2016, 532(7600): 517-521. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 31. Chylinski K, Le Rhun A, Charpentier E. The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems[J]. RNA Biol, 2013, 10(5): 726-737. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 32. Chyou TY, Brown CM. Prediction and diversity of tracrRNAs from type II CRISPR-Cas systems[J]. RNA Biol, 2019, 16(4): 423-434. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 33. Gasiunas G, Siksnys V. RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing?[J]. Trends Microbiol, 2013, 21(11): 562-567. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 34. Lee H, Dhingra Y, Sashital DG. The Cas4-Cas1-Cas2 complex mediates precise prespacer processing during CRISPR adaptation[J/OL]. Elife, 2019, 8: e44248. (2019-04-30)[2021-03-08]. 10.7554/eLife.44248. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 35. Gleditzsch D, Pausch P, Müller-Esparza H, et al. PAM identification by CRISPR-Cas effector complexes: diversified mechanisms and structures[J]. RNA Biol, 2019, 16(4): 504-517. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 36. Nuñez JK, Harrington LB, Kranzusch PJ, et al. Foreign DNA capture during CRISPR-Cas adaptive immunity[J]. Nature, 2015, 527(7579): 535-538. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 37. Heler R, Samai P, Modell JW, et al. Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation[J]. Nature, 2015, 519(7542): 199-202. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 38. Ellinger P, Arslan Z, Wurm R, et al. The crystal structure of the CRISPR-associated protein Csn2 from Streptococcus agalactiae [J]. J Struct Biol, 2012, 178(3): 350-362. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 39. Yosef I, Goren MG, Qimron U. Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli [J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(12): 5569-5576. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 40. Hille F, Charpentier E. CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance[J]. Phil Trans R Soc B, 2016, 371(1707): 20150496. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 41. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 42. Barrangou R, Marraffini LA. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity[J]. Mol Cell, 2014, 54(2): 234-244. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 43. Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(39): E2579-E2586. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 44. Cencic R, Miura H, Malina A, et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage[J/OL]. PLoS One, 2014, 9(10): e109213. (2014-10-02)[2021-03-08]. 10.1371/journal.pone.0109213. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 45. Nishimasu H, Cong L, Yan WX, et al. Crystal structure of Staphylococcus aureus Cas9[J]. Cell, 2015, 162(5): 1113-1126. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 46. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 47. Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 48. Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[J]. Cell, 2014, 157(6): 1262-1278. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 49. Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 50. Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 827-832. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 51. Shen B, Zhang J, Wu H, et al. Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting[J]. Cell Res, 2013, 23(5): 720-723. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 52. Dash PK, Kaminski R, Bella R, et al. Sequential LASER ART and CRISPR treatments eliminate HIV-1 in a subset of infected humanized mice[J]. Nat Commun, 2019, 10(1): 2753. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 53. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J]. Mol Microbiol, 2000, 36(1): 244-246. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 54. Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 227-229. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 55. Sun Y, Zhang B, Luo L, et al. Systematic genome editing of the genes on zebrafish Chromosome 1 by CRISPR/Cas9[J]. Genome Res, 2020, 30(1): 118-126. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 56. Li J, Zhang BB, Ren YG, et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system[J]. Cell Res, 2015, 25(5): 634-637. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 57. Nihongaki Y, Kawano F, Nakajima T, et al. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing[J]. Nat Biotechnol, 2015, 33(7): 755-760. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 58. Liang P, Xu Y, Zhang X, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes[J]. Protein Cell, 2015, 6(5): 363-372. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 59. Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer[J]. Science, 2020, 367(6481): eaba7365. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aba7365. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 60. Xiang XH, Qian KL, Zhang Z, et al. CRISPR-cas systems based molecular diagnostic tool for infectious diseases and emerging 2019 novel coronavirus (COVID-19) pneumonia[J]. J Drug Target, 2020, 28(7/8): 727-731. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 61. Feng Z, Zhang B, Ding W, et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J]. Cell Res, 2013, 23(10): 1229-1232. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 62. 安文静, 王凯婕, 刘亚菲, 等. CRISPR/Cas9介导的水稻OsRhoGAP2基因的敲除[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2020, 36(8): 977-986. [Google Scholar]; AN Wenjing, WANG Kaijie, LIU Yafei, et al. CRISPR/cas9-mediated knockdown of rice OsRhoGAP2 genes[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2020, 36(8): 977-986. [Google Scholar]
  • 63. Xie ZC, Jiao HP, Xiao HN, et al. Generation of pRSAD2 gene knock-in pig via CRISPR/Cas9 technology[J]. Antivir Res, 2020, 174: 104696. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 64. Crispo M, Mulet AP, Tesson L, et al. Efficient generation of myostatin knock-out sheep using CRISPR/Cas9 technology and microinjection into zygotes[J/OL]. PLoS One, 2015, 10(8): e0136690. (2015-08-25)[2021-03-08]. 10.1371/journal.pone.0136690. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 65. 严振鑫, 徐冬一. DNA双链断裂的非同源末端连接修复[J]. 生命科学, 2014, 26(11): 1157-1165. 25202172 [Google Scholar]; YAN Zhenxin, XU Dongyi. Role of nonhomologous end joining pathway in the repair of DNA double-strand breaks[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2014, 26(11): 1157-1165. [Google Scholar]
  • 66. Miyaoka Y, Berman JR, Cooper SB, et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing[J]. Sci Rep, 2016, 6: 23549. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 67. Paquet D, Kwart D, Chen A, et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9[J]. Nature, 2016, 533(7601): 125-129. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
  • 68. Jiang W, Bikard D, Cox D, et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 233-239. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 69. Fu Y, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 822-826. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 70. 欧阳乐军, 李莉梅, 马铭赛, 等. CRISPR/Cas9技术发展及其应用进展[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2019, 47(10): 34-40. [Google Scholar]; OUYANG Lejun, LI Limei, MA Mingsai, et al. Development and application progress of CRISPR/Cas9 technology[J]. Journal of Northwest A & F University. Natural Science Edition, 2019, 47(10): 34-40. [Google Scholar]
  • 71. Fu Y, Sander JD, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(3): 279-284. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 72. Müller M, Lee CM, Gasiunas G, et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 systems enable specific editing of the human genome[J]. Mol Ther, 2016, 24(3): 636-644. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 73. Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity[J]. Science, 2016, 351(6268): 84-88. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 74. Bolukbasi MF, Gupta A, Oikemus S, et al. DNA-binding-domain fusions enhance the targeting range and precision of Cas9[J]. Nat Methods, 2015, 12(12): 1150-1156. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 75. Nishimasu H, Shi X, Ishiguro S, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space[J]. Science, 2018, 361(6408): 1259-1262. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 76. Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system[J]. Science, 2014, 343(6166): 80-84. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 77. 刘志国. CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(10): 1567-1583. 25373363 [Google Scholar]; LIU Zhiguo. Research progress on CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J]. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2014, 45(10): 1567-1583. [Google Scholar]
  • 78. Freije CA, Myhrvold C, Boehm CK, et al. Programmable inhibition and detection of RNA viruses using Cas13[J]. Mol Cell, 2019, 76(5): 826-837. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  • 79. 韩云蕾, 郄蓓蓓, 何艳洁, 等. CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤研究中的进展[J]. 成都医学院学报, 2021, 16(5): 676-680. [Google Scholar]; HAN Yunlei, Beibei QIE, HE Yanjie, et al. CRISPR/Cas9 gene editing technology and its progress in tumor research [J]. Journal of Chengdu Medical College, 2021, 16(5): 676-680. [Google Scholar]

Articles from Journal of Central South University Medical Sciences are provided here courtesy of Central South University

RESOURCES