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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica logoLink to Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica
. 2023 Sep 26;40(3):325–332. doi: 10.17843/rpmesp.2023.403.12191
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In vitro anti-inflammatory activity of Plantago major L. and Piper aduncum L. on phospholipase A2 from the venom of snake Lachesis muta muta

Mirtha Yarleque-Chocas 1, Flor Dorregaray-Llerena 2, Armando Yarleque-Chocas 3, Celso Gonzales-Chavesta 4
PMCID: PMC10953663  PMID: 37991036

ABSTRACT

Objective.

To evaluate the in vitro inhibitory activity of Plantago major “llantén” and Piper aduncum “matico” extracts on phospholipase A2 (PLA2) from the venom of the snake Lachesis muta muta.

Materials and methods.

We carried out an explanatory study with experimental design. Leaves of P. major and P. aduncum were collected in the province of Huarochirí in Lima, Peru. Then, we prepared alcoholic extracts diluted in distilled water and conducted phytochemical assays, quantification of phenols and flavonoids, thin layer chromatography (TLC) on cellulose and enzymatic activity with PLA2. The ability to inhibit PLA2 with the extracts under study and their fractions was analyzed. The Kruskal Wallis test and Bonferroni multiple comparisons were used during statistical analysis.

Results.

Phenols, flavonoids and tannins were qualitatively identified in both P. major and P. aduncum; in addition, P. aduncum presented saponins. The inhibition of PLA2 activity of the venom by the total extract of P. major was 45.3%, and its fractions showed the following inhibition values: 31.1% for LLF-1, 66.3% for LLF-2 and 65.5% for LLF-3. The inhibition values for the total extract of P. aduncum were 86.9%, and its fractions showed the following inhibition rates: 34.3% for MF-1, 67.1% for MF-2 and 54.9% for MF-3. Statistical analysis showed significant differences in the inhibition of PLA2 (p=0.009) by the extracts.

Conclusion.

The tests demonstrated an association between the anti-inflammatory effect of the extracts and PLA2 inhibition.

Keywords: Plant extracts, Plantago, Piper, Venom, Phospholipase A2, Anti-inflammatory

INTRODUCTION

Peru is a country with a great wealth of phytogenetic resources, with a total of 19,147 species of vascular plants alone. The plant diversity contributes to the traditional knowledge of the country’s human communities, which actively participate in their conservation and sustainable use 1. Plant species sustain diverse ecosystems, and many of them have not yet been fully studied, although their empirical use is widespread, particularly for their medicinal properties.

In this context, Piper aduncum L., commonly known as “matico”, is a native species of Peru and is distributed in several departments, including Amazonas, Ayacucho, Cajamarca, Cuzco, Huánuco, Junín, Lambayeque, Lima, Loreto, among others 2. On the other hand, Plantago major L., a species introduced from Eurasia, is found in tropical and subtropical areas throughout the world, including Peru, where it is distributed in all geographic regions and at altitudes between 1500 and 2000 m 3.

It is interesting to identify the ethnomedicinal uses of P. aduncum and P. major in Peru, where the fresh or dried leaves are used as an infusion to treat a variety of health problems, such as colds, fungal infections, coughs, wounds, bronchitis, fever, kidney, lung, gastric and respiratory problems, as well as to wash inflamed wounds 4.

Certain flavonoids, found I some plants, may have anti-inflammatory properties, which is why it is important to study them. Blocking inflammation implies the ability to act on the activity of enzymes involved in the synthesis of thromboxanes and leukotrienes, such as phospholipase A2 (PLA2) and cyclooxygenases (COXI and COXII), as well as having an inhibitory effect on the production of nitric oxide (NO), a cellular mediator involved in physiological and pathological processes related to inflammation 5.

The venom of the snake Lachesis muta muta, which inhabits the Peruvian jungle and is known as “shushupe”, has high PLA2 activity. For this reason, the search for inhibitors of this enzyme is proposed as an alternative to understand the mechanism of the anti-inflammatory process 6.

This study aimed to evaluate the in vitro inhibitory activity of P. major “llantén” and P. aduncum “matico” extracts on PLA2 from the venom of the snake Lachesis muta muta, since this enzyme plays an important role in the inflammatory process. It is important to emphasize that this study represents the first contribution at national level in the knowledge of the action of the compounds contained in these plants in the inhibition of PLA2, that is, in their anti-inflammatory capacity.

KEY MESSAGES

Motivation for the study. P. major “llantén” and P. aduncum “matico” have been used in traditional medicine for their anti-inflammatory effects, and we aimed to investigate these effects in relation to the PLA2 enzyme that initiates the inflammatory process.

Main findings. The extracts from the two plants inhibit PLA2 of snake venom; the extract from P. aduncum showed to be more efficient. The fractions showed different degrees of inhibition.

Implications. The extracts of P. major and P. aduncum and their fractions showed in vitro inhibitory effects on snake venom PLA2, which is related to the anti-inflammatory effect.

MATERIALS AND METHODS

This was an explanatory and experimental research. It was conducted at the Biochemistry and Natural Active Principles Research Laboratory of the Faculty of Medicine “Hipólito Unanue” of the Universidad Nacional Federico Villarreal from July 2021 to July 2022.

Plant samples

The leaves of Piper aduncum L. and Plantago major L. were collected between August and October 2019 in the province of Huarochirí in Lima, Peru. This locality is located at an altitude of 3044 MASL (11°50′41′S 76°23′02′W), with a temperature ranging from 15 °C to 21 °C.

The species were taxonomically identified in the Herbarium of the Faculty of Natural Sciences of the Universidad Nacional Federico Villarreal, where the samples were deposited with accession codes No. 7400 for Piper aduncum L. and No. 7399 for Plantago major L.

Snake venom

The freeze-dried venom of the Peruvian snake L. muta muta was provided by the Laboratory of Molecular Biology, which is in charge of the “Oswaldo Meneses Serpentarium” of the Museum of Natural History of the Universidad Nacional Mayor de San Marcos in Lima, Peru. The specimens of L. muta muta found in the serpentarium were collected from the Alto Marañón area, in the department of Amazonas, and are kept in captivity, complying with the norms established by the National Forestry and Fauna Service (SERFOR) of the Ministry of Agriculture and Irrigation.

Alcoholic extracts

The samples consisted of dried leaves of each species. Two hundred grams of each sample were collected and pulverized to increase their surface area in contact with the solvent. Then, these pulverized samples were placed in amber-colored jars for maceration with 96° ethanol for seven days. After the maceration period, the extracts were filtered to remove solid particles and obtain a clarified liquid. Subsequently, the ethanol solvent was evaporated in a rotary evaporator until the extracts were completely dry.

Qualitative phytochemical assays

The following qualitative phytochemical assays were carried out to determine the presence of different compounds in the extracts of Plantago major and Piper aduncum:

Determination of total phenols: the ferric chloride reagent was used to form a dark blue colored complex in the presence of phenolic compounds. A 1 mL solution of the sample in 70% ethanol, and 2 drops of 1% ferric chloride were added in a test tube, and the color changed 7.

Evaluation of flavonoids: the oxidation reaction of metallic magnesium with concentrated hydrochloric acid was used to form magnesium chloride, which reacts with the flavonoids and generates colored complexes. We placed 1 mL of ethanolic solution of the sample in a test tube, then 10 drops of concentrated HCl and magnesium metal chips were added. After resting for 5 minutes, we observed the color of the reaction 7.

Identification of saponins: saponins have the ability to break the surface tension of water and form foam. We added 1 g of dry extract to 10 mL of distilled water, then it was heated at 100 °C for 5 min and shaken vigorously. Persistent foaming after 5 min was scored with crosses, indicating the presence of saponins 7.

Tannin recognition: tannins have the ability to precipitate proteins. We placed 1 mL of 1% gelatin in saline solution in a test tube, to which 200 uL of the sample dissolved in distilled water were added. The presence of protein precipitation was scored as positive, which indicated the presence of tannins 7.

Quantification of phenols

The Folin-Ciocalteu reagent 8 was used for the colorimetric oxidation-reduction reaction. We added 1 mL of 10% Folin-Ciocalteu to 0.1 mL of each sample, then it was left to rest for five minutes, then 1 mL of 7.5% sodium carbonate was added. The tubes were then placed in a water bath (45°C) for 15 minutes and read at 765 nm in a Thermo Scientific Genesys 10 spectrophotometer. The results were compared with a gallic acid curve (Sigma Chemical) and expressed in mg/g of sample. Three replicates were performed with each sample.

Quantification of flavonoids

Total flavonoids were analyzed by a spectrophotometric method 9. We mixed 250 µL of each sample with 1000 µL of deionized water, then 75 µL of 20% NaNO2 was added, allowed to react for five minutes and then 75 µL of 10% AlCl3 and 500 µL of 1 M NaOH were added. The mixture was centrifuged at 3500 rpm for five minutes. Total flavonoids were expressed as catechin mg/g sample. Absorbance was measured at 510 nm. Three replicates were performed with each of the plant samples.

PLA2 activity

We determined PLA2 activity by measuring the clotting time of a 45% egg yolk emulsion with 10 mM Tris HCl buffer and 10 mM calcium chloride pH 7.4, after incubation with 0.125 mg/mL of L. muta muta venom for 10 min at 37 °C 6.

Inhibition of PLA2 by the extracts

Sample preparation: 1 mL of the venom of concentration 0.250 mg/mL was collected and mixed with 1 mL of each of the plant extracts separately. These mixtures were pre-incubated for 10 min at a temperature of 37 °C.

Substrate preparation: A 45% egg emulsion was prepared in 10 M Tris HCl buffer pH 7.4 with 10 mM calcium chloride; 1.5 mL of the emulsion was used as substrate.

Incubation with substrate: 200 uL of the venom plus extract mixture was added to the substrate. Then, this mixture was heated at a temperature of 100 °C.

Measurement of coagulation time: The coagulation time of the egg yolk was measured in minutes after incubation with the venom plus extract mixture.

Calculation of specific activity: The specific activity of PLA2 was expressed as the variation of yolk clotting time per minute divided by the protein content of the venom in milligrams (U/mg).

Thin layer chromatography on cellulose

Aqueous solutions of 0.5 g/mL of the extracts of P. major L. and P. aduncum L. were seeded on cellulose chromatographic plates, ethanol and water in concentrations of 1:2 and 1:3, respectively, were used as mobile phase.

Statistical analysis

R v.4.2.1 software was used to analyze the existence of significant differences in the inhibitory activity on PLA2 between the total extracts and their fractions for the two species, P. major (LLF-1, LLF-2 and LLF-3) and P. aduncum (MF-1, MF-2 and MF-3) respectively, using the Kruskal-Wallis test, which is equivalent to a complete randomized design. Similarly, in order to determine which sample exhibited higher inhibitory activity on PLA2, pairwise comparisons were carried out using the PLA2 activity values of the venom and each of the plant samples; the Bonferroni multiple comparisons test was also applied. This choice was based on the fact that the assumptions of variance analysis (normality of errors and homogeneity of variances) were not met in both cases.

To validate the results, we used SPSS version 28 software d and multiple comparison plots were generated to provide a more detailed explanation of the comparisons between pairs of samples.

Ethical Aspects

The project was evaluated by the Ethics Committee of the Research, Innovation and Entrepreneurship Unit of the Faculty of Natural Sciences and Mathematics of the Universidad Nacional Federico Villarreal (code No. 002-2022).

RESULTS

Detection of bioactive components in total extracts

Table 1 shows the content of phenols and flavonoids in the total extracts of P. major and P. aduncum. The total content of phenols and flavonoids present in P. major was lower by approximately 50% with respect to P. aduncum.

Table 1. Concentration of total phenols and flavonoids in total extracts.

Total extracts Total phenols mg/g sample (SD) Flavonoids mg/g sample (SD)
P. major 11.65 (0.037) 0.30 (0.018)
P. aduncum 21.12 (0.003) 0.73 (0.027)
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SD: standard deviation.

As for the qualitative analysis, the extracts of P. major and P. aduncum showed a positive reaction for phenols, flavonoids and tannins; additionally, saponins were found in P. aduncum (Table 2).

Table 2. Phytochemical tests of extracts and fractions of P. major and P. aduncum.

Sample Phenols Flavonoids Saponins Tannins PC
P. major + + - + NA
LLF-1 + + - + 0.58
LLF-2 + - - + 0.70
LLF-3 + + - + 0.88
P. aduncum + + + + NA
MF-1 + + - + 0.23
MF-2 + + - - 0.58
MF-3 + + + - 0.74
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Presence (+), absence (-), PC: partition coefficient, NA: not applicable.

LLF-1: fraction 1 of P. major, LLF-2: fraction of P. major, LLF-3: fraction 3 of P. major.

MF-1: fraction 1 of P. aduncum. LLF-2: fraction 2 of P. aduncum. LLF-3: fraction 3 of P. aduncum.

Analysis of the fractions of the extracts of P. major and P. aduncum

There were three fractions, from the TLC, of both total extracts of P. aduncum and P. major. The partition coefficient (PC) values obtained for the fractions of P. aduncum were 0.23 to 0.74, and 0.58 to 0.88 for the fractions of P. major. The phytochemical analysis of the P. major fractions, showed phenols, flavonoids and tannins in all of them, except for LLF-2, which did not show flavonoids. Phenols and flavonoids were found in the fractions of P. aduncum, additionally tannins were found in MF-1 and saponins in MF-3 (Table 2).

PLA2 inhibitory activity of PLA2 by extracts of P. major and P. aduncum

The results of in vitro assays of the inhibitory effect of phospholipase A2 of L. muta muta venom by P. major and P. aduncum extracts showed significant variations (p=0.009).

Table 3 shows the inhibitory effect of PLA2 of L. muta muta venom by P. major total extract at a concentration of 0.5 g/mL and indicates that there are highly significant differences (p=0.009). On the other hand, Figure 1A shows the pairwise comparison of the values of PLA2 enzyme activity of the venom and those of the total extract of P. major and each of its fractions. We found that LLF-2 significantly (p<0.05) inhibited the PLA2 activity of the venom compared to the total extract and the other fractions.

Table 3. Inhibitory effect of P. major extract and its fractions.

Treatment Specific activity (SD) p-value a Inhibition %
L. muta muta 0.125 mg/mL 3.69 (0.002) 0.009 NA
P. major 0.5 g/mL 2.02 (0.002) 45.3
LLF-1 0.5 g/mL 2.55 (0.013) 31.1
LLF-2 0.5 g/mL 1.24 (0.002) 66.3
LLF-3 0.5 g/mL 1.28 (0.004) 65.5
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LLF-1: fraction 1 of P. major, LLF-2: fraction 2 of P. major, LLF-3: fraction 3 of P. major, SD: standard deviation, NA: not applicable.

a

Kruskal Wallis test.

Figure 1. Multiple comparisons of the inhibitory enzymatic activity on PLA2 of L. muta muta venom.

Figure 1

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Table 4 shows the inhibitory effect of PLA2 of L. muta muta venom by the total extract of P. aduncum at a concentration of 0.125 g/mL and indicates that there are highly significant differences (p=0.009). Figure 1B presents the results of pairwise comparisons of PLA2 activity of venom and total extract of P. aduncum and each of its fractions. The total extract of P. aduncum significantly (p<0.05) inhibited the PLA2 activity of the venom compared to its fractions.

Table 4. Inhibitory effect of P. aduncum extract and its fractions.

Treatment Specific activity (SD) p-value a Inhibition %
L. muta muta 0.125 mg/mL 3.69 (0.002) 0,009 NA
P. aduncum 0.125 g/mL 0.49 (0.004) 86.9
MF-1 0.125 g/mL 2.43(0.005) 34.3
MF-2 0.125 g/mL 1.21 (0.002) 67.1
MF-3 0.125 g/mL 1.67 (0.003) 54.9
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MF-1: fraction 1 of P. aduncum, MF-2: fraction 2 of P. aduncum, MLF-3: fraction 3 of P. aduncum, SD: standard deviation, NA: not applicable.

a

Kruskal Wallis test.

DISCUSSION

Phenolic compounds able to inhibit PLA2 of the snake venom L. muta muta were detected in the extracts of P. major L., P. aduncum L. and their fractions, so they are related to inflammation. The total extract of P. aduncum and LLF-2 of P. major significantly inhibit PLA2 (p˂0.05) of the venom compared to the other samples evaluated.

The use of both plants for their anti-inflammatory effects is part of widespread ancestral knowledge. Our findings support this empirical knowledge, because PLA2 is the key enzyme in the inflammatory process. It is important to emphasize that this research is the first work carried out in the country on the subject; other works related to the inhibition of PLA2 of snake venoms by flavonoids isolated from plant species or commercial flavonoids aimed to study the mechanism of envenomation after an ophidian accident, which has not been the subject of this research 5,10,11.

In Peru, 1408 species used in traditional medicine have been described, and about 80% of the population is familiar with their empirical application in phytotherapy 12. These figures have led ethnomedicine to develop the exploration of bioactive components whose effectiveness has been reported by highland and jungle populations 13.

Although steroidal and non-steroidal anti-inflammatory drugs are currently used to treat acute inflammation, these drugs have not been successful in the treatment of chronic inflammatory disorders due to their side effects. Therefore, there is an urgent need to find safer anti-inflammatory compounds, such as those present in vegetables 14. Among the active components of extracts are flavonoids, a family of compounds whose members have many interesting biological properties, which could be studied to obtain new natural drugs 15.

Several studies have shown that plant extracts have anti-inflammatory activity both in vitro and in vivo16. Hussan et al. 17) reported that aqueous, methanolic and ethanolic extracts of P. major leaves reduced inflammatory action both in vitro and in vivo. For the in vitro tests, they measured the concentration of the enzyme 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1, and for in vivo tests, they used rats that were caused liver injury with acetaminophen. The results showed low concentrations of liver enzymes and proinflammatory cytokines, indicating a decrease in the inflammatory reaction.

A study on the lyophilized extracts of P. major prepared with water and with ethanol, used an in vitro model with H400 oral epithelial lines and reported that each extract, as well as their mixtures, had anti-inflammatory activity 18. Another research reported that 10 compounds were isolated from P. aduncum leaves, of which two showed inhibition of soluble epoxide hydrolase (SEH), an enzyme that regulates inflammatory processes in the brain during depression 19. In addition, Thao et al. 20) caused inflammation in dendritic cells with proinflammatory cytokine lipopolysaccharides IL-12 p40, IL-6 and TNF-Alpha in order to study the inhibition of inflammation by P. aduncum fractions. They showed that seven of the isolated compounds inhibited IL-12 p40 and IL-6 production, but had no effect on TNF-alpha.

Research with extracts of five varieties of Piper on the immunomodulatory effect of inflammation in human monocytes showed that these samples amplified the anti-inflammatory response compared to ketoprofen, mainly reducing the production of IL-8 21.

Although it is true that P. major and P. aduncum are used in Peru for their anti-inflammatory effects, research on the subject has been conducted in in vivo models with the total extract 22. In other countries, in vitro studies have been carried out with the compounds isolated from the total extracts of these species, using cellular and enzymatic models, being cyclooxygenases the most studied enzymes 16-18. The in vitro evaluation of PLA2 is of great importance, since this enzyme releases arachidonic acid from the cell membrane, thus initiating inflammation.

Interestingly, there are reports that show that extracts of P. major and P. aduncum have wound healing, antioxidant, analgesic, immunological and cytoprotective effects 2,23.

The mechanism of envenomation of the venom of L. muta muta, which contains PLA2, is highly complex and, therefore, has not been the subject of the present investigation. PLA2 activity has been used exclusively as a protein model because of its important participation in the initiation of the inflammatory process. Thus, by partially or totally inhibiting PLA2 with the extracts or their fractions, as shown in this study, the anti-inflammatory effect could be related to the presence of the phenolic compounds contained in these plants.

Flavonoids are phenolic compounds characterized by a chemical structure consisting of three rings called A, B, and C. Many reports indicate that these rings play an important role in the biological activities of these compounds, since they allow them to interact with specific proteins in intracellular signaling, generating inhibition or activation 24,25.

There are several articles on flavonoids with the ability to inhibit PLA2. Giresha et al. mentioned that quercetin is able to inhibit PLA2 from human and rabbit peritoneal neutrophils, as well as PLA2 from Vipera russelli snake venom and, to a lesser extent, PLA2 from porcine pancreas. Flavonols such as kaempferol, quercetin and myricetin were shown to be able to inhibit PLA2 from V. russelli venom, due to the unsaturation between the 2,3 carbons of its C-ring. However, the IC50 values of these flavonoids were at concentrations between 75 M-115 M, very high values even for pharmacological treatments 25.

Quercetin has been shown to modulate the PLA2 activity of the snake Naja naja atra due to interference between the enzyme and membrane phospholipids 11. In addition, it has been reported that PLA2 from the venom of the snake Bothrops jararacussu is inhibited by the flavonol rhamnetin, which causes an anti-inflammatory effect due to its A and C rings, which provide greater stability to the cell membrane 5. Toyama et al. 10, reported that quercetin decreased the catalytic activity of PLA2 from Crotalus durissus terrificus both in vitro and in vivo, by modifying the secondary structure of the enzyme and preventing coupling with the substrate.

On the other hand, Rodrigues et al. reported the presence of tannins in the leaves of Laguncularia racemosa, capable of inhibiting PLA2 isolated from the venom of C. durisus terrificus; these molecules had the ability to reduce edema and myonecrosis associated with inflammation. Our results only showed the presence of tannins in the LLF-2 fraction of P. major and this fraction had a great capacity to inhibit PLA2 of L. muta muta venom. The inhibition values we found were higher than those of the total extract, as well as the fractions that additionally contained flavonoids 26.

Some researchers have carried out fractionation of medicinal plant extracts in order to identify the chemical structure and evaluate the biological activity of the fractions. They emphasize that the compounds present in the total extracts have greater activity than the isolated compounds, so it is considered that there is synergism between these components.

Our results show that the total extract of P. aduncum has a greater capacity than its fractions to inhibit PLA2 of L. muta muta venom, in contrast to the total extract of P. major, where its fractions produce a greater degree of inhibition. In a previous study, total extracts of O. rosea “bloodsucker” were found to have a lower inhibitory capacity on thrombin than its fractions 27. In addition, Genc et al.28 evaluated the inhibition values of hyaluronidase, collagenase, and elastase enzymes by the aqueous extract of P. major major and three of its fractions (F-1, F-2 and F-3); it was evidenced that the total extract produced an inhibition of hyaluronidase and collagenase of 27.0% and 21.9%, respectively, while F-1 presented greater inhibition with values of 41.6% and 28.3% on both enzymes; elastase was not inhibited neither by the total extract nor by the fractions.

On the other hand, a study on the antioxidant effect of Ginko biloba extract and its four fractions, found that F-3 and F-1 together produced a greater antioxidant effect than each of them separately, which is evidence of synergism in this extract 29.

The study on mango (Mangifera indica L.) seeds showed that, of the twelve fractions, five had anticarcinogenic action to different degrees, but all had antioxidant action, the most potent and abundant being the butylated hydroxytoluene (BHT) fraction, used in the food industry for its high antioxidant power 30.

One of the limitations of our study was the lack of availability of adequate quantities of the fractions of the two studied species. This was due to the fact that only thin-layer chromatography was performed, which prevented carrying out tests to obtain the mean inhibitory concentration (IC50) both in vitro and in vivo. Nevertheless, we achieved the objectives of the research.

In conclusion, we found a significant inhibition of phospholipase A2 of L. muta muta venom by the total extracts of P. major and P. aduncum, being more potent that of P. aduncum. All the fractions obtained by TLC also showed ability to inhibit PLA2, but to different degrees. However, LLF-2, which contained only tannins, was the one that showed significant inhibition compared to its total extract. These PLA2 inhibitions by P. major and P. aduncum extracts are promising in the search for anti-inflammatory compounds.

Acknowledgments

The authors of this article would like to thank Dr. Miguel Zaldívar Arias, for the support provided for the development of this work, during his time as head of the Biochemistry and Natural Active Principles Research Laboratory of the Hipólito Unanue School of Medicine of the Universidad Nacional Federico Villarreal. Also, to Magister María Isabel La Torre Acuy, for her collaboration in the taxonomic identification of the plant species used in this research.

Funding Statement

Universidad Nacional Federico Villarreal, with CANON 2018-UNFV resources

Funding.: This research was funded by the Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Federico Villarreal, with CANON 2018-UNFV resources.

Cite as:

Yarleque-Chocas M, Dorregaray-Llerena F, Yarleque-Chocas A, Gonzales-Chavesta C. In vitro anti-inflammatory activity of Plantago major L. and Piper aduncum L. on phospholipase A2 from the venom of snake Lachesis muta muta. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2023;40(3):325-32. doi: 10.17843/rpmesp.2023.403.12191.

6

Preliminary results of the present study were presented at the VI Latin American Congress of Medicinal Plants as a poster presentation: Efecto de los extractos alcohólicos de plantas medicinales sobre la Fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta “shushupe” (doi: 10.13140/RG.2.2.19737.16480).

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Actividad antiinflamatoria in vitro de Plantago major L. y Piper aduncum L. sobre la fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente Lachesis muta muta

Mirtha Yarleque-Chocas 1, Flor Dorregaray-Llerena 2, Armando Yarleque-Chocas 3, Celso Gonzales-Chavesta 4

RESUMEN

Objetivo.

Evaluar la actividad inhibitoria in vitro de los extractos de Plantago major «llantén» y Piper aduncum «matico» sobre Fosfolipasa A2 (PLA2) del veneno de la serpiente Lachesis muta muta.

Materiales y métodos.

Esta investigación fue de tipo explicativa con diseño experimental. Se recolectaron hojas de P. major y P. aduncum en la provincia de Huarochirí en Lima, Perú. Se prepararon extractos alcohólicos diluidos en agua destilada y se realizaron los ensayos fitoquímicos, la cuantificación de fenoles y flavonoides, la cromatografía de capa fina (CCF) en celulosa y la actividad enzimática con PLA2. Se analizó la capacidad de inhibir la PLA2 con los extractos en estudio y sus fracciones. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de Kruskal Wallis y comparaciones múltiples de Bonferroni.

Resultados.

Tanto en P. major como en P. aduncum se identificó cualitativamente la presencia de fenoles, flavonoides y taninos; además, P. aduncum presentó saponinas. La inhibición de la actividad de la PLA2 del veneno por el extracto total de P. major fue del 45,3%, y sus fracciones mostraron valores de inhibición: LLF-1 con 31,1%, LLF-2 con 66,3% y LLF-3 con 65,5%. En P. aduncum, los valores de inhibición para el extracto total fueron de 86,9%, y sus fracciones presentaron inhibiciones: MF-1 con 34,3%, MF-2 con 67,1% y MF-3 con 54,9%. El análisis estadístico demostró diferencias significativas en la inhibición de la PLA2 (p=0,009) por los extractos.

Conclusión.

Los ensayos realizados demostraron una asociación entre el efecto antiinflamatorio de los extractos y la inhibición de la PLA2.

Palabras clave: Extractos de Plantas, Plantago, Piper, Veneno, Fosfolipasa A2, Antiinflamatorio

INTRODUCCIÓN

El Perú es un país que cuenta con una gran riqueza en recursos fitogenéticos, teniendo solo en plantas vasculares un total de 19 147 especies. Esta diversidad permite que las plantas puedan relacionarse con los conocimientos tradicionales de las comunidades humanas del país, las que participan activamente en su conservación y uso sostenible 1. Las especies vegetales brindan diversos servicios ecosistémicos, y muchas de ellas aún no han sido estudiadas completamente, aunque su uso empírico es muy difundido, especialmente por sus propiedades medicinales.

En este contexto, Piper aduncum L., comúnmente conocida como «matico», es una especie nativa del Perú y está distribuida en varios departamentos, incluyendo Amazonas, Ayacucho, Cajamarca, Cuzco, Huánuco, Junín, Lambayeque, Lima, Loreto, entre otros 2. Por otro lado, Plantago major L., una especie introducida de Eurasia, se encuentra en zonas tropicales y subtropicales en todo el mundo, incluyendo Perú, donde se distribuye en todas las regiones geográficas y a altitudes entre 1500 y 2000 m 3.

Es interesante conocer los usos etnomedicinales de P. aduncum y P. major en el Perú, donde las hojas frescas o secas se utilizan en forma de infusión para tratar una variedad de problemas de salud, como resfriados, hongos, tos, heridas, bronquitis, fiebre, problemas renales, pulmonares, gástricos y respiratorios, así como para lavar heridas inflamadas 4.

En relación con las investigaciones sobre flavonoides y su actividad antiinflamatoria, se destaca la importancia de estudiar este efecto debido a que ciertos flavonoides, como la quercetina, contenidos en algunas plantas, pueden poseer propiedades antiinflamatorias. Bloquear la inflamación implica la capacidad de actuar sobre la actividad de enzimas involucradas en la síntesis de tromboxanos y leucotrienos, como la Fosfolipasa A2 (PLA2) y las ciclooxigenasas (COXI y COXII), así como tener un efecto inhibidor sobre la producción de óxido nítrico (NO), un mediador celular implicado en procesos fisiológicos y patológicos relacionados con la inflamación 5.

El veneno de la serpiente Lachesis muta muta, que habita en la selva peruana y es conocida como «shushupe», contiene una elevada actividad de PLA2. Por esta razón, la búsqueda de inhibidores sobre esta enzima se plantea como una alternativa para comprender el mecanismo del proceso antiinflamatorio 6.

El objetivo de la presente investigación fue evaluar la actividad inhibitoria in vitro de los extractos de P.major «llantén» y P. aduncum «matico» sobre PLA2 del veneno de la serpiente Lachesis muta muta, ya que esta enzima juega un papel importante en el proceso inflamatorio. Es importante destacar que este estudio representa el primer aporte a nivel nacional en el conocimiento de la acción de los compuestos contenidos en estas plantas en la inhibición de PLA2, es decir, en su capacidad antiinflamatoria.

MENSAJES CLAVE

Motivación para realizar el estudio. P. major «llantén» y P. aduncum «matico» han sido utilizadas en la medicina tradicional por sus efectos antiinflamatorios y nuestra inquietud fue investigar esos efectos con relación a la enzima PLA2 que es la que inicia el proceso inflamatorio.

Principales hallazgos. Los extractos provenientes de las dos plantas inhiben a la PLA2 del veneno de serpiente, siendo el de P. aduncum más eficiente. Las fracciones mostraron inhibición en diferentes grados.

Implicancias. Los extractos de P. major y P. aduncum y sus fracciones muestran efecto inhibitorio in vitro sobre la PLA2 del veneno de serpiente, lo que se relaciona con el efecto antiinflamatorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación realizada fue de tipo explicativa y de diseño experimental. Se realizó en el Laboratorio de Investigación de Bioquímica y Principios Activos Naturales de la Facultad de Medicina «Hipólito Unanue» de la Universidad Nacional Federico Villarreal desde julio del 2021 a julio del 2022.

Muestras vegetales

Las hojas de Piper aduncum L. y Plantago major L. utilizadas en la investigación fueron recolectadas entre agosto a octubre del 2019 en la provincia de Huarochirí en Lima, Perú. La localidad se encuentra a una altitud de 3044 m s. n. m. (11°50′41″S 76°23′02″O), con una temperatura que oscila entre 15 °C y 21 °C.

La identificación taxonómica de las especies se realizó en el Herbario de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional Federico Villarreal, donde las muestras se encuentran depositadas con códigos de ingreso N.° 7400 para Piper aduncum L. y N.° 7399 para Plantago major L.

Veneno de serpiente

El veneno liofilizado de la serpiente peruana L. muta muta usado en la investigación fue proporcionado por el Laboratorio de Biología Molecular, que tiene a cargo el «Serpentario Oswaldo Meneses» del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos en Lima, Perú. Los ejemplares de L. muta muta del serpentario proceden de la zona del Alto Marañón, en el departamento de Amazonas, y se mantienen en cautiverio, cumpliendo con las normas establecidas por el Servicio Nacional de Forestal y Fauna (SERFOR) del Ministerio de Agricultura y Riego.

Extractos alcohólicos

Las muestras fueron hojas secas de cada especie. Se tomaron 200 g de cada muestra y se pulverizaron para aumentar su superficie de contacto con el solvente. Luego, estas muestras pulverizadas se colocaron en frascos de color ámbar para su maceración con etanol de 96° durante siete días. Después del periodo de maceración, se procedió a filtrar los extractos para eliminar las partículas sólidas y obtener un líquido clarificado. Posteriormente, se evaporó el solvente etanol en un equipo conocido como rotavapor hasta que los extractos quedaron completamente secos.

Ensayos fitoquímicos cualitativos

Los ensayos fitoquímicos cualitativos realizados en la investigación para determinar la presencia de diferentes compuestos en los extractos de Plantago major y Piper aduncum fueron los siguientes:

Determinación de fenoles totales: se utilizó el reactivo de cloruro férrico para formar un complejo coloreado de color azul oscuro en presencia de compuestos fenólicos. Se agregó 1 mL de solución de la muestra en etanol al 70% y 2 gotas de cloruro férrico al 1% en un tubo de ensayo, y se observó el cambio de color 7.

Evaluación de flavonoides: se empleó la reacción de oxidación del magnesio metálico con el ácido clorhídrico concentrado para formar cloruro de magnesio que reacciona con los flavonoides y genera complejos coloreados. Se colocó 1 mL de solución etanólica de la muestra en un tubo de ensayo, se agregaron 10 gotas de HCl concentrado y virutas de magnesio metálico. Después de reposar por 5 minutos, se observó el color de la reacción 7.

Identificación de saponinas: las saponinas tienen la capacidad de romper la tensión superficial del agua y formar espuma. Se tomó 1 g de extracto seco al que se le añadió 10 mL de agua destilada, se calentó a 100 °C por 5 minutos y se agitó vigorosamente. La formación de espuma persistente a partir de 5 minutos fue calificada con cruces, indicando la presencia de saponinas 7.

Reconocimiento de taninos: los taninos tienen la capacidad de precipitar proteínas. Se colocó 1 mL de gelatina al 1% en solución salina en un tubo de ensayo y se agregaron 200 uL de la muestra disuelta en agua destilada. La presencia de precipitación de la proteína fue calificada como positiva, indicando la presencia de taninos 7.

Cuantificación de fenoles

Para la reacción colorimétrica de óxido-reducción se utilizó el reactivo de Folin-Ciocalteu (8. A 0,1 mL de cada muestra se agregó 1 mL de Folin-Ciocalteu al 10%, se dejó reposar por cinco minutos y se agregó 1 mL de carbonato de sodio al 7,5%. Posteriormente se colocaron los tubos por 15 minutos a baño maría (45°C), luego se leyeron a 765 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 10. Los resultados fueron comparados con una curva de ácido gálico (Sigma Chemical), y expresados en mg/g de muestra. Se realizaron tres repeticiones con cada una de las muestras.

Cuantificación de flavonoides

Los flavonoides totales fueron analizados por un método espectrofotométrico (9. A 250 µL de cada muestra se le mezcló con 1000 µL de agua desionizadas, después se añadió 75 µL de NaNO2 al 20%, se dejó reaccionar cinco minutos para luego agregar 75 µL de AlCl3 al 10% y 500 µL de NaOH 1 M. La mezcla fue centrifugada a 3500 r.p.m. durante cinco minutos. Los flavonoides totales fueron expresados en mg catequina/g de muestra. Las absorbancias fueron medidas a 510 nm. Se realizaron tres repeticiones con cada una de las muestras vegetales.

Actividad de PLA2

Se determinó midiéndose el tiempo de coagulación de una emulsión de yema de huevo al 45% con buffer Tris HCl 10 mM, cloruro de calcio 10 mM pH 7,4, luego de su incubación con 0,125 mg/mL del veneno de L. muta muta por 10 minutos a 37 °C 6.

Inhibición de PLA2 por los extractos

Preparación de las muestras: Se tomaron 1 mL del veneno de concentración 0,250 mg/mL y se mezcló con 1 mL de cada uno de los extractos vegetales por separado. Estas mezclas se preincubaron durante 10 minutos a una temperatura de 37 °C.

Preparación del sustrato: Se preparó una emulsión de huevo al 45% en buffer Tris HCl 10 M pH 7,4 con cloruro de calcio 10 mM, 1,5 mL de la emulsión se utilizó como sustrato.

Incubación con el sustrato: A 200 uL de la mezcla de veneno más extracto se le agregó al sustrato. Luego, esta mezcla se llevó a calentamiento a una temperatura de 100 °C.

Medición del tiempo de coagulación: Se midió el tiempo de coagulación de la yema de huevo en minutos después de la incubación con la mezcla de veneno más extracto.

Cálculo de la actividad específica: La actividad específica de la PLA2 se expresó como la variación del tiempo de coagulación de la yema por minuto dividido por el contenido de proteína del veneno en miligramos (U/mg).

Cromatografía de capa fina en celulosa

Soluciones acuosas de 0,5 g/mL de los extractos P. major L. y P. aduncum L. fueron sembrados en las placas cromatográficas de celulosa, se empleó como fase móvil etanol: agua, 1:2 y 1:3, respectivamente.

Análisis estadístico

Se utilizó el software R v.4.2.1 para analizar la existencia de diferencias significativas en la actividad inhibitoria sobre PLA2 entre los extractos totales y sus fracciones para las dos especies estudiadas, P. major (LLF-1, LLF-2 y LLF-3) y P. aduncum (MF-1, MF-2 y MF-3) respectivamente, mediante la prueba de Kruskal-Wallis, la cual es equivalente a un diseño completo al azar. De manera similar, para determinar cuál muestra presentaba una mayor actividad inhibitoria sobre PLA2, se llevaron a cabo comparaciones por pares usando los valores de actividad de PLA2 del veneno y de cada una de las muestras vegetales, y se aplicó la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. Esta elección se basó en que no se cumplían los supuestos del análisis de varianza (normalidad en los errores y homogeneidad de varianzas) en ambos casos.

Para validar los resultados, se usó el software SPSS versión 28 y se generaron gráficos de comparaciones múltiples para brindar una explicación más detallada de las comparaciones entre las parejas de muestras.

Aspectos éticos

El proyecto fue evaluado por el Comité de Ética de la Unidad de Investigación, Innovación y Emprendimiento de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal (código N.º 002-2022).

RESULTADOS

Detección de componentes bioactivos en los extractos totales

En la Tabla 1 se muestra el contenido de fenoles y flavonoides registrados en los extractos totales de P. major y P. aduncum. El contenido total de fenoles y flavonoides presentes en P. major fue menor en aproximadamente el 50% con respecto a P. aduncum.

Tabla 1. Concentración de fenoles totales y flavonoides en los extractos totales.

Extractos totales Fenoles totales mg/g muestra (DE) Flavonoides mg/g muestra (DE)
P. major 11,65 (0,037) 0,30 (0,018)
P. aduncum 21,12 (0,003) 0,73 (0,027)
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DE: desviación estándar.

En cuanto al análisis cualitativo, se registró para los extractos de P. major y P. aduncum reacción positiva para fenoles, flavonoides y taninos; adicionalmente las saponinas se encontraron en el de P. aduncum (Tabla 2).

Tabla 2. Pruebas fitoquímicas de los extractos y las fracciones de P. major y P. aduncum.

Muestra Fenoles Flavonoides Saponinas Taninos Rf
P. major + + - + NA
LLF-1 + + - + 0,58
LLF-2 + - - + 0,70
LLF-3 + + - + 0,88
P. aduncum + + + + NA
MF-1 + + - + 0,23
MF-2 + + - - 0,58
MF-3 + + + - 0,74
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Presencia (+), ausencia (-), Rf: coeficiente de reparto, NA: no aplica.

LLF-1: fracción 1 de P. major, LLF-2: fracción de P. major, LLF-3: fracción 3 de P. major.

MF-1: fracción 1 de P. aduncum. LLF-2: fracción 2 de P. aduncum. LLF-3: fracción 3 de P. aduncum.

Análisis de las fracciones de los extractos de P. major y P. aduncum

Las fracciones, procedentes de la CCF, de ambos extractos totales de P. aduncum y P. major fueron tres. Los valores de coeficientes de reparto (Rf) obtenidos para las fracciones de P. aduncum fueron de 0,23 a 0,74, mientras que, para las fracciones de P. major 0,58 a 0,88. En el análisis fitoquímico de las fracciones de P. major todas presentaron fenoles, flavonoides y taninos a excepción de LLF-2 que no presentó flavonoides. En las fracciones de P. aduncum, se registraron fenoles y flavonoides, adicionalmente en MF-1 se observó taninos y en MF-3 saponinas (Tabla 2).

Actividad inhibitoria de la PLA2 por los extractos de P. major y P. aduncum

Los resultados de los ensayos in vitro del efecto inhibitorio de la fosfolipasa A2 del veneno de L. muta muta por los extractos de P. major y P. aduncum mostraron variaciones significativas (p=0,009).

La Tabla 3 muestra el efecto inhibitorio de la PLA2 del veneno de L. muta muta por el extracto total de P. major a una concentración de 0,5 g/mL e indica que existen diferencias altamente significativas (p=0,009). Por otra parte, en la Figura 1A, en la comparación por pares de los valores de la actividad enzimática de PLA2 del veneno y los del extracto total de P. major y cada una de sus fracciones, se observó que LLF-2 inhibió significativamente (p<0,05) la actividad de la PLA2 del veneno en comparación con el extracto total y las otras fracciones.

Tabla 3. Efecto Inhibidor del extracto de P. major y sus fracciones.

Tratamientos Actividad especifica (DE) Valor de p a % Inhibición
L. muta muta 0,125 mg/mL 3,69 (0,002) 0,009 NA
P. major 0,5 g/mL 2,02 (0,002) 45,3
LLF-1 0,5 g/mL 2,55 (0,013) 31,1
LLF-2 0,5 g/mL 1,24 (0,002) 66,3
LLF-3 0,5 g/mL 1,28 (0,004) 65,5
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LLF-1: fracción 1 de P. major, LLF-2: fracción 2 de P. major, LLF-3: fracción 3 de P. major, DE: desviación estándar, NA: no aplica.

a

Prueba de Kruskal Wallis.

Figura 1. Comparaciones multiples de la actividad enzimatica inhibitoria sobre PLA2 del veneno de L. muta muta.

Figura 1

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La Tabla 4 muestra el efecto inhibitorio de la PLA2 del veneno de L. muta muta por el extracto total de P. aduncum a una concentración de 0,125 g/mL e indica que existen diferencias altamente significativas (p=0,009). En la Figura 1B, se presentan los resultados de las comparaciones por pares de la actividad de PLA2 del veneno y del extracto total de P. aduncum y cada una de sus fracciones. El extracto total de P. aduncum inhibió significativamente (p<0,05) la actividad de la PLA2 del veneno en comparación con sus fracciones.

Tabla 4. Efecto Inhibidor del extracto de P. aduncum y sus fracciones.

Tratamientos Actividad especifica (DE) Valor de p a % Inhibición
L. muta muta 0,125 mg/mL 3,69 (0,002) 0,009 NA
P. aduncum 0,125 g/mL 0,49 (0,004) 86,9
MF-1 0,125 g/mL 2,43(0,005) 34,3
MF-2 0,125 g/mL 1,21 (0,002) 67,1
MF-3 0,125 g/mL 1,67 (0,003) 54,9
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MF-1: fracción 1 de P. aduncum, MF-2: fracción 2 de P. aduncum, MLF-3: fracción 3 de P. aduncum, DE: desviación estándar, NA: no aplica.

a

Prueba de Kruskal Wallis.

DISCUSIÓN

En los extractos de P. major L., P. aduncum L. y sus fracciones se detectó la presencia de compuestos fenólicos capaces de inhibir la PLA2 del veneno de la serpiente L. muta muta, por lo que se los relaciona con la inflamación. El extracto total de P. aduncum y la LLF-2 de P. major inhiben significativamente a la PLA2 (p˂0,05) del veneno en comparación con las otras muestras evaluadas.

El conocimiento ancestral muy difundido es el uso de ambas especies vegetales por sus efectos antiinflamatorios, lo que estos hallazgos estarían respaldando los conocimientos empíricos, debido a que la PLA2 la enzima clave en el proceso inflamatorio. Es importante destacar que esta investigación es el primer trabajo que se realiza en el país sobre el tema; otros trabajos relacionados con la inhibición de PLA2 de venenos de serpientes por flavonoides aislados de especies vegetales o flavonoides comerciales están dirigidos al estudio del mecanismo de envenenamiento luego de un accidente ofídico, lo cual no ha sido motivo de esta investigación 5,10,11.

En el país se han descrito 1408 especies usadas en la medicina tradicional, y cerca del 80% de la población conoce su aplicación empírica la fitoterapia 12. Estas cifras han originado que la etnomedicina desarrolle la exploración de componentes bioactivos cuya efectividad fue observada por las poblaciones de sierra y selva 13.

Aunque los fármacos antiinflamatorios esteroideos y los no esteroideos se utilizan actualmente para tratar la inflamación aguda, estos fármacos no han tenido éxito en el tratamiento de trastornos inflamatorios crónicos debido a los efectos secundarios que presentan. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de encontrar compuestos antiinflamatorios más seguros, como los que están presentes en los vegetales 14. Entre los componentes activos de los extractos están los flavonoides, una familia de compuestos cuyos miembros tienen muchas propiedades biológicas interesantes, que podrían ser estudiadas para obtener nuevos fármacos naturales 15.

Numerosas investigaciones han demostrado que extractos vegetales presentan actividad antiinflamatoria tanto in vitro como in vivo (16. Hussan et al. 17 señalaron que los extractos acuosos, metanólicos y etanólicos de las hojas de P. major redujeron la acción inflamatoria tanto in vitro como in vivo. Para el primer caso, se midió la concentración de la enzima 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1, y en el segundo caso, se utilizaron ratas a las que se les causó lesiones hepáticas con acetaminofén. Los resultados mostraron concentraciones bajas de las enzimas hepáticas y de las citocinas proinflamatorias, lo que indicando una disminución de la reacción inflamatoria.

Por otro lado, al estudiar los extractos liofilizados de P. major preparados uno con agua y el otro con etanol, en un modelo in vitro con líneas epiteliales orales H400, se observó que cada extracto, así como sus mezclas, poseían actividad antiinflamatoria 18. Asimismo, se ha publicado que se aislaron 10 compuestos de las hojas de P. aduncum, de los cuales dos presentaban inhibición del epóxido hidrolasa soluble (SEH), enzima que regula los procesos inflamatorios en el cerebro durante la depresión 19. Además, Thao et al. 20 estudiaron la inhibición de la inflamación por las fracciones de P. aduncum, utilizaron células dendríticas a las que causaron inflamación con los lipopolisacáridos de las citocinas proinflamatorias IL-12 p40, IL-6 y FNT-Alfa. El estudio demostró que, siete de los compuestos aislados inhibieron la producción IL-12 p40 e IL-6, pero no presentaron efecto sobre el FNT-Alfa.

Investigaciones con los extractos de cinco variedades de Piper sobre el efecto inmunomodulador de la inflamación en monocitos humanos demostraron que estas muestras amplificaron la respuesta antiinflamatoria en comparación con el ketoprofeno, reduciendo principalmente la producción de IL-8 21.

Si bien es cierto que P. major y P. aduncum son usados en el Perú por sus efectos antiinflamatorios, las investigaciones sobre el tema se han realizado en modelos in vivo con el extracto total 22. En otros países, se han efectuado estudios in vitro con los compuestos aislados de los extractos totales de estas especies, utilizado modelos celulares y enzimáticos, siendo las ciclooxigenasas las enzimas más estudiadas16-18. La evaluación in vitro de la PLA2 es de gran importancia, ya que esta enzima que libera ácido araquidónico de la membrana celular, iniciando así la inflamación.

Es interesante señalar que existen informes que indican que los extractos de P. major y P. aduncum presentan efectos cicatrizantes, antioxidantes, analgésicos, inmunológicos y citoprotectores 2,23.

En cuanto al veneno de serpiente L. muta muta, que contiene PLA2, el mecanismo de envenenamiento es sumamente complejo y, por tanto, no ha sido motivo de la presente investigación. La actividad de PLA2 se ha empleado exclusivamente como una proteína modelo debido a su importante participación en el inicio del proceso inflamatorio. De esta manera, al inhibir parcial o totalmente la PLA2 con los extractos o sus fracciones, como se muestra en este estudio, se podría relacionar el efecto antiinflamatorio con la presencia de los compuestos fenólicos contenidos en estas plantas.

Los flavonoides son compuestos fenólicos que se caracterizan por poseer una estructura química constituida de tres anillos denominados A, B y C. Muchos informes señalan que estos anillos juegan un papel importante en las actividades biológicas de estos compuestos, ya que les permiten interactuar con proteínas específicas en la señalización intracelular, generando inhibición o activación 24,25.

Existen numerosas publicaciones sobre flavonoides con capacidad de inhibir a la PLA2. Giresha et al., mencionan que la quercetina es capaz de inhibir la PLA2 de los neutrófilos humanos y peritoneales de conejo, así como la PLA2 del veneno de la serpiente Vipera russelli y, en menor grado, la PLA2 del páncreas porcino. Los flavonoles como kaempferol, quercetina y miricetina mostraron ser capaces de inhibir a la PLA2 del veneno de V. russelli, debido a la insaturación entre los carbonos 2,3 de su anillo C. Sin embargo, los valores IC50 de estos flavonoides fueron de concentraciones entre 75 M-115 M, cantidades muy elevadas incluso para tratamientos farmacológicos 25.

La quercetina ha demostrado modula la actividad de la PLA2 de la serpiente Naja naja atra debido a la interferencia entre la enzima y los fosfolípidos de la membrana 11. Además, se ha observado que la PLA2 del veneno de la serpiente Bothrops jararacussu es inhibida por el flavonol ramnetina, lo que causa efecto antiinflamatorio gracias a la participación de sus anillos A y C, que le proporcionan mayor estabilidad a la membrana celular 5. En un estudio realizado por Toyama et al. 10, se demostró que la quercetina disminuyó la actividad catalítica de la PLA2 de Crotalus durissus terrificus tanto in vitro como in vivo, al modificar la estructura secundaria de la enzima e impedir el acoplamiento con el sustrato.

Por otro lado, Rodrigues et al., reportan la presencia de taninos en las hojas de Laguncularia racemosa, capaces de inhibir a la PLA2 aislada del veneno de la serpiente de C. durisus terrificus; estas moléculas tuvieron la capacidad de disminuir el edema y la mionecrosis asociados a la inflamación. En este contexto de la presente investigación, se detectó en la fracción LLF-2 de P. major únicamente la presencia de taninos y esta fracción mostró una gran capacidad para inhibir la PLA2 del veneno de L. muta muta. Los valores de inhibición encontrados fueron superiores a los del extracto total, así como a las fracciones que adicionalmente contenían flavonoides 26.

Algunos investigadores han realizado fraccionamiento de los extractos de las plantas medicinales con la finalidad de conocer la estructura química y evaluar la actividad biológica de las fracciones. Ellos destacan que los compuestos presentes en los extractos totales tienen mayor actividad que en los compuestos aislados, por lo que se considera que existe sinergismo entre estos componentes.

En el presente trabajo se ha mostrado que el extracto total de P. aduncum tiene mayor capacidad que sus fracciones para inhibir a la PLA2 del veneno de L. muta muta, a diferencia del extracto total de P. major, donde sus fracciones producen una inhibición en mayor grado. En un estudio previo, se observó que los extractos totales de O. rosea «chupasangre» tienen una menor capacidad inhibitoria sobre la trombina que sus fracciones 27. Además, Genc et al. 28 evaluaron los valores de inhibición de las enzimas hialuronidasa, colagenasa y elastasa por el extracto acuoso de P. major major y tres de sus fracciones (F-1, F-2 y F-3); se evidenció que el extracto total producía una inhibición de la hialuronidasa y la colagenasa de 27,0% y 21,9%, respectivamente, mientras que la F-1 presentó mayor inhibición con valores de 41,6% y 28,3% sobre ambas enzimas; la elastasa no fue inhibida ni por el extracto total ni por las fracciones.

Por otra parte, en una investigación en la que se midió el efecto antioxidante del extracto de Ginko biloba y sus cuatro fracciones, se encontró que las F-3 y F-1 juntas produjeron un mayor efecto antioxidante que cada una de ellas por separado, lo que es una evidencia de sinergismo en este extracto 29.

El estudio sobre semillas de mango (Mangifera indica L.) demostró que, de las doce fracciones separadas, cinco tenían acción anticancerígena en diferentes grados, pero, todas presentaron acción antioxidante, siendo la más potente y abundante la fracción hidroxitolueno butilado (BHT), empleada en la industria alimentaria por su elevado poder antioxidante 30.

Esta investigación presentó limitaciones debido a la falta de disponibilidad de cantidades adecuadas de las fracciones de las dos especies estudiadas. Esto se debió a que solo se realizó cromatografía en capa fina, lo que impidió llevar a cabo pruebas para obtener la concentración inhibitoria media (CI50) tanto in vitro como in vivo. No obstante, se cumplió con los objetivos propuestos en el proyecto de investigación.

En conclusión, se observó una significativa inhibición de la Fosfolipasa A2 del veneno de L. muta muta por los extractos totales de P. major y P. aduncum, siendo más potente el de P. aduncum. Todas las fracciones obtenidas por CCF también mostraron capacidad de inhibir a la PLA2, pero en diferentes grados. No obstante, la LLF-2, que contenía únicamente taninos, fue la que presentó una inhibición significativa en comparación con su extracto total. Estas inhibiciones de la PLA2 por los extractos de P. major y P. aduncum son promisorias en la búsqueda de compuestos antiinflamatorios.

Agradecimiento

Los autores del presente artículo agradecen al Dr. Miguel Zaldívar Arias, por las facilidades y apoyo otorgado para la realización del presente trabajo, durante el periodo de su jefatura en el Laboratorio de Investigación de Bioquímica y Principios Activos Naturales de la Facultad de Medicina Hipólito Unanue de la Universidad Nacional Federico Villarreal. También a la magíster María Isabel La Torre Acuy, por su colaboración en la identificación taxonómica de las especies vegetales usadas en esta investigación.

Financiamiento.: Este proyecto de investigación fue subvencionado por el Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Federico Villarreal, con recursos determinados CANON 2018-UNFV.

Citar como: Yarleque-Chocas M, Dorregaray-Llerena F, Yarleque-Chocas A, Gonzales-Chavesta C. Actividad antiinflamatoria in vitro de Plantago major L. y Piper aduncum L. sobre la fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente Lachesis muta muta. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2023;40(3):325-32. doi: 10.17843/rpmesp.2023.403.12191.

12

Los resultados preliminares del presente estudio fueron presentados al VI Congreso Latinoamericano de Plantas Medicinales en la modalidad de póster: Efecto de los extractos alcohólicos de plantas medicinales sobre la Fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta «shushupe» (doi: 10.13140/RG.2.2.19737.16480).

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