Abstract
冷冻干燥是一种使生物样本在干燥状态下保存的技术，有利于储存、运输并节省成本。本文使用聚乙二醇（PEG）和海藻糖（Tre）组成的冻干保护剂处理牛心包，进行冷冻干燥。结果表明：使用PEG + 10% w/v Tre处理牛心包进行冷冻干燥后，其力学性能优于使用戊二醛（GA）固定的牛心包。卡尔费休法测定，牛心包复水后的湿态含水量为（74.81 ± 1.44）%，与GA固定的牛心包无明显差异。干态含水量为（8.64 ± 1.52）%，说明在冷冻干燥过程中能有效脱水。差示扫描量热仪（DSC）的测试结果显示，牛心包的热皱缩温度为（84.96 ± 0.49）℃比GA固定的牛心包（83.14 ± 0.11）℃高，说明具有更高的热稳定性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果显示，在冷冻干燥过程中，蛋白质结构并未受到破坏。苏木精-伊红（HE）染色表明，冷冻干燥过程可以减少孔隙的产生，防止冰晶的生长，使组织纤维结构排列更紧密。细胞存活率与溶血率检测结果显示，细胞增殖率为（77.87 ± 0.49）%，毒性分级为1级，溶血率为（0.17 ± 0.02）%，低于5%的标准，即经过冷冻干燥处理的牛心包在细胞毒性和溶血方面表现良好，符合相关标准。综上，使用PEG + 10% w/v Tre处理牛心包进行冷冻干燥后的性能符合要求。
Keywords: 冷冻干燥, 力学性能, 热皱缩温度, 聚乙二醇, 海藻糖
Abstract
The freeze-drying is a technology that preserves biological samples in a dry state, which is beneficial for storage, transportation, and cost saving. In this study, the bovine pericardium was treated with a freeze-drying protectant composed of polyethylene glycol (PEG) and trehalose (Tre), and then freeze-dried. The results demonstrated that the mechanical properties of the pericardium treated with PEG + 10% w/v Tre were superior to those of the pericardium fixed with glutaraldehyde (GA). The wet state water content of the rehydrated pericardium, determined using the Karl Fischer method, was (74.81 ± 1.44)%, which was comparable to that of the GA-fixed pericardium. The dry state water content was significantly reduced to (8.64 ± 1.52)%, indicating effective dehydration during the freeze-drying process. Differential scanning calorimetry (DSC) testing revealed that the thermal shrinkage temperature of the pericardium was (84.96 ± 0.49) ℃, higher than that of the GA-fixed pericardium (83.14 ± 0.11) ℃, indicating greater thermal stability. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) results showed no damage to the protein structure during freeze-drying. Hematoxylin and eosin (HE) staining demonstrated that the freeze-drying process reduced pore formation, prevented ice crystal growth, and resulted in a tighter arrangement of tissue fibers. The frozen-dried bovine pericardium was subjected to tests for cell viability and hemolysis rate. The results revealed a cell proliferation rate of (77.87 ± 0.49)%, corresponding to a toxicity grade of 1. Additionally, the hemolysis rate was (0.17 ± 0.02)%, which is below the standard of 5%. These findings indicated that the frozen-dried bovine pericardium exhibited satisfactory performance in terms of cytotoxicity and hemolysis, thus meeting the relevant standards. In summary, the performance of the bovine pericardium treated with PEG + 10% w/v Tre and subjected to freeze-drying could meet the required standards.
Keywords: Freeze drying, Mechanical property, Thermal shrinkage temperature, Polyethylene glycol, Trehalose
0. 引言
心血管疾病是导致人群死亡的重要原因[1]，瓣膜性心脏病又是常见的心血管疾病之一，主要症状有瓣膜狭窄、反流[2-3]。研究表明，中国大约有2 500万的患者患有心脏瓣膜病[4]，美国每年大约有30万人需要做心脏瓣膜手术[5]，并且由于老年人口的增加，预计到2050年大约有80万人需要做心脏瓣膜手术[6-7]。目前，有效的治疗方式是人工心脏瓣膜置换，主要包括机械瓣膜和人工生物心脏瓣膜[8-9]。由于人工生物心脏瓣膜与机械瓣膜相比具有良好的生物相容性和血流动力学性能，因此人工生物瓣膜的使用频率高于机械瓣膜[10-11]。心包主要由胶原蛋白、纤维及心脏周围组织组成[12-13]，心包的胶原纤维具有多层结构且每层的排列方向不同，使心包具有优异的机械性能，因此常用来作为生物瓣膜的原材料。目前，常用的生物瓣膜主要使用0.625%戊二醛（glutaraldehyde，GA）固定的牛心包或猪心包制成[14-15]。
目前，牛心包材料有玻璃化保存或者在–80℃下保存等低温保存方式[16-17]，但在心包保存过程中会造成不利影响，如细胞活力与线粒体形态的受损[18]，以及生物力学性能的改变和冰晶形成破坏细胞外基质等[19-20]。冷冻干燥技术是使组织材料、蛋白质药物或疫苗在干燥状态下保存的技术[21]，主要分为预冷、一次干燥、二次干燥等阶段[22]。冷冻干燥技术已广泛应用于药品及食品领域[23]，最近，也有研究应用于牛心包的保存研究[24]。Wang等[25]与Goecke等[26]使用蔗糖作为冻干保护剂对猪瓣膜进行冷冻干燥，发现瓣膜经复水后，冻干的瓣膜具有良好的组织结构和细胞再生的能力。因此，冷冻干燥是替代低温保存的有效方法，可以保持细胞质基质的结构，并能在室温下保存，达到降低储藏与运输成本的目的。目前，常用的冻干保护剂主要有糖、醇、聚合物、氨基酸等[27]。
本文通过添加聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和海藻糖（trehalose，Tre）组成的冻干保护剂对经GA固定的心包进行处理并冷冻干燥，研究冷冻干燥后牛心包的厚度、力学性能、组织学形态、含水量、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）等方法，对牛心包冷冻干燥后的性能进行初步探讨。
1. 材料与方法
1.1. 材料与试剂
小鼠成纤维细胞（L929细胞）（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），新鲜兔血与抗凝剂（上海安助医疗科技有限公司），聚乙二醇（Adams，瑞士）、海藻糖（Adamas，瑞士），卡尔费休试剂（honeywell，德国）、无水甲醇（honeywell，德国），噻唑蓝（MTT，Sigma公司，美国），胎牛血清（Corning公司，美国），MEM培养基（HyClone公司，美国），异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，中国），生理盐水（河南科伦药业有限公司，中国），牛心包由微创心通医疗科技有限公司提供。
1.2. 仪器
冷冻干燥机（Advantage 2.0 Benchtop Freeze Drye，美国），万能材料试验机（E1F1G1-5943，ISTRON公司，美国），傅里叶红外光谱仪（Thermo Nicolet iS5，美国），卡氏水分仪（Metrohm，瑞士），显微镜（BX40,日本），酶标仪（SYNERGYH1，Thermo Fisher公司，美国），恒温摇床（THZ100，中国），测厚仪（CHB10120，中国）。
2. 试验方法
2.1. 冷冻干燥保护剂的配制
将PEG与不同浓度的Tre溶液混合配置成不同浓度的混合冻干保护剂，具体浓度为5% w/v、10% w/v、15% w/v的海藻糖溶液混合，GA固定处理的心包为对照组。
2.2. 牛心包的处理
将牛心包经生理盐水冲洗5 min，共3次，去除掉心包上残留的GA，将牛心包放入冻干保护剂中浸泡，置于恒温摇床上震荡，条件设置为37 ℃、70 r/min、4 h。
牛心包放入冷冻干燥机中并冷冻干燥，冷冻干燥程序参考Wang等[25]的方法进行修改，具体参数设置为：预冷温度设置–40 ℃，时间300 min；一次干燥温度设置–30 ℃，时间设置1 200 min，压强15 Pa；二次干燥温度设置20 ℃，时间设置360 min，压强15 Pa；冷冻干燥完成后牛心包经环氧乙烷灭菌后进行性能测定。
2.3. 测定指标
2.3.1. 心包厚度测定
使用测厚仪测定心包冷冻干燥前后的厚度值（n = 6），每片心包测定4个点，用测厚仪读取10 s后的数值，对冷冻干燥前后的厚度进行比较测定。
2.3.2. 力学性能的测定
（1）断裂性能：将心包裁剪成5 mm × 25 mm的心包条（n = 6），使用测厚仪记录心包条的厚度，通过万能材料试验机以拉伸速率100 mm/min的速度进行拉伸，测定心包冷冻干燥后断裂力、断裂强度、断裂伸长率的变化。
（2）破裂性能：将心包裁剪成33 mm × 33 mm的心包片（n = 6），使用测厚仪记录心包片的厚度，通过万能材料试验机以压缩速率100 mm/min对心包进行压缩，测定心包冷冻干燥后破裂力、破裂强度的变化。
（3）应力-应变曲线：根据牛心包在拉伸时的数据计算出牛心包的应力、应变。根据应力-应变曲线（见图1）计算出牛心包的弹性模量与极限抗拉强度。
图 1.
Stress-strain curve
应力-应变曲线
2.3.3. 牛心包含水量的测定
在测定心包含水量前，使用超纯水进行滴定度测定（3次），滴定结果为4.5～5.5 mg/mL时符合反应条件，对心包进行含水量的测定；剪取30～50 mg的牛心包样品放入样品瓶（n = 10），放入卡氏炉中在氮气氛围下进行加热，氮气流速为50 mL/min，加热温度升至150 ℃使组织中的水分完全蒸发至卡氏反应炉中，在反应炉中水分通过与无水甲醇和卡尔费休试剂进行反应，通过卡尔费休库伦滴定法测定出牛心包的含水量。
2.3.4. 牛心包热稳定性测定
将冷冻干燥后的牛心包样品经生理盐水复水后，将牛心包剪成5～10 mg的块状，使用差示扫描量热仪对心包进行热皱缩温度的分析，升温范围为20～100 ℃，升温速率为10 ℃/min。
2.3.5. 牛心包傅里叶红外变换光谱扫描
通过红外光谱对冷冻干燥后的心包进行表征处理，测定蛋白质结构的变化。将冷冻干燥后的心包进行裁剪1 cm × 1 cm的小块，对心包进行扫描处理，红外光谱的扫描范围为4 000～400 cm−1，分辨率4 cm−1，扫描次数32次。
2.3.6. 苏木精-伊红染色
对冷冻干燥的牛心包进行组织学评价，使用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察心包的组织形态，将冷冻干燥后的心包裁剪成1 cm × 1 cm的小样，石蜡包埋、切片，经HE染色后，将制成的切片置于光学显微镜下观察心包的组织形态并拍照。
2.3.7. 体外细胞毒性评价
依据GB/T 16886.5医疗器械标准规范进行细胞毒性检测，选择MTT细胞毒性实验对冷冻干燥后的心包材料进行细胞毒性检测。选取细胞浓度为1 × 105/mL的L929细胞，在96孔板中接种100 μL，放在二氧化碳培养箱中培养24 h，吸出培养基，每孔分别加入100 μL的空白对照液、阴性对照液、阳性对照液、样品浸提液，再次培养24 h，弃去培养液加入50 μL的MTT溶液孵育2 h；弃去孔内液体，加入100 μL异丙醇，震荡混匀，用酶标仪在570 nm出测定吸光度，计算细胞的存活率。细胞增殖率大于等于75%时，即细胞毒性小于等于1级时符合标准规范。
2.3.8. 溶血性能测定
依据GB/T 16886.4医疗器械标准规范进行溶血性能的检测，将经过环氧乙烷灭菌的牛心包材料按照6 cm2/L的比例加入浸提介质，与阴性对照组、阳性对照组一起放入37 ℃水浴锅中孵育30 min，取出后按照6 cm2/L的比例加入新鲜抗凝兔血、在37 ℃水浴孵育60 min，吸出管内液体以800 g离心5 min，取上清液，用酶标仪在545 nm处测定吸光度并计算溶血率。
2.4. 统计学分析
实验数据均使用GraphPad Prism10.0软件进行统计学数据处理，多组数据之间采用单因素方差分析（one-way ANOVA检验），两组数据比较间采用t检验；数据均表示为均值 ± 标准差，检验水准为0.05。
3. 结果与讨论
3.1. 厚度
图2为测定的牛心包冻干前后的厚度。冷冻干燥后的牛心包经复水10 min后与冻干的牛心包相比，冻干的牛心包厚度更薄（P < 0.05），说明心包在冷冻干燥过程中能有效脱水，导致厚度变薄。
图 2.
Thickness of bovine pericardium before and after freeze-drying (*P < 0.05)
牛心包冷冻干燥前后的厚度（*P < 0.05）
3.2. 力学性能
3.2.1. 断裂性能
牛心包的断裂性能如图3所示。图3a、b显示冷冻干燥后的牛心包断裂性能优于GA固定的牛心包，可以承受更高强度的力；图3c显示GA组和冻干保护剂组牛心包后的断裂伸长率无明显差异。
图 3.
Fracture properties of bovine pericardium after freeze-drying
牛心包冷冻干燥后的断裂性能
a. 断裂力；b. 断裂强度；c. 断裂伸长率；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns表示无显著差异
a. breaking force; b. breaking strength; c. breaking elongation; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns means no significant difference
3.2.2. 破裂性能
牛心包的破裂性能如图4所示。图4a为牛心包冷冻干燥后的破裂力，各组间均无明显差异；图4b为牛心包的破裂强度，冻干保护剂组的牛心包破裂强度均优于GA组，说明牛心包在冷冻干燥过程中有水分流失造成厚度减薄，图2的结果再次得以证实。
图 4.
Rupture properties of bovine pericardium after freeze-drying
牛心包冷冻干燥后的破裂性能
a. 破裂力；b. 破裂强度；***P < 0.001，****P < 0.000 1，ns表示无显著差异
a. rupture force; b. rupture strength; ***P < 0.001, ****P < 0.000 1, ns means no significant difference
3.2.3. 应力-应变曲线
应力-应变曲线主要反映弹性模量与抗拉强度的大小，如图5所示。图5a为牛心包的弹性模量，PEG + 10% w/v Tre组的弹性模量优于GA组和其余实验组，说明PEG + 10% w/v Tre组处理的牛心包具有更好的抵抗形变的能力；图5b为牛心包的极限抗拉强度，PEG + 10% w/v Tre组的极限抗拉强度优于其他实验组与对照组，说明PEG + 10% w/v Tre组牛心包经冷冻干燥后增强了机械性能，可以承受更高的负荷。
图 5.
Elastic modulus and ultimate tensile strength of bovine pericardium after freeze-drying
牛心包冷冻干燥后的弹性模量及极限抗拉强度
a. 弹性模量；b. 极限抗拉强度；*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.000 1，ns表示无显著差异
a. elastic modulus; b. ultimate tensile strength; *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1, ns means no significant difference
3.3. 含水量
图6为通过卡尔费休库伦滴定法测定牛心包的含水量。各组牛心包的湿态含水量非常接近（P > 0.05），如图6a所示，说明冻干后的牛心包能够快速复水；图6b为牛心包的干态含水量，PEG + 5%Tre、PEG + 10%Tre、PEG + 15%Tre组的结果分别为：（8.10 ± 1.01）%、（8.64 ± 1.52）%、（8.31 ± 0.51）%（P > 0.05），表明冻干保护剂处理的牛心包在冻干的过程中能够有效脱水。
图 6.
Water content of bovine pericardium after freeze-drying
牛心包冷冻干燥后的含水量
a. 复水后的湿态含水量；b. 干态含水量；ns表示无显著差异
a. wet water content after rehydration; b. dry water content; ns means no significant difference
3.4. 热皱缩温度
热皱缩温度说明蛋白质的热稳定性，冻干后牛心包的热皱缩温度如图7所示。图7a表示牛心包在使用差示扫描量热仪测试过程中的升温曲线，根据曲线可以测定牛心包的热皱缩温度，如图7b所示。图7b显示使用冻干保护剂处理的牛心包的热皱缩温度优于GA固定的牛心包。图7c为牛心包冻干后的热焓值。冻干保护剂组牛心包的热焓值高于GA组，说明在冻干保护剂处理牛心包的过程中可促进内部胶原蛋白质的交联，使胶原蛋白的热稳定性增加，这与图7a结果一致，说明冻干保护剂对牛心包的处理可以增加牛心包的热稳定性，稳定蛋白质结构。
图 7.
DSC results of GA, PEG + 5%w/v Tre, PEG + 10%w/v Tre and PEG + 15%w/v Tre groups
牛心包冷冻干燥后的DSC结果
a. 牛心包的升温曲线；b. 热皱缩温度；c. 热焓；**P < 0.01，***P < 0.001
a. DSC thermophysical properties curve; b. thermal shrinkage temperature; c. enthalpy; **P < 0.01, ***P < 0.001
3.5. 傅里叶红外变换光谱
胶原蛋白在傅里叶红外变换光谱中具有明显的吸收峰，如位于1 655 cm−1、1 560 cm−1处的酰胺I、酰胺II光谱带及以1 245 cm−1为中心的酰胺III[28]。通过FTIR光谱可以判断蛋白质结构的改变，牛心包胶原蛋白的吸收峰在1 630～1 600 cm−1处[29]。图8中各组红外光谱在1 630～1 600 cm−1处均有相同的吸收峰，表明牛心包在冷冻干燥过程中不会破坏胶原蛋白结构。FTIR光谱在3 393～3 317 cm−1存在差异，造成原因可能是―OH键的拉伸；在2 869～2 857 cm−1处冻干保护剂处理的牛心包具有明显的峰，可能是―CH与胶原蛋白反应，拉伸导致出现不同强度的峰。
图 8.
Fourier transform infrared spectrum of bovine pericardium
牛心包傅里叶变换红外光谱
3.6. HE染色
图9为牛心包冻干后的HE染色结果。可见GA固定的牛心包组冷冻干燥后，胶原纤维排列疏松、纤维间的孔隙较大，推测在冷冻干燥过程中有冰晶产生，导致孔隙增大；冻干保护剂处理的牛心包，HE染色表明胶原纤维排列紧密、孔隙较小，说明冻干保护剂的添加在冻干过程中可以减少冰晶的产生，使组织纤维排列紧凑。
图 9.
HE staining of bovine pericardium
牛心包的HE染色图
3.7. 细胞毒性评价
根据牛心包力学性能的检测结果，选取性能最优的PEG + 10% w/v Tre组处理的牛心包进行细胞毒性的检测，采用MTT法检测细胞毒性实验，其细胞毒为（77.87 ± 0.49）%，为1级，符合GB/T 16886.3标准规范。
3.8. 溶血性评价
使用酶标仪测定的吸光度计算其溶血率，PEG + 10% w/v Tre组处理的牛心包测得的溶血率为（0.17 ± 0.02）%，其结果低于5%，符合GB/T 16886.4-2003的医疗标准。
4. 讨论与结论
瓣膜在冷冻保存过程中会出现冰晶产生、机械性能降低等问题[19-20]，因而在临床应用中受到限制。而本文通过使用PEG与Tre组成的冻干保护剂对牛心包进行冷冻干燥，保留了牛心包的基本性能，为其临床应用提供了基础研究信息。
力学研究表明，冻干保护剂处理的牛心包力学性能在整体上优于GA固定的牛心包，力学性能的差异与胶原纤维的排列结构相关[30]，冻干保护剂处理的牛心包在冻干后，HE结果显示组织纤维结构排列紧密，导致牛心包力学性能的改变；冻干后牛心包的弹性模量与极限抗拉强度的提高，表明牛心包可以抵抗更大的形变并可以承受更高负荷。FTIR结果表明，冻干的过程不会破坏蛋白质结构，会保留原有的组织结构；热皱缩温度检测结果显示冻干保护剂在处理牛心包的过程中促进了内部胶原蛋白之间的交联，使牛心包的热稳定性升高。
综上，冷冻干燥技术是一种用于生物组织材料保存的有效方式，对各种生物医学应用具有重要意义以及巨大的潜力。本文使用糖与醇等组成的冻干保护剂对牛心包进行冷冻干燥，冻干后的牛心包表现出更好的机械性能、细胞增殖、血液相容性和组织结构的完整性，展示了冻干瓣膜具有广阔的应用前景。但是，要将冻干的瓣膜用于临床，需进一步对牛心包进行性能研究，如抗钙化能力、体内动物实验等。由于冷冻干燥保存的瓣膜易于储存、运输，未来有望成为临床的首要选择。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：黄伟参与了论文的选题、实验设计、数据采集和分析、论文写作；李维杰和刘宝林参与了论文的选题、实验设计、论文内容指导和论文修改。
Funding Statement
上海市肿瘤能量治疗技术与器械协同创新中心
Shanghai Co-innovation Center for Energy Therapy of Tumors
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