SPHK1靶向NF-κB信号通路调控胃癌细胞的迁移与侵袭

Abstract

目的

探讨鞘氨醇激酶-1（SPHK1）在胃癌（GC）组织中的表达及其靶向核因子-κB（NF-κB）调控GC细胞迁移和侵袭能力的分子机制。

方法

基于TIMER2.0、GEPIA与HPA数据库分析SPHK1在GC组织中的表达。使用Kaplan-Meier Plotter数据库预测SPHK1与GC患者预后的关联。利用IHC检测GC及癌旁组织中SPHK1和MKI67的表达并分析两者相关性。运用Western blotting与qRT-PCR检测GC各细胞系中SPHK1蛋白及mRNA水平。基因富集通路数据库检索SPHK1对GC进展的生物学功能。使用慢病毒敲低HGC-27/过表达MGC-803细胞中SPHK1的表达；采用细胞划痕实验探究SPHK1对GC细胞迁移能力的影响；Transwell实验探究SPHK1对GC细胞迁移和侵袭能力的作用；通过Western blotting检测各蛋白表达情况。体内成瘤实验中，将裸鼠随机分为shNC组、shSPHK1组、oeNC组与oeSPHK1组，利用稳转株验证SPHK1的促癌作用。

结果

生物信息学表明SPHK1在GC组织中显著高表达（P<0.001）；同时高表达的SPHK1预示着较差的总生存期（P<0.001）和进展后总生存期（P<0.001）以及更差的无复发生存期（P<0.001）。IHC结果表明GC组织中SPHK1与MKI67表达明显上调（P<0.001）且呈正相关（P<0.001）。基因富集通路数据库提示，SPHK1参与GC中的细胞黏附、迁移及血管生成等，且NF-κB参与GC进展（P<0.05）。细胞实验数据显示，抑制SPHK1减弱GC细胞的迁移和侵袭能力，而过表达SPHK1会产生相反的结果（P<0.01）；SPHK1正向调节磷酸化P65 （p-P65）、血管内皮生长因子（VEGFA）和白细胞介素（IL-17）蛋白表达（P<0.05）；利用PDTC阻断NF-κB信号通路可削弱SPHK1促进的GC细胞迁移与侵袭能力以及各蛋白表达水平（P<0.01）；动物实验表明，与NC组相比，shSPHK1组肿瘤大小和质量明显减小，而oeSPHK1组显著增加（P<0.001）。

结论

SPHK1可靶向NF-κB信号通路表达进而调控GC细胞的迁移与侵袭，提示SPHK1可能是GC进展的潜在诊断分子标志物。

胃癌（GC）是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一^［1］。据调查，GC在全球发病率呈逐年递增趋势^［2］。其发病率和死亡率在中国所有癌症类型中排名第3，占全球GC新发病例和相关死亡病例的44.0%和48.6%^［3］。GC患者多采用手术治疗、放化疗以及免疫治疗，但临床疗效及预后不佳^［4，5］。高侵袭与转移性能力是肿瘤保持恶性的重要特征。然而到目前为止，导致癌症转移的复杂机制还远远没有被完全理解。因此，为明确GC转移机制急需寻找潜在的治疗靶点。

鞘氨醇激酶1（SPHK1）是一种保守的脂质激酶，可将鞘氨醇磷酸化进而生成鞘氨醇-1-磷酸，已被发现在肿瘤进展不同阶段中发挥着各种功能^［6］。SPHK1是SPHK家族蛋白中的一员，是介导细胞各个方面的关键信号分子，并在多种致癌过程中发挥核心作用，包括细胞增殖、迁移与侵袭^{［7， 8］}。据研究，SPHK1是结直肠癌细胞中的激活因子，通过调控特定信号通路表达来促进癌症发生发展^［9-11］。在胰腺癌组织中，SPHK1表达上升，并通过分析患者ROC曲线表明低生存率与高表达的SPHK1密切相关^［12］。SPHK1在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调。过表达SPHK1增加了癌细胞的增殖和迁移能力^［13］。核因子-κB（NF-κB）是转录因子家族中的一员，是免疫、炎症和癌症的关键调节因子^［14］。抑制鼻咽癌细胞中NF-κB信号转导作用，可大大降低靶基因对癌细胞的增殖、侵袭能力^［15］。同时，NF-κB通路的激活增加了卵巢癌中TRIM52对肿瘤介导的恶性行为^［16］。然而，尚不清楚SPHK1是否与GC恶性进展过程中的NF-κB信号通路有关，因而需要对SPHK1进行深入探究。本研究旨在利用生物数据库与体内外实验分析SPHK1在GC发生发展中的作用及其潜在的通路分子机制，从而为GC治疗带来新方向。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 患者样本

选取2023年6月~12月在蚌埠医科大学第一附属医院胃肠外科行手术切除的GC患者40例（男28例，女12例，年龄35~75岁），经患者术前书面知情同意后获得该40例患者的非癌性胃组织样本（术中病理切片结果证实为正常组织）纳入本研究。从医疗记录中检索患者临床特征，包括性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤分期等（表1）。本研究经蚌埠医科大学伦理委员会批准［伦理批号： 第（2023）311，（2023）405号］。

表1.

SPHK1在GC中的表达与临床病理特征的关系

Tab.1 Clinicopathological characteristics of GC patients (n=40)

Characteristic	Clinicopathological characteristics
	n	Percentage (%)
Gender
Male	28	70
Female	12	30
Age (year)
≥60	24	60
<60	16	40
Tumor size (cm)
≥5.0	22	55
<5.0	18	45
Clinical stage
I+II	14	35
III+IV	26	65
N stage
N0	10	25
N1+N2+N3	30	75

1.1.2. 主要试剂

PDTC（MCE）；RPMI 1640培养基、胰酶、胎牛血清（Gibco）；小鼠多克隆抗体SPHK1、P65、p-P65、p-PI3K、MKI67以及单克隆抗体GAPDH、PI3K、VEGFA、IL-17 （Proteintech）；总RNA提取试剂盒、逆转录、定量PCR试剂盒（Novoprotein）。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。慢病毒合成于上海吉玛制药技术有限公司。

1.2. 方法

1.2.1. 公共数据库检索

TIMER2.0 （http：//timer.cistrome.org）数据库分析SPHK1在泛癌中的表达。GEPIA（http：//gepia. cancer-pku.cn）数据库搜索SPHK1相关基因表达及关联。HPA（https：//www.proteinatlas.org）数据库检索SPHK1与MKI67的IHC结果。Kaplan-Meier plotter（https：//kmplot.com）数据库预测GC患者预后。cBioportal（https：//www.cbioportal.org）数据库下载与SPHK1在GC中共表达的前500个潜在靶基因。DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）数据库分析检索生物富集通路。微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）网站在线编辑处理下载数据并产生气泡图。KEGG （https：//www. kegg.jp）数据库检索相关信号通路。

1.2.2. 免疫组织化学（IHC）

IHC检测组织中SPHK1与MKI67的表达。临床40例GC组织和40例匹配的非癌性组织按照标准程序进行操作。具体步骤如固定、脱水、包埋、制片、染色等，经一抗（SPHK1/1∶200，MKI67/1∶2000）、二抗（山羊抗兔ZSGB-BIO/1∶3000）孵育后进行DAB染色，然后显色并采集图片评分。所有切片由2名病理科医师独立进行盲审评分。同样染色操作评分可参考张浩等^［17］的研究。

1.2.3. 细胞培养

人GC细胞株MGC-803、AGS、MKN-1、HGC-27与正常胃上皮细胞GES-1均购自中国科学院上海生命科学研究院，均在RPMI 1640完全培养液中于37 ℃、5%CO₂的恒温细胞培养箱中培养，待细胞生长至合适密度时消化传代。

1.2.4. Western blotting

提取细胞蛋白并进行浓度测定。取等量的蛋白样品进行电泳，电泳完成后将蛋白凝胶转移至0.45 μm的PVDF膜上进行转膜。结束后将其浸入封闭液中封闭60 min。3次洗膜后，加入稀释相应一抗并在４℃冰箱中过夜孵育。次日洗膜，与二抗稀释室温摇床孵育90 min。洗膜后检测PVDF膜上的蛋白印迹信号。

1.2.5. qRT-PCR

提取细胞RNA并测定浓度和纯度，将其逆转录为cDNA。将得到的cDNA以GAPDH为内参，按照试剂盒操作方法进行qRT-PCR，检测目的基因表达情况。采用相对定量的方法（2^-ΔΔCT） 计算基因的mRNA表达水平。相应引物序列如下：SPHK1引物上游：5'-TGGCATCTGCTGAACTCATTT-3'；下游：5'-TGC AGCGAGGTCTAATTGTTT-3'；GAPDH引物上游：5'-GAGAAGTATGACA CAGCCTCAA-3'；下游：5'-GC CATCACGCCTG ACA GTTT-3'。

1.2.6. SPHK1的RNA干扰和过表达

将人GC细胞系HGC-27与MGC-803进行铺板，当培养密度达到70%~80%，然后分别采用SPHK1干扰（载体：GV382）、过表达（载体：GV492）和对照慢病毒载体对上述细胞进行敲低与过表达转染，6 h后更换含培养基，3 d后用含1 μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选稳定表达细胞株。针对SPHK1慢病毒转染序列如表2。

表2.

RNA干扰和过表达序列

Tab.2 Sequences for RNA interference or gene overexpression

Item	Sequences (5'-3')
shNC	GAGTCTATGACATTGCCTCA
shSPHK1#1	CTTCGTGTCAGATGTTGGATAT
shSPHK1#2	GCTTTGCCCTCACCCTTACAT
shSPHK1#3	GCTTTGCCCTCACCCTTACAT
oeNC	CGCATCTAGCCTGTCAGTCC
oeSPHK1#1	CTCGTGTCAGATATTGGTTAT
oeSPHK1#2	ATTGTGTGAGACATCCGTAAG
oeSPHK1#3	TTGAGTCCTGCTTCTTCATTG

1.2.7. 细胞划痕实验

调整细胞密度为2.0×10⁶/孔后铺板于6孔板中，待显微镜下观察细胞融合成单层状态时，用无菌200 μL枪头在孔内垂直均匀划线，继续置于培养箱中培养。在0、24 h时通过倒置显微镜（放大倍数×40）观察并随机分5个区域拍照，得到的图片通过Image J 软件进行处理并计算划痕迁移率。

1.2.8. Transwell 迁移和侵袭实验

将悬浮于0.2 mL的无血清培养基中的稳转株细胞置于Transwell板的上孔（1×10⁴/孔），将含有0.6 mL的完全培养基装入下孔。37 ℃培养24 h后，用棉签将上腔的细胞完全去除，将下腔的细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%结晶紫染色。然后在倒置显微镜（放大倍数×200）上随机分5个区域拍照计数，取平均值。对于侵袭试验，实验过程与迁移试验相似，只是在细胞装载之前，Transwell上孔加入50 μL的基质胶并孵育1 h。

1.2.9. 裸鼠背部成瘤模型

4~5周龄雌性裸鼠12只购自杭州子源实验动物科技有限公司，在SPF环境下饲养。将裸鼠随机分为4组（n=3）：shNC组、shSPHK1组、oeNC组和oeSPHK1组。将构建稳转株或GC细胞200 μL（2×10⁷/只）皮下注射于裸鼠背部。2周后，在麻醉（0.7%戊巴比妥钠）下，采用颈椎脱臼法处死小鼠。然后，切除异种移植肿瘤，拍照并称重。本研究经蚌埠医科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：第［（2023）574］号）。

1.3. 统计学处理

所有统计数据采用Prism 9.0（Graphpad Software）、ImageJ软件进行分析。数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析检验、两样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均重复3次。

2. 结果

2.1. SPHK1在GC组织中的表达

基于TIMER2.0数据库，SPHK1表达水平在15种癌症类型中上调，在2种癌症类型中下调，其中在GC组织中表达（P<0.001，图1A）。利用GEPIA数据库，SPHK1与MKI67在GC组织（n=408）中的表达水平均高于正常组织（n=211）（P<0.05，图1B）。此外，两者表达水平呈正相关（P<0.001，图1C）。HPA数据库显示，GC组织中SPHK1与MKI67的染色程度上调（图1D、E）。

图1.

SPHK1在GC组织中的表达

Fig.1 Expression of SPHK1 in GC tissues. A: Expression of SPHK1 in pan-cancer based on data retrieved from TIMER2.0 database. B: Expression of SPHK1 and MKI67 in GC tissues based on data retrieved from GEPIA database. C: GEPIA database analysis of the correlation between SPHK1 and MKI67. D, E: Immunohistochemical staining for SPHK1 and MKI67 in GC tissues from HPA database. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs Tumor group.

2.2. SPHK1表达与GC患者预后的关联

GC患者中高表达的SPHK1预示着较差的总生存期（OS，P<0.001，图2A）和进展后总生存期（PPS，P<0.001，图2B）以及更差的无复发生存期（RFS，P<0.001，图2C）。

图2.

SPHK1表达与GC患者预后的关联

Fig.2 Association of SPHK1 expression with overall survival (OS; A), post-progression survival (PPS; B) and recurrence-free survival (RFS; C) of GC patients predicted using Kaplan-Meier Plotter database.

2.3. GC组织中SPHK1表达的上调

IHC结果显示，SPHK1与MKI67在GC组织的阳性染色强度均高于非癌性胃组织（图3A）。GC组织切片中SPHK1与MKI67蛋白的综合染色评分也高于正常组织切片（P<0.001，图3B）。同时，两种蛋白相对表达量呈的正相关（P<0.0001，图3C）。此外，Western blotting与qRT-PCR结果显示，SPHK1在HGC-27细胞系中高表达，在MGC-803细胞系中低表达，差异有统计学意义（P<0.05，图3D、E）。

图3.

GC组织中SPHK1表达的上调

Fig.3 SPHK1 expression is upregulated in GC tissue. A: Immunohistochemical staining for detecting SPHK1 and MKI67 in clinical tissue samples (Original magnification:×200). B: Immunohistochemical score of SPHK1 and MKI67. ***P<0.001. C: Correlation between SPHK1 and MKI67 expressions. D: Western blotting for detecting the expression of SPHK1 protein. E: qRT-PCR for detecting the level of SPHK1 mRNA. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs GES-1 group.

2.4. SPHK1对GC细胞迁移与侵袭的影响

Western blotting结果显示，shSPHK1组SPHK1的表达下调（P<0.001），而oeSPHK1组SPHK1的表达上调（P<0.01，图4A）。shSPHK1组MKI67蛋白表达受到抑制（P<0.01），而oeSPHK1组的MKI67 蛋白表达上调（P<0.05，图4B）。此外，细胞划痕实验表明，与NC组相比，转染shSPHK1的HGC-27细胞在24 h时，细胞的迁移率降低，转染oeSPHK1的MGC-803细胞在24 h时，细胞的迁移率增加，差异有统计学意义（P<0.01，图4C、E）。Transwell侵袭实验显示，与NC组相比，shSPHK1组HGC-27细胞的侵袭能力减弱，oeSPHK1组MGC-803细胞的侵袭能力上调，差异有统计学意义（P<0.01，图4D、F）。此外，裸鼠成瘤实验显示，与NC组相比，shSPHK1组肿瘤大小和质量减小，而oeSPHK1组增加，差异有统计学意义（P<0.001，图4G、H）。

图4.

SPHK1对GC细胞迁移与侵袭的影响

Fig.4 Effect of SPHK1 knockdown or overexpression on GC cell migration and invasion. A: Western blotting for assessing efficiency of lentivirus-mediated SPHK1 knockdown and overexpression. B: Western blotting for detecting MKI67 protein levels. C, E: Cell scratch assay for assessing migration ability of the cells (×40). D, F: Transwell assays for assessing invasion ability of the cells (×200). G: Size of the subcutaneous tumors in nude mice. F: Weight of the subcutaneous tumors. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs NC group.

2.5. SPHK1靶向NF-κB信号通路

基于cBioportal数据库下载与SPHK1在GC中共表达的前500个潜在靶基因，DAVID数据库分析潜在靶基因并下载SPHK1mRNA富集相关数据，利用微生信网站处理并得出SPHK1相关潜在靶基因参与GC生物过程、细胞组成与分子功能中的细胞黏附、迁移及血管生成等（P<0.05，图5A）。KEGG通路显示NF-κB、PI3K富集其中（P<0.05，图5B）。与NC组相比，shSPHK1组抑制了磷酸化P65（p-P65）与PI3K（p-PI3K）水平，而总蛋白P65、PI3K无明显变化。VEGFA与IL-17表达水平也受到抑制（P<0.05，图5C、E）。相反，SPHK1过表达则增强了这一表现（P<0.05，图5D、F）。

图5.

SPHK1靶向NF-κB信号通路

Fig.5 SPHK1 targets the NF-κB signaling pathway. A: Results of GO enrichment analysis. B: Results of KEGG pathway enrichment analysis. C, E: Expression levels of NF-κB signaling pathway proteins after SPHK1 knockdown. D, F: Expression levels of the proteins after SPHK1 overexpression. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs NC group.

2.6. 阻断NF-κB信号通路，SPHK1对GC细胞的迁移与侵袭能力的影响

利用PDTC（NF-κB信号通路抑制剂）处理前期已构建的病毒稳转株细胞24 h。Transwell迁移与侵袭实验结果显示，与shSPHK1+DMSO组相比，shSPHK1+PDTC组的细胞迁移与侵袭能力下调（P<0.05，图6A）。与oeSPHK1+DMSO组相比，oeSPHK1+PDTC组的细胞迁移与侵袭能力也下调（P<0.05，图6B）。同样，p-P65、VEGFA和IL-17蛋白水平变化中，shSPHK1+PDTC组、oeSPHK1+PDTC组与对照组相比，其表达量下降，差异有统计学意义（P<0.05，图6C~F）。

图6.

阻断NF-κB信号通路, SPHK1对GC细胞的迁移与侵袭能力的影响

Fig.6 Effect of blocking the NF-κB signaling pathway on migration and invasion ability of GC cells with SPHK1 knockdown or overexpression. A, B: Transwell assay for assessing migration and invasion of GC cells treated with 100 nmol/L PDTC (a NF-κB pathway inhibitor) or DMSO for 24 h (×200). C-F: Western blotting for detecting the levels of P65, p-P65, VEGFA and IL-17 proteins.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 讨论

鞘氨醇激酶家族蛋白参与多种癌症进展过程^［18］，如S1PR1信号通过增强肿瘤细胞中趋化因子的表达来促进GC转移^［19］。SPHK1通过刺激Akt/FoxO3a 信号传导下调凋亡蛋白表达来抵抗GC细胞凋亡^［20］。SPHK2在GC组织中表达上调，对GC发挥致癌作用^{［21， 22］}。基于生物信息学分析，SPHK1在GC组织中的表达高于正常胃组织以及高表达的SPHK1预测更差的生存期。这与我们的研究结果一致，IHC结果显示SPHK1与MKI67在GC组织中表达上调且两者呈正相关。MKI67是肿瘤细胞恶性增殖因子。随着MKI67指标的建立，MKI67已发展成为癌症患者诊断和预后评估的标准^［23］。以上数据提示SPHK1可能是GC进展中的恶性因子。

远处转移是GC患者高死亡率的原因之一^［24］。肿瘤转移是一个多阶段的过程。肿瘤细胞的迁移和侵袭是转移过程中的关键环节^［25］。SPHK1在乳腺癌^［26］和前列腺癌^［27］中已经证明了肿瘤细胞的迁移和侵袭功能。与上述研究结果类似，我们的数据显示敲低SPHK1抑制GC细胞的迁移和侵袭，而过表达SPHK1则相反。此外，裸鼠背部成瘤实验结果显示敲低SPHK1可抑制肿瘤的生长，而过表达SPHK1则会加速肿瘤生长。据此，我们的研究数据进一步证实了SPHK1在肿瘤进展中的重要作用。据报道，SPHK1可激活多种癌症相关信号通路，如结直肠癌中的TRAF6/ULK1通路^［28］、膀胱癌中的NONO/STAT3通路^［6］以及非小细胞肺癌的JAK/mTOR通路^［13］。本课题主要研究集中在NF-κB通路，SPHK1对其它通路的影响将在我们未来的研究中深入挖掘。NF-κB信号通路在肿瘤相关活动中发挥重要作用，如细胞增殖、迁移与侵袭^{［29，30］}。靶向调控SPHK1转录激活NF-κB/p65磷酸化可促进结直癌进展^［31］。基因代谢组学分析显示SPHK1通过NF-κB激活促进口腔鳞状细胞癌的生长与转移^［32］。有研究发现，NF-κB/P65与GC恶性转移可能存在关联^［33］。在本研究中，SPHK1激活了GC细胞中磷酸化NF-κB信号通路。利用PDTC（NF-κB通路抑制剂）^{［34， 35］}干预SPHK1敲低和过表达细胞株，结果显示，抑制NF-κB信号通路后，SPHK1减弱了对GC细胞迁移与侵袭的作用，表明NF-κB参与了SPHK1介导的GC细胞的迁移、侵袭，继而提示SPHK1可能调控NF-κB促进GC的转移。VEGFA是重要的血管生成因子，与GC侵袭、转移有关^{［36， 37］}。IL-17与免疫细胞共同作用，促进肿瘤转移^［38］。VEGFA、IL-17可能是NF-κB信号通路的转录靶点^［39］。本研究显示，敲低SPHK1下调了p-P65、VEGFA和IL-17，而过表达SPHK1结果则相反。据此，我们推测SPHK1靶向NF-κB信号通路调节VEGFA/IL-17表达进而调控GC进展。然而本研究还存在一些不足之处：SPHK1激活NF-κB通路与其他相互作用蛋白共同调控促进GC转移的机制还亟需进一步探索。在裸鼠成瘤模型中亦未进行深入验证SPHK1调控NF-κB通路的促癌作用。

综上所述，本研究表明SPHK1在GC中表达上调，同时靶向NF-κB信号通路促进GC细胞的增殖、迁移与侵袭，继而促进肿瘤的发生发展。因此，SPHK1可作为GC患者治疗过潜在新靶点。

基金资助

安徽省高校科学研究重大项目（KJ2021ZD0090）；蚌埠医学院研究生科研创新项目（Byycx22090）；安徽省2023年度新时代育人质量工程（研究生教育）项目（2023xscx125）