慢性创面细菌生物膜形成机制及其诊断的研究进展

Abstract

Bacterial biofilms infection is one of the major factors causing delayed wound healing. Therefore, early diagnosis of bacterial biofilms is critical for successful cure of chronic wounds. Although many techniques have been developed to diagnose the free pathogens in infectious wounds, there is no technique which can quickly and accurately identify bacterial biofilms in wounds. In this paper, the mechanism of bacterial biofilm formation is briefly reviewed, and several potential diagnostic techniques for bacterial biofilms are introduced, which are expected to be a means of rapid diagnosis and monitoring of bacterial biofilms in wounds.

细菌生物膜是聚集在多糖基质中的微生物群落, 这种微生物群落通过协同作用增加致病性、对抗生素产生耐药、防止脱水和被吞噬, 从而延缓或阻止创面愈合^[1]。研究显示, 细菌生物膜在慢性创面中普遍存在（60%）, 而在急性伤口中少见（6%）^[2]。因此, 消除细菌生物膜是有效治疗慢性感染创面的关键。基于细菌生物膜的创面护理（BBWC）治疗理念在最近的创面治疗临床指南中被提出^[3]。BBWC建议：如果怀疑创面有细菌生物膜感染, 应该通过及时清创、使用敏感抗生素、应用抗细菌生物膜药物等手段来清除细菌生物膜。尽管越来越多的人认识到细菌生物膜会阻碍创面愈合, 但目前的诊断技术还不能准确识别细菌生物膜以及准确定位定植在创面的细菌生物膜, 所以BBWC这一治疗理念实施起来比较困难。本文总结了创面细菌生物膜的形成机制, 以及创面存在细菌生物膜定植的临床表现、创面细菌生物膜的取材方法, 旨在帮助临床医师准确识别细菌生物膜定植的创面及提高细菌生物膜检出率；同时介绍几种有潜力的诊断细菌生物膜的新技术, 这些技术在不久的将来有望准确识别和监测创面细菌生物膜, 从而进一步指导临床医师对慢性创面的治疗。

1. 细菌生物膜概述及形成机制

1.1. 细菌生物膜概述

细菌生物膜是包裹在胞外多糖或胞外聚合物（EPS）中的微生物结构化群落, 附着在物体表面上。生物膜结构具有保护作用, 可以提高细菌在恶劣环境中的存活率^[4]。细菌生物膜感染的一个特征是多种细菌同时存在, 多种细菌存在增加了其感染的毒力, 使治疗复杂化。

1.2. 细菌生物膜的形成机制

细菌生物膜的形成是动态的, 通常包括以下4个步骤^[5]：第1步是细菌通过其菌毛、鞭毛等表面附属物或特异性受体介导微生物可逆地附着到生物或非生物体表面；第2步是细菌通过分泌胞外多糖介导不可逆附着；第3步是细菌生长和分化, 形成具有水通道和高耸的细胞簇等特征结构的成熟细菌生物膜群落；最后一步是细菌生物膜播散。

在发育成熟的细菌生物膜中, EPS占生物膜体积的90%, 而细菌仅占10%^[6]。细菌生物膜的特性也与其分泌的EPS息息相关。生物膜EPS对菌落有多种作用, 其中最重要的是帮助细菌附着在生物或非生物体表面。EPS层相当于细菌居住的房间, 具有坚固的结构, 可以保护细菌免受外界环境的影响, 使得抗生素难以穿透。生物膜EPS还被认为可以保护细菌免受干燥影响, 促进离子交换, 储存和维持降解酶水平以及携带碳、氮和磷等营养物质。成熟的生物膜表现出特征性的结构, 如蘑菇塔样结构和水通道, 它们将营养物质和水带到生物膜的下层, 并可排出代谢废物^[7]。

细菌生物膜的形成及许多致病因子的产生都归因于通过群体感应进行的细胞间通讯^[8]。群体感应是基因突变的一个重要影响因素, 它促进游离细菌向生物膜生长模式转变及表达多种新的蛋白^[9]。细菌遗传和生理的变化与细菌在生物膜内部的位置有关。不同位置的氧、营养物质、代谢废物等浓度的变化有助于细菌的遗传变化和代谢活动^[10]。例如, 一个特定的基因可能会因为生物膜位置或深度的不同而有不同的表达水平。事实上, 生物膜内部的低氧和代谢活动都与生物膜的耐药性有关^[11]。细菌生物膜能够产生不同于细菌游离状态的蛋白质, 其中一些蛋白质有助于生物膜保护自己免受环境因素的影响^[12]。例如, 铜绿假单胞菌产生酰基同型丝氨酸和其他鼠李糖脂和胞外多糖, 它们对细菌互相黏附和EPS形成非常重要。同样, 生物膜通过大肠埃希菌产生的应激蛋白（RNA聚合酶Sigma）的表达来保护大肠埃希菌细胞免受pH、温度的影响, 而这种特定的蛋白质在生物膜的高密度区域被证明是上调的^[13]。

2. 创面细菌生物膜的诊断

创面感染细菌生物膜的有效诊断主要取决于以下3个方面：创面细菌生物膜的临床识别、创面细菌生物膜定位与标本采集、创面细菌生物膜检测技术。

2.1. 创面细菌生物膜的临床识别

创面细菌生物膜的临床识别对于慢性创面的治疗非常重要, 临床医师主要通过患者病史以及对创面观察评估识别细菌生物膜感染的创面, 诊断性治疗有效与否也是通过对创面观察评估来判断的。2019年创面愈合协会世界联合会就创面可能感染细菌生物膜的若干临床指标达成了共识, 提出了有如下情况时可能存在细菌生物膜^{[1, 14]}。（1）给予营养支持的同时, 经局部或全身应用抗菌药物、抗菌敷料、创面常规处理等治疗后创面仍无愈合迹象。（2）在应用抗生素有效的情况下, 停用抗生素后创面愈合停滞、局部或全身感染症状再次出现。（3）创基苍白或轻微红肿, 大量的黄色渗液或分泌物, 可伴有恶臭气味的坏死组织, 肉芽组织质量差。（4）经创面定期清创、抗菌敷料、敏感抗菌药物和细菌生物膜清除药物等诊断性治疗有效。临床医师对细菌生物膜感染创面的评估对诊断及治疗至关重要, 然而尚没有简单易行确定细菌生物膜存在的方法。因此, 需要努力开发能够在体内快速识别细菌生物膜的技术。

2.2. 创面细菌生物膜定位与标本采集

创面细菌生物膜的厚度不超过100 μm, 且没有宏观上可识别的特征, 故很难用肉眼观察到^[15]。仅凭肉眼观察, 外科医师经常把坏死组织或分泌物误认为是细菌生物膜。因此, 对创面细菌生物膜的准确定位与取材非常重要。Kennedy等^[16]对烧伤患者的溃疡组织和痂下组织进行活体组织检查, 在溃疡表面和痂下找到了细菌生物膜存在的证据。鉴于细菌生物膜在整个创面和痂内分布不均匀, 为了提高取材的成功率, 应对创面浅表至深层多个部位取材。《欧洲临床微生物与传染病学会细菌生物膜感染诊疗指南（2014年）》建议：对创面清创后通过活体组织检查或刮除获得标本是首选取材方法^[17]。采用侵入性较小的方法, 如拭子标本法采集标本可能无法获得足够的细菌生物膜, 因为创面没有客观指标来准确定位细菌生物膜^[18]。

2.3. 创面细菌生物膜检测技术

2.3.1. 标准微生物培养

目前标准微生物培养技术广泛应用于检测感染创面的致病菌。研究表明, 标准微生物培养方法对慢性创面中细菌检出率只有1%, 因为细菌的生长状态会影响检出率^[19]。当细菌处于缺氧、营养缺乏、低温或暴露于抗菌药物中等不利环境中时, 会进入存活不可培养（VBNC）状态（休眠期）, 这是细菌应对恶劣环境的一种适应机制, 这种状态也是导致抗生素对其无效的原因之一^[20]。在这种状态下, 细菌不再能够在以前能够维持其生长的培养基上形成菌落^[21-22]。因为细菌生物膜包含多种细菌群落, 生物膜状态细菌大多以VBNC的状态存在, 意味着单纯用标准微生物培养技术检测创面细菌生物膜是不够的。

有文献报道应用二硫苏糖醇（DTT）处理或超声作用可以提高人工关节细菌生物膜感染诊断准确率^[23-24]。Drago等^[23]比较了人工关节经DTT处理或超声作用后对人工关节周围组织培养的影响。应用标准的组织培养方法, 超声处理人工关节的周围组织培养有较高的敏感度（71.4%）和特异度（94.1%）, 特异度与DTT处理（94.1%）相同, 但敏感度较DTT处理（85.7%）更低。但目前还没有研究证实这些方法应用于慢性创面细菌生物膜诊断的有效性。

2.3.2. 细菌生物膜成像技术

扫描电子显微镜和激光共聚焦扫描显微镜被认为是细菌生物膜较为可靠和客观的诊断工具, 扫描电子显微镜可以识别没有感染迹象创面的细菌生物膜^{[15, 17]}。然而, 这些成像技术需要特殊的设备和专业人员操作, 目前多用于科研, 在临床环境中未开展^[25]。

微生物电化学技术是利用微生物进行废水处理或电合成, 可以对细菌生物膜进行实时监测。Schmidt等^[26]介绍了一种集成平台（具有氧化铟锡/金发光二极管透明电极）, 这种集成平台能够用于细菌生物膜厚度的监测, 未来甚至可实现对活体或原位生长的细菌生物膜进行二维或三维光电成像。这种技术如能应用于慢性创面的治疗, 将有助于临床医师对细菌生物膜的诊断。

2.3.3. 细菌生物膜染色技术

细菌生物膜中EPS经特殊染色后可用来检测细菌生物膜。有学者用刚果红和齐尔石碳酸品红对患者慢性创面细菌生物膜样本染色, 通过荧光显微镜观察, 生物膜中EPS被刚果红染色为橙色或粉红色, 而齐尔石碳酸品红将细菌细胞染成紫色或红色^[27]。Davis等^[28]用钙氟白和溴化乙锭对患者慢性创面细菌生物膜样本染色, 钙氟白将生物膜中EPS染成蓝色, 细菌细胞DNA被溴化乙锭染成红色。此外, 文献中其他EPS特殊染色还包括HE染色、异硫氰酸荧光素和刀豆球蛋白A染色、4', 6-二脒基-2-苯基吲哚/过碘酸希夫染色、硝酸银染色等^{[14, 29]}。相较于其他细菌生物膜检测技术, 细菌生物膜染色技术对设备和专业人员的要求不高, 可行性较强。但因为部分染色剂无法对细菌本身反染色（如硝酸银染色、HE染色）或染色剂可能与临床样本发生交叉染色, 有一定的局限性。

2.3.4. 分子生物技术

随着核苷酸测序技术的发展, 研究人员应用核糖体RNA（rRNA）基因的序列数据作为检测病原体和VBNC状态细菌的依据^[19]。16S rRNA测序技术利用16S rRNA序列作为引物结合位点的高度保守区域, 为病原菌的鉴定提供物种特异性信息^[30]。

变性梯度凝胶电泳技术是通过PCR扩增病原菌16S rRNA基因产物来分析复杂细菌生物膜多样性的常用方法^[31]。检测患者创面细菌生物膜的研究结果显示, 变性梯度凝胶电泳技术成功识别了40%的标准微生物培养方法检测不到的细菌^[32]。

与游离细菌不同, 生物膜模式细菌分泌包括多糖、细菌DNA和蛋白质等EPS, 还可以结合、聚集宿主DNA等成分。因此, 细菌分泌的物质是细菌生物膜和游离细菌之间的一个区别点。荧光原位杂交（FISH）技术已被用于创面靶向组织切片中细菌生物膜的可视化检测, 并可用于细胞外DNA的检测^[33]。肽核酸-FISH技术将FISH与肽核酸探针结合。肽核酸可以与其互补DNA或RNA序列杂交, 且由于肽核酸主链没有静电排斥力, 与核酸的结合牢固、迅速。与传统DNA-FISH相比, 肽核酸-FISH有更高的敏感度和特异度。因此, 可以利用该技术识别细菌生物膜结构中的特定细菌种类^[34]。有学者采用肽核酸-FISH与激光扫描共聚焦显微镜结合的方法从患者慢性创面的多菌生物膜群落中识别出特异性细菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和微球菌）^[35]。该技术的应用为活体组织检查中鉴定单一或多种细菌种群提供了一种方法, 可以应用于临床样本, 以识别和估计创面细菌生物膜中存在的各类细菌的比例。

分子生物技术的不断发展使得细菌生物膜诊断水平极大改进, 这些诊断方法将迅速识别和量化创面中可能存在的各种病原菌, 从而使医师能够更好地针对每例患者特异的细菌生物膜进行治疗^[36]。虽然分子技术可以特异性且敏感地识别细菌群落中的每一种细菌, 但并不能鉴别其是游离细菌还是细菌生物膜^[37]。

2.3.5. 细菌生物膜代谢组学

代谢组学是研究细胞调节过程的中间体、最终产物和其他信号分子的学科, 已经被用来识别与慢性炎症和感染性疾病相关的代谢产物^[38]。在细菌生物膜形成过程中, 宿主细胞和病原体都有可能发生代谢变化, 这些变化可以通过代谢组学分析检测到。所以, 分析感染细菌生物膜的创面的代谢组学特征是一个潜在的细菌生物膜诊断手段^[39]。有学者应用基于核磁共振的代谢组学分析观察到铜绿假单胞菌的游离细胞和生物膜细胞存在各自独特的代谢模式, 并认为这种代谢组差异可作为诊断细菌生物膜的依据^[40]。如能从慢性创面的生物流体中分离出特异性代谢物, 将有助于确定致病菌株并选择敏感抗生素。

2.3.6. 创面印迹技术

创面印迹技术通过在创面表面贴上一块硝化纤维膜来吸收渗出液并固定生物分子, 如蛋白质和黏多糖, 染色固定后行进一步分析。除了对所需的生物分子进行定性评估外, 该方法还可以对整个创面上分布不均的目标分子进行空间分析^[41]。Nakagami等^[42]的一项使用创面印迹技术对压疮创面进行细菌生物膜检测并预测溃疡发展情况的前瞻性研究中, 使用硝化纤维素膜收集患者创面的细菌生物膜成分, 染色后用钌红检测细菌生物膜中的黏多糖, 结果显示, 有细菌生物膜的外植体产生阳性印迹, 没有细菌生物膜的外植体则不产生。在创面印迹染色阳性组中, 超过80%的病例创面在1周后无明显改善或创面腐肉减少小于10%。研究人员认为, 创面印迹技术不但可以在临床环境中用于检测细菌生物膜, 创面印迹染色阳性结果还可以作为压疮愈合延迟的指征, 指导临床医师对创面提前做出干预。创面印迹技术是一种无创和精确的创面评估方法, 在将来有望做到创面细菌生物膜临床识别和监测。

2.3.7. 转录组学技术

由于细菌的状态会影响细菌的生理和代谢, 因此, 通过识别病原菌的状态, 便可将真正的病原菌与细菌生物膜基质中的其他细菌区分开来。高通量RNA测序（RNA-seq）技术是利用新一代测序技术来揭示样本RNA及其数量的方法, 可用于评价创面细菌生物膜微环境中表达的转录组^[43]。转录组学不仅可以用来鉴定细菌, 还可以根据细菌形成生物膜的倾向和对抗生素的耐药程度来对同种细菌进行分类。Castro等^[44]应用RNA-seq分别对游离状态和生物膜状态阴道毛滴虫进行了转录组分析, 结果表明细菌生物膜中编码参与葡萄糖和碳代谢的蛋白质的转录丰度较低, 同时生物膜状态阴道溶菌素较游离状态阴道溶菌素转录水平低, 细菌生物膜这种低代谢活性正是导致细菌性阴道炎反复慢性发作的原因。

细菌生物膜的形成被认为是决定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为创面感染常见病原体的主要原因之一。然而, 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）在体外也能形成细菌生物膜, 这种生物膜对万古霉素有耐药性。因此, 研究MSSA生物膜形成的可能机制也是非常必要的。Tan等^[45]得出MSSA生物膜是在没有辅助基因调控（Agr）系统的情况下形成的, 而Agr系统是金黄色葡萄球菌的主要毒力调控和群体感应系统之一。缺乏Agr系统的金黄色葡萄球菌生物膜可能比具有Agr系统的金黄色葡萄球菌生物膜更具耐药性。因此, 不仅仅要识别致病菌种类, 还需要识别其分子亚型, 此外, 转录组学方法对指导临床医师采取有针对性的治疗策略治疗创面细菌生物膜非常有价值。

3. 小结与展望

慢性创面的治疗给患者家庭及社会带来巨大的经济负担, 人们越来越意识到消除细菌生物膜对于治疗慢性创面的重要性。基于细菌生物膜的创面护理治疗方案已经在研发中, 但目前还没有可靠的床旁诊断技术可以快速、准确地检测细菌生物膜。床旁细菌生物膜诊断技术是快速检测细菌生物膜、及时治疗和监测疗效的前提。目前临床医师可通过开展传统微生物培养细菌生物膜和创面细菌生物膜样本染色这2项技术来辅助识别创面细菌生物膜。随着新的诊断技术进一步发展, 某些技术有望凭其优势成为床旁快速识别和监测创面细菌生物膜的手段。例如, 创面印迹技术有无创、重复性好等优势, 医师在该技术的引导下可准确清除受细菌生物膜影响的创面区域, 不同于以往仅仅依靠视觉评估进行清创, 可避免损伤正常的肉芽组织。因此, 有理由相信随着对细菌生物膜领域进一步深入研究, 未来实现创面细菌生物膜的床旁快速检测是可能的。