局部应用脂联素基因重组腺病毒对骨缺损修复的影响

Abstract

目的

探讨局部应用人脂联素（hAPN）基因重组腺病毒Ad-hAPN-EGFP对SD大鼠胫骨骨缺损修复的影响。

方法

采用36只SD大鼠进行胫骨骨缺损（缺损直径2 mm）修复实验，36只大鼠（72侧）随机分为A、B、C共3组（n=24），在术中及术后第2天分别注射重组腺病毒Ad-hAPN-EGFP、空白腺病毒Ad-EGFP和生理盐水。术后1周采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）对hAPN及成骨相关因子的表达进行检测，术后3周采用显微CT、苏木精-伊红（HE）染色及Masson染色对骨缺损修复情况进行对比。

结果

1）术后1周real-time PCR显示，A组hAPN表达成功，而B、C组无表达；A组成骨相关因子的表达量明显高于B、C组（P<0.05）。2）术后3周显微CT、HE染色及Masson染色显示，A组新生骨密度、骨体积分数、骨小梁数量及骨小梁厚度均大于B、C组（P<0.05），而B、C两组间无明显差异（P>0.05）。

结论

局部应用hAPN基因重组腺病毒对大鼠骨缺损修复具有促进作用。

骨缺损一般由创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等造成，治疗方法包括骨移植、组织工程技术、膜引导性组织再生技术、基因疗法、生长因子疗法等。尽管骨缺损的修复已经取得很大的成就，但仍面临许多问题，其治疗方法也存在着不同的局限性。安全高效的骨缺损修复方法是目前研究的热点。

脂联素（adiponectin，APN）也被称为脂肪细胞补体相关蛋白，抵抗素1和脂肪基因，是一种主要由脂肪组织合成和分泌的脂肪因子[1]。在不同的组织中，APN发挥着不同的作用，它与胰岛素敏感度的调节、能量平衡、动脉粥样硬化以及炎症反应密切相关。近年来，越来越多的研究发现APN与骨代谢密切相关。Lenchik等[2]发现，血清APN的浓度与骨密度呈负相关。也有学者[3]–[5]发现，在人类的股骨及胫骨成骨细胞表面，小鼠成骨细胞及破骨细胞表面，MG-63细胞株及成骨细胞株表面均有APN及其受体表达。采用不同方式将APN应用于牵张成骨和种植体周围成骨，在体内实验中证实APN有促进成骨的作用。本实验构建了SD大鼠胫骨骨缺损模型，采用腺病毒载体携带外源基因人APN（human APN，hAPN），并将重组的腺病毒载体Ad-hAPN-EGFP局部注射于骨缺损处，探讨hAPN对SD大鼠骨缺损修复的影响。

1. 材料和方法

1.1. hAPN重组腺病毒表达载体的构建

含有重组hAPN目的基因的质粒由美国Tufs大学牙医学院Jake Chen教授提供。padTrack-CMV重组穿梭载体和pAdeasy-1重组腺病毒骨架载体由汉恒生物（上海）实验室提供。重组腺病毒Ad-hAPN-EGFP的构建与鉴定采用张志明等[6]的方法，构建成功后Ad-hAPN-EGFP病毒滴度（plaque forming unit，PFU）为每毫升1×10¹¹个。

1.2. 动物模型建立

取36只250~280 g的SD大鼠（四川大学华西医学实验动物中心），雌雄不限。于双侧膝关节内侧区纵向切开皮肤、皮下组织和骨膜，显露胫骨前端，在胫骨内侧面距离生长板约1 mm处，用台式慢速牙科电钻低速钻孔制备一直径约2 mm的圆形骨缺损（生理盐水冲洗降温），深达骨髓腔，不穿通对侧骨密质。术后分层拉拢缝合伤口，0.5%聚维酮碘消毒术区。

36只大鼠72侧胫骨缺损随机分成A、B、C共3组，每组24侧。A组为Ad-hAPN-EGFP组：取10 µL Ad-hAPN-EGFP病毒液用0.5 mL生理盐水稀释，用医用12号注射针分别取0.25 mL稀释病毒液于术中注入双侧骨缺损区，术后第2天从正常皮肤处进入，潜行于骨缺损处，再次缓慢注射相同滴度的稀释病毒液。B组为空白腺病毒组：以不含hAPN重组基因的空白腺病毒Ad-EGFP作对照，术中及术后第2天采用相同方法注入相同滴度相同剂量不含hAPN重组基因的病毒液。C组为空白对照组：术中及术后第2天采用相同方法注入同等剂量的生理盐水。3组大鼠术后立即肌肉注射青霉素抗感染，剂量为每次4.0×10⁵ U，每日2次，连续注射3 d；术后采用常规颗粒饲料饲养。术后第3周取材进行检测。

1.3. 骨缺损修复观察指标

术后1周于各组大鼠中随机取4只，用过量麻醉注射处死，获取骨缺损区标本，进行实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）。术后3周处死剩余大鼠，各组中剩余8只大鼠随机取4只用显微CT扫描骨缺损区，另外4只用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色及Masson染色以观察组织学变化。

1.3.1. real-time PCR

无菌无酶条件下快速取出骨缺损区标本，修整大小，剔除软组织，生理盐水冲洗干净后，放入冻存管中，于液氮罐中保存待用。实验时取出标本，置于研钵中，骨钳夹碎，加入少量液氮，迅速研磨至骨块成粉末状，加入Trizol（宝生物工程大连有限公司）提取总RNA，按照试剂盒（宝生物工程大连有限公司）说明进行反转录及real-time PCR，检测hAPN和成骨相关因子骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor-2，Runx2）的相对表达量。hAPN和3种成骨相关因子的引物序列见表1，引物由美国Life Technologies Corporation-Thermo Fisher公司合成。

表 1. 引物序列.

Tab 1 Primer sequences

基因	正向引物（5′—3′）	反向引物（5′—3′）
hAPN	GCTCTGTGCTCCTGCATCTG	GAGTCCATTACGCTCTCCTTCC
OCN	GGTGGTGAATAGACTCCGGC	GCAACACATGCCCTAAACGG
BMP-2	CGCCTCACAAACAACCACAG	AATGACTCGGTTGGTCTCGG
Runx2	AGAATGGACGTGCCCCCTA	CTGGGGAAGCAGCAACACTA

1.3.2. 显微CT

修整标本大小，固定于4%多聚甲醛液（Sigma公司，美国）中，用µ-CT40型显微CT机（Scanco公司，瑞士）对标本进行扫描，工作电压70 kV，工作电流114 µA，整合时间700 ms，然后用随机软件在配套工作站上行显微CT数据三维重建并定量分析标本兴趣区（region of interest，ROI）内新生骨量（与上述ROI范围一致）。测定的新生骨参数包括骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积分数（relative bone volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.3.3. HE及Masson染色

标本于4%多聚甲醛液中固定48 h后，冲洗标本，用10%乙二胺四乙酸脱钙液脱钙60 d，70%~100%乙醇梯度脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度为5 µm，作HE及Masson染色。染色后光镜下观察切片，采集图像。对HE切片进行定量分析，3组中随机取标本中心切面完整的4张组织学HE染色切片，在显微镜下取40倍视野，每张切片观测5个视野，按新骨形成面积与视野总面积比值来比较各组间是否存在差异。

1.4. 统计方法

采用SPSS 12.0软件包对数据进行t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. real-time PCR检测结果

real-time PCR检测显示：A组hAPN的表达较高，证明Ad-hAPN-EGFP转染成功；而B、C组的PCR循环数Ct值均大于30，表示B、C两组无hAPN的表达。成骨相关因子OCN、BMP-2及Runx2在3组中的相对表达量见图1：3种成骨相关因子在3组大鼠中均有表达，A组的表达量明显大于B、C两组，差异有统计学意义（P<0.05），而B、C组间的差异无统计学意义（P>0.05）。

图 1. A、B、C组成骨相关因子OCN、BMP-2及Runx2的相对表达量.

Fig 1 Osteogenesis related factors (OCN, BMP-2, and Runx2) expression of group A, B, and C

左：OCN；中：BMP-2；右：Runx2。

2.2. 显微CT测试结果

对术后3周标本的显微CT扫描数据进行三维重建，结果见图2：3组的骨缺损部位均没有形成完全的骨愈合，都存在无新骨形成的空白区域；但与B、C组相比，A组骨小梁相对致密，空白区域较少。通过选取ROI检测各组的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th，结果见表2：A组各项参数均明显高于B、C组（P<0.05），而B、C组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。该结果提示A组成骨较B、C组明显，成骨量更高。

图 2. 骨缺损区显微CT三维重建图像.

Fig 2 Three-dimensional micro-CT images of the bone defect area

左：A组；中：B组；右：C组。

表 2. ROI内显微CT参数分析结果.

Tab 2 Micro-CT parameters of the ROI

骨参数	A组	B组	C组
BMD/（mg·cm−³）	437	249	246
BV/TV/%	42.23±3.54	29.96±2.78	26.48±2.81
Tb.N/mm−1	3.89	2.06	1.73
Tb.Th/µm	98.2	51.4	54.6

2.3. HE及Masson染色结果

3组大鼠术后3周骨缺损区的HE和Masson染色结果见图3，通过光学显微镜观察可见各组的新骨形成情况。术后3周，各组骨缺损内均充满新生骨小梁。与B、C组相比，A组骨小梁数量较多，宽度较大，排列更为紧密。HE染色切片的定量分析结果显示：A组骨缺损内新骨形成面积与视野总面积比值（47.12%）大于B组（24.68%）和C组（21.95%），差异有统计学意义（P<0.05），而B、C组新骨形成面积与视野总面积的比值相似，差异无统计学意义（P>0.05）。

图 3. 骨缺损区的组织学染色 × 100.

Fig 3 Histological staining of the bone defect area × 100

左：A组；中：B组；右：C组。上：Masson染色；下：HE染色。

3. 讨论

本研究构建了SD大鼠胫骨骨缺损的体内实验模型，将重组腺病毒Ad-hAPN-EGFP直接注入骨缺损区内，术后1周real-time PCR结果显示，APN转染组的hAPN表达量较高，而空白腺病毒转染组及空白对照组无hAPN表达。术后3周的检测结果证明了局部应用重组腺病毒Ad-hAPN-EGFP可以促进骨缺损的修复。

目前关于APN对成脂成骨的作用尚无定论。Shinoda等[4]认为，通过自分泌或旁分泌产生的APN可以促进骨形成，而通过内分泌途径产生的APN则抑制骨形成，另外，APN还可以通过影响胰岛素通路间接地促进成骨。Luo等[7]发现，APN通过APN受体/c-Jun氨基末端激酶途径促进人类成骨细胞增殖，通过APN受体/p38丝裂原活化蛋白激酶途径促进成骨细胞分化。在成骨细胞、破骨细胞及单核细胞共培养体系中，APN通过APN受体/p38丝裂原活化蛋白激酶途径诱导人类成骨细胞核因子κB受体活化因子配体生成，抑制骨保护蛋白的表达，从而诱导破骨细胞分化[8]。在体内实验中，学者们构建了不同的动物模型来研究APN在体内环境中对成骨的影响。目前大部分的体内实验证实APN可以促进成骨，但其机制尚不清楚；推测APN主要是通过抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能，同时刺激血管生成而促进成骨，还可能通过直接促进成骨细胞分化而促进成骨。Oshima等[9]将重组APN注入小鼠颈静脉，发现重组APN可以抑制破骨细胞分化，促进细胞碱性磷酸酶mRNA的表达和骨基质的矿化。本课题组在前期研究中[10]证实，缓释APN可促进卵巢摘除大鼠羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）周围的骨再生，并可抑制破骨细胞的功能。有学者[11]–[12]采用新西兰白兔构建了牵张成骨模型，将重组的hAPN注入牵张间隙，结果发现，间断性使用重组hAPN可以促进快速牵张中的骨再生。

关于APN在种植体及植入材料周围成骨，牵张成骨及激素性股骨头坏死模型中的作用已有较多报道，但采用基因治疗促进骨缺损修复的研究还较少。随着基因治疗的普及，腺病毒载体受到广泛关注。该载体生产工艺简便，制备纯化相对容易，病毒滴度高，外源基因容量大，并且无插入突变激活癌基因的危险；因此，采用重组腺病毒载体治疗骨缺损具有良好的应用前景。本实验构建了SD大鼠胫骨骨缺损模型，将Ad-hAPN-EGFP稀释病毒液直接注入骨缺损，术后通过real-time PCR、显微CT、HE及Masson染色检测成骨效果。术后1周real-time PCR结果显示hAPN转染组成骨相关因子（OCN、BMP-2、Runx2）基因的相对表达量明显大于空白腺病毒组及空白对照组。术后3周，显微CT及HE、Masson染色显示：与空白腺病毒组及空白对照组相比，转染腺病毒组骨缺损中心新生骨质明显增多，骨质相对成熟，板层骨所占比例也较大。本研究成功证明了局部应用重组Ad-hAPN-EGFP可以促进SD大鼠胫骨骨缺损的修复。

hAPN与大鼠APN具有高度同源性，过表达的hAPN对破骨细胞的抑制及对成骨细胞的激活可能是产生这一结果的原因；但是，体内环境复杂多变，hAPN在骨缺损模型中是如何抑制破骨细胞、激活成骨细胞的呢？除了影响成骨及破骨平衡以外，hAPN是否同样可以通过影响成骨和成脂平衡从而促进成骨？既然APN主要是由脂肪细胞合成及分泌，那过表达的hAPN对脂肪细胞及骨髓基质细胞的成脂分化作用如何？这些问题尚需进一步研究。

Funding Statement

[基金项目] 四川省科技厅科技支撑计划基金资助项目（2014SZ00194）；四川大学优秀青年学者基金资助项目（2012SCU4A12）