缺氧诱导因子-1α信号通路在髁突软骨生长和改建中的作用机制

Abstract

髁突软骨在正常机体内处于一个低氧环境中，软骨细胞却对此表现出较好地适应能力，然而在体外细胞的研究中发现，髁突软骨细胞在传代培养中很难保持稳定性，这为髁突软骨的研究带来了较大困难。同时也考虑培养髁突软骨细胞时是否应尽可能模拟体内低氧环境。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞对低氧环境适应性反应的重要转录因子，对维持软骨细胞的稳态和功能具有重要意义。本文就HIF-1α的生物活性结构、相关信号通路及在髁突软骨修复中的作用作一综述。

颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）是具有适应性改建能力的滑膜关节，由颞骨关节窝、关节盘和下颌骨的髁突等组成。髁突表面的软骨与普通滑膜关节软骨不同，它是纤维软骨，是一种特殊形式的结缔组织，不含神经纤维、血管及淋巴管，其营养代谢主要通过滑液扩散实现[1]。对髁突软骨的研究依然是个巨大的挑战，一方面人髁突软骨很难获得；另一方面由于软骨细胞很难在体外培养时保持稳定性，它会随着增殖而发生去分化，由卵圆形逐渐变成成纤维样细胞的长条状，同时也会失去软骨特异性标记物，如2型胶原、蛋白多糖、SOX-9（Sry related HMG box-9）等。在正常机体内，髁突软骨处于低氧微环境，大量研究表明，越靠近关节深层，氧含量越低，达到1%。可见软骨细胞生活在一个持续的低氧环境中，而对此表现出较大的适应能力。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是细胞对缺氧或低氧环境适应性反应的重要转录因子[2]，髁突软骨细胞是低氧感应细胞，已有研究[3]证实HIF-1α对维持软骨内环境稳定，保持软骨细胞活力，促进软骨细胞在低氧条件下能量和软骨基质产生方面起重要作用。正常机体内软骨细胞所处的低氧环境是否也为体外培养细胞时带来新的思考，在培养细胞时是否应该尽可能模拟体内低氧环境，从而保持软骨细胞的形态和功能，为髁突软骨的修复和改建研究奠定基石。

1. HIF-1α的生物学特性

缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是由Semenza等[4]发现的一种蛋白质，由一个α亚单位（HIF-1α）和一个β亚单位（HIF-1β）构成，α亚基和β亚基属于基本螺旋-环-螺旋-PAS（basic-helix-loop-helix-per-ant-sim，bHLH-PAS）家族蛋白[5]。HIF-1α由以下部分组成：1）位于氮末端的碱性螺旋环螺旋（basic/helix-loop-helix，bHLH）结构域，主要参与HIF-1α与靶基因DNA结合以及与HIF-1β的二聚化；2）中部是氧依赖性降解域（oxygen dependent degradation domain，ODDD），常氧环境下，ODDD可被脯氨酸羟化酶（proline hydroxylase，PH）羟化，使HIF-1α被泛素连接酶所识别与结合，在翻译后即被泛素一蛋白酶水解复合体降解[6]；3）碳末端有2个转录激活域，氮末端转录激活结构域（N-transcriptional activation domain，N-TAD）和碳末端转录激活结构域（C-transcriptional activation domain，C-TAD）[7]。

HIF-1α为氧依赖性调节蛋白，能感受细胞周围的氧气浓度，高氧环境下其半衰期非常短（<5 min），可被特殊的蛋白酶体降解。当细胞内氧浓度低于6%时HIF-1α保持稳定并聚集，转移进入细胞核，与核内HIF-1β形成二聚体，与缺氧反应元件（hypoxia reaction element，HRE）的5′-TACGTG-3′序列结合，形成HIF-1、p300/CBP环腺苷酸反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），以及其他转录因子的起始复合物，进而激活HIF-1靶基因的转录，引起组织细胞一系列的缺氧适应性反应，如血管新生与重塑、能量代谢、红细胞生成、细胞增殖、凋亡等[8]。

2. HIF-1α的信号通路

2.1. 氧感应信号通路

氧对于一个生命体来说具有重要意义，氧浓度的改变往往会导致细胞和器官功能失调。为确保足够氧气的传输，机体已经建立了复杂而又精细的系统去应对缺氧，而细胞内主要通过HIF-1α来调节。

髁突表层软骨中含氧量为7%~10%，深层可降至1%，可见髁突软骨处于生理性的无氧微环境中。Schipani等[9]发现从软骨表层至深层，随着氧浓度的降低，HIF-1α从细胞浆转入细胞核内；去除表层软骨后，中下层软骨氧浓度升高，HIF-1α从核内转出。特异性敲除HIF-1α基因后，软骨中低氧区域细胞死亡增多，说明HIF-1α对软骨细胞在低氧环境中存活有重要作用。

髁突软骨主要有软骨细胞和软骨基质组成，其中软骨基质成分决定着其生物学特性。2型胶原和蛋白多糖是软骨基质的主要成分，成熟软骨中基质合成和降解处于动态的平衡。Pfander等[10]发现HIF-1α基因敲除后的软骨细胞在低氧培养下合成蛋白多糖和2型胶原平均低于正常的软骨细胞，且正常软骨细胞在低氧培养48 h后，其2型胶原表达大大增加，同时正常软骨细胞比HIF-1α基因敲除后的软骨细胞表现出较高的增殖活性。胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶（collagen prolyl 4-hydroxylase，C-P4H）是胶原维持螺旋稳定结构的基础，是胶原合成的关键步骤。HIF-1α能激活C-P4H的表达，促进胶原生成，从而维持软骨细胞外基质的稳定。在无HIF-1α存在时软骨细胞低氧下分泌糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的量是常氧时的35%，而有HIF-1α存在时细胞低氧下产生GAG的量大大高于常氧[11]。由此可见HIF-1α对保持软骨细胞的增殖活性及细胞外基质的合成具有重要意义。

2.2. 生物刺激相关通路

机械负荷及缺氧被认为是影响关节软骨最持久的两个因素。过度持久的机械压力可直接损害关节软骨的合成功能[12]，影响细胞间滑液交换，可诱发自由基产生。关节囊内静压力可超过局部组织终末毛细血管的灌流压，因而导致局部组织暂时性缺氧，反复持久的缺氧，则会引起代谢障碍。在低氧环境中，软骨细胞通过腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依赖途径，降低组织的需氧量。启动HIF-1α信号激活SOX-9上调细胞外基质相关基因从而来提高组织功能[13]。在体内实验发现过大机械刺激会使软骨细胞中HIF-1α表达增高[14]。然而压力负荷如何通过HIF-1α信号通路来调节的机制还未明了。可能是压力负荷先造成细胞间氧分压下降，HIF-1α降解被抑制，与HIF-1β结合成二聚体形成有活性的HIF-1，HIF-1与缺氧反应元件结合，从而启动靶基因的转录与表达，调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)、SOX-9等的表达，进而参与髁突软骨细胞的生存、增殖和能量代谢，细胞外基质的分泌等活动。

在过去的几年里，破译软骨内缺氧信号通路的研究已取得较大进步，且也证实缺氧信号对软骨细胞生理方面有重要影响，近年来发现HIF-1α在常氧环境下对软骨细胞也有重要意义。软骨细胞生长、分化和代谢受生长因子和细胞因子的调节。关节软骨内的各种信号之间的平衡有利于保持软骨的稳定性，而当该平衡被打破时，关节中的一些细胞如巨噬细胞、成纤维细胞及软骨细胞等的分泌活性将发生变化。缺氧及IGF-1均能通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）/ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of Rapamycin，mTOR）和丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路来调节HIF-1α和VEGF的表达[15]。有研究[16]证实HIF-1α和Notch胞内结构域（Notch ICD）之间可以发生直接作用，HIF-1α被募集到Notch ICD的转录复合物上，结合Notch相应的启动子来激活Notch靶基因，从而调控软骨细胞增殖、分化，促进前肥大软骨细胞向肥大软骨细胞转变，维持软骨细胞表型，以及软骨基质代谢平衡[17]。

3. HIF-1α在髁突软骨修复中的作用

由于软骨组织缺乏血管，所以能量物质只能通过组织渗透获得，然而远远不能满足软骨组织发育和缺损修复所需，而血管侵入可为软骨组织输送大量的能量物质，以满足发育以及改建的需要。低氧是血管新生的刺激信号，在低氧条件下，生长板软骨细胞HIF-1α基因被激活，从而可以诱导VEGF的表达，促进软骨内血管生成，调节软骨内骨化。软骨损伤导致组织水肿、缺氧，诱导HIF-1α生成，促进肥大层软骨细胞表达VEGF，诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）降解胞外基质，从而参与关节改建，且HIF-1α可在1 min内上调VEGF到30倍以上。由此可见HIF-1α可能是通过上调VEGF等基因的转录表达来促进软骨内血管生成，从而调节软骨内骨化和软骨的改建。

有研究[18]显示，在骨关节炎患者的关节软骨内，白细胞介素1、肿瘤坏死因子-α等致炎因子表达均异常增高，刺激MMP-13、前列腺素E2等炎性因子或酶类的表达，从而对软骨及软骨基质造成严重损伤，而这些致炎因子和炎性因子均能直接或间接刺激HIF-1α转录活性增强。HIF-1α激活后，可通过蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase，AKT）途径增强SOX-9等软骨特异性基因表达[19]；同时可减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的活化及上调X连锁凋亡抑制蛋白-2（X-linked inhibitor of apoptosis protein-2，X1AP-2）和B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等抗凋亡蛋白表达的水平等途径抑制软骨细胞的凋亡，促进软骨细胞存活[20]。雌激素受体β（estrogen receptor β，ERβ）可通过HIF-1α通路来抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活化，从而减轻炎症反应[21]。

HIF-1α可影响Wnt信号活性再影响下游的骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/骨保护素配体（osteoprotegerin ligand，OPGL）/ NF-κB 受体激活剂（receptor of activator of NF-κB，RANK）信号系统或Eph/ephrin来影响骨的形成与代谢[22]。TMJ盘前移位后，OPGL升高，髁突软骨中破骨细胞有活跃的趋势，机体通过自身反馈机制刺激OPG表达增高，竞争性结合或阻断OPGL与RANK结合，抑制破骨细胞引起的软骨吸收[23]。另一方面，HIF-1α可促进成骨和矿化[24]。

HIF-1α的表达被认为是内源性保护机制的始动因子和共同途径，大量研究表明应力刺激、炎症等状态下时，HIF-1α能在缺氧的髁突软骨组织内聚集并被激活，通过诱导血管生成和调节能量代谢等途径，增强软骨细胞抵抗缺氧缺血损伤的能力，促进软骨细胞增殖分化，进一步促进细胞基质的合成，其蛋白多糖和2型胶原表达恢复，髁突的适应性改建得以适应新的功能需要。

4. 展望

髁突软骨是颌面部重要的生发中心，只有在协调有序的调控下，髁突软骨细胞才能正常的增殖、分化和成熟。机械负荷及缺氧是影响关节软骨最持久的因素。低氧微环境、机械应力等的信号转导在时空上形成调节系统控制软骨组织的发生、改建、内环境的稳定及创伤修复等病理生理过程。对于体外研究髁突软骨细胞，细胞从活体中取出时由原来的低氧环境到常氧环境，HIF-1α被降解，随之HIF-1α信号通路被抑制，软骨细胞的表型、增殖活性及基质合成均受到影响，为后续软骨细胞的研究带来了极大困难。相信在未来的研究中，模拟体内低氧环境是研究髁突软骨细胞的趋势。HIF-1α信号通路在髁突软骨改建中具有重要意义，这为修复软骨缺损维持组织完整性提供新的思路和治疗靶点。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81170979）；浙江省医药卫生科技计划项目（2015KYB146）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81170979); Zhejiang Medical Science and Technology Plan Projects (2015KYB146).