Abstract
目的
研究大鼠下颌功能前伸后髁突软骨中磷脂酶C-γ1 tyr783（PLC-γ1 tyr783）表达及其变化规律，探讨 PLC-γ1tyr783在功能矫治前伸大鼠下颌髁突软骨骨改建中的作用，为临床上骨骼矫形治疗提供实验依据。
方法
选取4周龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，适应性饲养1周后随机等量分为实验组和对照组，实验组每天24 h佩戴自制下颌前伸斜面导板矫治器，对照组不戴矫治器。2组大鼠分别于戴用矫治器1、3、7、14、21、28 d时各断颈处死5只，取双侧髁突，常规固定、脱钙、脱水、包埋。石蜡切片采用免疫组织化学方法结合图像分析检测PLC-γ1tyr783在髁突软骨中的表达分布及其变化规律。
结果
对照组PLC-γ1tyr783表达水平随着实验周期的推移逐渐减弱（P>0.05），实验组大鼠髁突软骨处PLC-γ1tyr783的表达在第14天时达到高峰，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。
结论
PLC-γ1tyr783参与了下颌功能前伸大鼠髁突软骨的骨改建。
Keywords: 下颌功能前伸, 髁突软骨, 磷脂酶C-γ1 tyr783, 骨改建
Abstract
Objective
To investigate the changes in the expression of phospholipase C-gammaltyr783 (PLC-γ1tyr783) in the condylar cartilage of a young rat during functional mandibular protraction. This work also explores the function of PLC-γ1tyr783 in the rat mandibular condylar cartilage bone remodeling, which could provide experimental evidence for clinical bone orthopedic work.
Methods
A total of 60 four-week-old male Sprague–Dawley (SD) rats were used in this study. The rats were divided equally and randomly into experimental group and control group. The functional appliances that were fitted to the upper incisors of the animals in the experimental group were worn 24 h a day after the rats were fed for 7 d with homemade pellet feed. The animals in the experimental group, along with their matched controls, were sacrificed after 1, 3, 7, 14, 21, and 28 d. The bilateral condylar was fixed, decalcified, dehyded, and then conventional paraffin embedded. Immunohistochemistry of PLC- γ1tyr783 was applied to observe its express distribution and variation.
Results
The expression of PLC-γ1tyr783 decreased gradually in the control group, which showed age-related changes (P>0.05). On the 14th day, PLC-γ1tyr783 expression in the experimental group was significantly higher than that in the control group. PLC- γ1tyr783 expression began to appear statistically and significantly different between the two groups (P<0.01).
Conclusion
PLC-γ1tyr783 is involved in the bone remodeling process of the rat condylar cartilage after functional mandibular protraction.
Keywords: functional mandibular protraction, condylar cartilage, phospholipase C-gammaltyr783, bone remodeling
髁突骨改建直接影响下颌的形态和功能，从而影响颌面部的生长发育。机体通过多条信号通路将外界机械应力传递给体内内源性调节因子，即将机械外力信号转化为生物化学信号以完成髁突的骨改建，磷脂酶C-γ1（phospholipase C-gammal，PLC-γ1）则是众多内源性调节因子之一。以往研究[1]–[5]证实，PLC-γ1在细胞分裂、增殖和分化等方面发挥着重要作用。近期细胞学研究[6]–[7]证实，PLC-γ1tyr783在大鼠软骨细胞受到周期性机械应力后发生的增殖、迁移和细胞外基质合成过程中发挥了重要作用。目前，尚未见PLC-γ1tyr783在下颌功能前伸大鼠髁突软骨内的研究报道。本实验以PLC-γ1tyr783为检测指标，应用免疫组织化学染色的方法检测其在下颌功能前伸后大鼠髁突软骨后部的表达及其变化规律，初步探讨 PLC-γ1tyr783在下颌功能前伸大鼠髁突软骨骨改建中的作用，以进一步明确下颌功能前伸后髁突骨改建的机制。
1. 材料和方法
1.1. 实验设计
选取由河北医科大学动物实验中心提供的4周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，平均体重约90 g。于河北医科大学第一医院中心实验室（室温约26 °C）适应性饲养1周后，将大鼠随机等量分为实验组和对照组。实验组动物每天24 h佩戴自制斜面导板矫治器，对照组动物不作任何处理。2组动物分别在实验后1、3、7、14、21、28 d时采用断颈法各处死5只。
1.2. 组织处理
大鼠采用断颈法处死后，尽快取出双侧整块髁突及下颌支，注意避免损伤关节囊。4%多聚甲醛（0.1 mol·L−1PBS，pH7.0~7.6，含0.1%焦磷酸二乙酯）固定24 h，10%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）室温脱钙2周（用大头针针刺组织无阻力进入表示脱钙成功），乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，包埋时尽量保证髁突矢状面与蜡块表面平行。髁突纵向切片，厚度约5 µm，将组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60 °C过夜。
1.3. 免疫组织化学分析
切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇置换二甲苯，1%甲醇过氧化氢消除内源性过氧化物酶，枸橼酸盐抗原修复液进行抗原修复，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。弃去多余液体，不洗。滴加一抗[anti-PhosPho-PLCγ1（tyr783），兔多抗]，4 °C过夜。按免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）要求滴加生物素化第二抗体（IgG），37 °C 20 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 °C 20 min，PBS冲洗。3,3′-二氨基联苯胺（3,3′-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染细胞核。PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4. 图像分析
免疫组织化学染色切片在光学显微镜（BX51T-PHD-J11，奥林巴斯公司，日本）下应用多功能真彩色细胞图像分析管理系统对髁突软骨后部进行采图，随机选择3个视野，各组织切片采集400倍图像；应用多功能真彩色细胞图像分析管理系统进行免疫组织化学染色评分，以强度-色调-饱和度（intensity-hue-saturation，IHS）值表示染色强度。
1.5. 统计分析
采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，实验组与对照组组间PLC-γ1tyr783免疫组织化学染色IHS值的比较采用t检验，组内PLC-γ1tyr783免疫组织化学染色IHS值的比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
PLC-γ1tyr783阳性着色部位为细胞质，DAB显色为棕黄色，着色水平明显高于背景水平，主要表达于髁突软骨的增殖层和过渡层。14 d时实验组表达最强，28 d时2组间差异仍具有统计学意义（图1）。PBS代替一抗，细胞质未见阳性着色颗粒。
图 1. 髁突软骨后部PLC-γ1tyr783的观察结果 免疫组织化学染色 × 400.
Fig 1 Observations of the PLC-γ1 tyr783 in posterior condyle cartilage immunohistochemical staining × 400
a：14 d，对照组；b：14 d，实验组；c：28 d，对照组；d：28 d，实验组。
IHS均值结果显示：组间比较结果显示，在第7天时实验组PLC-γ1tyr783的表达与对照组相比开始出现统计学差异（P<0.05）；第14天时与对照组相比出现显著统计学差异（P<0.01）。组内比较结果显示，对照组PLC-γ1tyr783表达水平随着实验周期的推移逐渐减弱，无明显统计学差异（P>0.05）。实验组第14天时PLC-γ1tyr783的表达达到高峰，与第7天相比差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。
图 2. 随加力时间的推移实验组和对照组PLC-γ1tyr783的表达情况.
Fig 2 The expression of PLC-γ1tyr783 of experimental group and control group with the experimental period
3. 讨论
本实验采用4周龄大鼠，在适应性饲养1周后恰好达到大鼠青春生长发育高峰期前期，这是功能矫治的最佳时期[8]。2组大鼠分别于1、3、7、14、21、28 d处死，实验末大鼠恰好进入性成熟期，整个实验观察过程为生长发育高峰期，6个时间点的选择能比较全面地反应大鼠下颌功能前伸后髁突软骨改建的过程。
研究[9]证实PLC-γ1在哺乳动物体内广泛存在，一般位于细胞质内，在未发生反应的细胞中PLC-γ1通常维持在一定水平。PLC-γ1含有X、Y、SH3、C2结构域各1个，SH2、PH结构域各2个（其中1个PH结构域由2个半个PH结构域组成），手型结构域（EF-hand）4个[10]。SH2、SH3结构域为PLC-γ1特有，含有几个可被受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）磷酸化的酪氨酸残基为：Tyr771、Tyr783、Tyr1254，其SH2、SH3结构域可识别含磷酸化的Tyr及Pro序列的蛋白并与之相互作用，使自身的酪氨酸磷酸化位点被激活从而引发细胞内下游一系列信号传导通路[10]。PLC-γ1-Tyr783的磷酸化使PLCγ1被激活，活化的PLC-γ1tyr783在各种组织细胞的分裂、增殖、分化过程中均发挥着重要作用[1]–[7]。
本实验结果显示实验组与对照组中PLC-γ1tyr783主要表达于髁突软骨的增殖层和过渡层，据文献报道这两层细胞小而密集，具有多种分化能力，在髁突软骨的改建和修复中起着非常重要的作用，是髁突软骨生长与改建的中心[11]。对照组组内比较结果显示，PLC-γ1tyr783表达量随着实验周期呈现平缓下降趋势，并于21 d以后趋于平稳，此结果与大鼠的生长发育规律一致[8]。以往研究[12]–[13]结果证实，髁突属于继发性软骨，随着大鼠的生长，其生长发育活跃程度逐渐减弱，正常生理性骨改建活动也在逐渐减弱，直至趋于平稳状态，与本实验结果一致。因此，可以认为PLC-γ1tyr783在髁突软骨骨改建的细胞分裂与增殖过程中发挥了重要作用。
本研究实验组中PLC-γ1tyr783在第14天出现表达高峰，与对照组相比出现显著统计学差异。细胞学研究证实，软骨细胞对外界机械应力的反应部分通过integrin β1-Src-Rac1/PLCγ1- ERK1/2信号通路[6]–[7]。研究[14]证实，PLC-γ1tyr783位于细胞质内，并不能直接接收外界机械应力信号，integrinβ1是一种位于细胞膜上的异二聚体糖蛋白，对感知外界机械应力刺激，从而调控细胞内的一系列信号级联反应有关键性作用。机体在受到外界应力刺激后，能够直接将integrin β1激活，然后又进一步激活Src，而PLC-γ1tyr783是在接受了Src的活化信号之后才被激活，进而激活胞内一系列信号级联反应，最终促使细胞发生分裂、增殖和分化[6]–[7]。因此，PLC-γ1tyr783的活化应较其上游大分子蛋白等调控因子延迟，在相同动物模型中PLC-γ1tyr783与其上游调控因子的表达高峰也将会出现时间顺序性。本实验中大鼠下颌功能前伸后髁突软骨后部受到机械应力刺激发生骨改建，PLC-γ1tyr783是该过程的重要信号因子，机械外力有可能通过PLC-γ1tyr783介导的上述信号通路来促进增殖层和过渡层软骨细胞的增殖和分化，加速髁突软骨的骨改建，其中的信号机制还有待于进一步研究。
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