祛铁治疗对IPSS低危/中危-1骨髓增生异常综合征患者EPO-Stat5信号通路及调节性T细胞表达的影响

骨髓增生异常综合征（MDS）为造血干细胞克隆性疾病，以骨髓病态造血为特征。低危/中危-1 MDS属于疾病早期，其病理表现以骨髓造血细胞过度增殖和凋亡为主，贫血是常见的临床特征之一。长期输血是MDS患者出现铁过载的主要原因[1]。部分铁过载的MDS患者接受袪铁治疗后血常规可恢复正常，能不依赖输血长期生存[2]。红细胞生成依赖EPO-EPOR-Janus激酶2-转录激活因子5（Stat5）信号转导。Foxp3是调节性T细胞（Terg细胞）特异性标志物，其表达与Stat5的调控有关[3]，在MDS中的表达尚有争议。铁过载对EPO-Stat5信号通路及Terg细胞表达的影响尚不清楚。本研究我们初步探讨祛铁治疗对IPSS低危/中危-1 MDS患者EPO、Stat5、Terg细胞表达及红细胞生成的影响，现报道如下。

病例与方法

1．病例：以2014年3月至2018年1月我院诊治的IPSS分组为低危/中危-1的42例MDS患者为研究对象，男24例，女18例，中位年龄54（32~81）岁。MDS诊断、分型及预后分组参照文献[4]标准，其中难治性血细胞减少伴单系发育异常（RCUD）1例，难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞（RARS）6例，难治性血细胞减少伴多系发育异常（RCMD）35例。排除活动性炎症、肝病、肿瘤、溶血和酗酒等因素的影响，以血清铁蛋白（SF）>1 000 µg/L为铁过载[5]。42例MDS患者中，铁过载组22例，对照组20例。本研究征得我院伦理委员会批准，样本的取得均经患者知情同意。

2．治疗：铁过载组中18例患者接受甲磺酸去铁胺（20~60 mg·kg⁻¹·d⁻¹，持续皮下泵入12 h）或地拉罗司（30 mg·kg⁻¹·d⁻¹，口服）袪铁治疗，14 d为1个疗程，治疗4个疗程复查相关指标进行评估。全部42例患者检测指标近1个月内未接受重组EPO治疗，祛铁治疗期间患者仅接受输血、雄激素、益血生胶囊等促造血支持治疗。

3．标本采集及处理：采集全部患者治疗前及18例袪铁治疗组患者治疗4个疗程时外周血5 ml，EDTA抗凝。取其中2 ml常规分离血浆，行ELISA检测；取其中200 µl提取总RNA，行PCR检测；余下用淋巴细胞分离液收集单个核细胞，调整细胞数为1×10⁶行流式细胞术检测。

4．血红蛋白、网织红细胞、促红细胞生成素及铁代谢指标检测：采用Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪测定HGB、网织红细胞绝对计数（Ret）。放射免疫法测定EPO、血清铁蛋白（SF）含量，亚铁嗪显色法测定血清铁（SI）、总铁结合力（TIBC）。

5．流式细胞术检测外周血CD3⁺CD4⁺ T细胞表面CD25及Foxp3表达：常规处理后实验管加入鼠抗人FITC-CD3、PerCP-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3单抗各20 µl，对照管加入FITC-小鼠IgG_2a、PerCP-小鼠IgG_2a、APC-小鼠IgG_2a、PE-小鼠IgG_2a单抗各20 µl，上FACS Calibur流式细胞仪进行检测，抗体及仪器均为美国BD公司产品，通过CELL Quest软件分析CD3⁺CD4⁺/CD3⁺、CD3⁺CD4⁺CD25⁺/CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD3⁺CD4⁺细胞比例。

6．ELISA法检测血浆中p-STAT5浓度：采用人磷酸化（p）-Stat5 ELISA试剂盒（美国BIM Bioscience公司产品），实验要求和步骤严格按照说明书进行，450 nm波长处测定各孔的吸光度值。绘制标准曲线，计算样品p-Stat5浓度。

7．RQ-PCR检测外周血中Stat5及Foxp3 mRNA表达：Stat5（货号DHS065456）、Foxp3（货号DHS067532）、ACTB（货号DHS579991）引物由上海杏园生物科技有限公司合成。提取单个核细胞的总RNA，按照TransScript Green One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司产品）进行PCR反应。反应条件：逆转录，45 °C 5 min；预变性，94 °C 30 s；40个循环的扩增，95 °C 10 s，60 °C 30 s。以ACTB为内参照，使用LightCycler相对定量软件计算目的基因的相对定量表达。

8．统计学处理：应用SPSS 19.0软件进行统计分析，非正态分布数据以中位数（四分位距）表示，铁过载组与对照组采用Mann-Whitney U检验进行组间比较，袪铁治疗前后数据采用两相关样本的Wilcoxon检验进行组间比较；正态分布数据以x±s表示，铁过载组与对照组比较采用独立样本的t检验，袪铁治疗前后数据采用配对t检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．铁过载对较低危MDS患者铁代谢指标、EPO、Stat5、Treg细胞表达及红细胞生成的影响：与对照组相比，铁过载组SF、SI及EPO水平明显升高，TIBC、Stat5 mRNA相对定量、p-Stat5、Ret、HGB表达明显降低（P值均<0.05）。与对照组Treg细胞表达比较，铁过载组CD3⁺CD4⁺/CD3⁺比例升高，Foxp3 mRNA相对定量、CD3⁺CD4⁺CD25⁺/CD3⁺CD4⁺及CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD3⁺CD4⁺比例降低（P值均<0.05）（表1）。

表1. 低危/中危-1骨髓增生异常综合征患者铁过载组和对照组铁代谢指标、EPO、Stat5、Treg细胞表达及红细胞生成比较[x±s或M（Q）].

组别	例数	SF（µg/L）	SI（µmol/L）	TIBC（µmol/L）	EPO（U/L）	Stat5 mRNA（×10−3）	磷酸化Stat5（ng/L）
铁过载组	22	4 382.53±67.26	39.84±9.83	33.58±6.74	4 454.58±66.74	1.70（1.23）	30.95±11.98
对照组	20	386.32±19.81	30.81±7.52	47.22±7.63	798.93±28.27	16.29（8.50）	167.54±52.08
统计量		255.568	3.316	−6.152	234.788	−4.998	−11.457
P值		<0.001	0.002	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

组别	例数	Foxp3 mRNA（×10−3）	CD3+CD4+/CD3+（%）	CD3+CD4+CD25+/CD3+CD4+（%）	CD3+CD4+CD25+Foxp3+/CD3+CD4+（%）	Ret（×109/L）	HGB（g/L）
铁过载组	22	0.85（0.40）	53.48±9.82	13.31±4.29	0.88±0.41	3.22±1.79	38.41±6.19
对照组	20	2.82（1.15）	42.91±5.31	23.51±5.75	3.03±0.86	17.51±4.79	59.61±7.74
统计量		−4.740	4.392	−6.555	−10.178	−13.040	−9.846
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

注：SF：血清铁蛋白；SI：血清铁；TIBC：总铁结合力；Ret：网织红细胞绝对计数；正常参考值范围：SF 22~322 µg/L，SI 12.5~32.2 µmol/L，TIBC 45~82 µmol/L，EPO 4.3~29.0 U/L，Ret（28.7~75.0）×10⁹/L

2．祛铁治疗后铁代谢指标、EPO、Stat5、Treg细胞表达及红细胞生成的变化：祛铁治疗后SF、SI、EPO较治疗前明显下降，TIBC、Stat5 mRNA相对定量、p-Stat5、Ret、HGB较前升高（P值均<0.05）。Treg细胞表达比较，治疗后CD3⁺CD4⁺/CD3⁺比例较前降低，Foxp3 mRNA相对定量、CD3⁺CD4⁺CD25⁺/CD3⁺CD4⁺及CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD3⁺CD4⁺比例较前明显升高（P值均<0.05）（表2）。

表2. 18例低危/中危-1骨髓增生异常综合征铁过载患者接受祛铁治疗前后铁代谢指标、EPO、Stat5、Treg细胞表达及红细胞生成比较[x±s或M（Q）].

组别	SF（µg/L）	SI（µmol/L）	TIBC（µmol/L）	EPO（U/L）	Stat5 mRNA（×10−3）	磷酸化Stat5（ng/L）
祛铁前	4 536.56±53.16	40.59±8.62	32.27±7.49	4 663.77±68.29	1.69（0.91）	29.82±12.37
祛铁后	2 853.32±47.66	31.96±7.83	40.62±8.17	2 624.87±51.23	4.50（1.49）	74.62±19.55
统计量	16.740	12.631	−9.544	11.477	−3.724	−14.514
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

组别	Foxp3 mRNA（×10−3）	CD3+CD4+/CD3+（%）	CD3+CD4+CD25+/CD3+CD4+（%）	CD3+CD4+CD25+ Foxp3+/CD3+CD4+（%）	Ret（×109/L）	HGB（g/L）
祛铁前	0.82（0.38）	54.35±9.84	12.80±4.50	0.85±0.39	2.86±1.69	36.17±6.01
祛铁后	1.64（0.67）	46.29±7.26	18.55±4.23	2.86±0.78	7.82±2.81	50.61±7.11
统计量	−3.726	6.532	−13.527	−17.751	−11.271	−7.962
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

注：SF：血清铁蛋白；SI：血清铁；TIBC：总铁结合力；Ret：网织红细胞绝对计数；正常参考值范围：SF 22~322 µg/L，SI 12.5~32.2 µmol/L，TIBC 45~82 µmol/L，EPO 4.3~29.0 U/L，Ret（28.7~75.0）×10⁹/L

讨论

长期输血依赖的MDS患者会出现铁过载，而骨髓无效造血也会导致原发铁过载[6]。本研究结果显示，在对照组非输血依赖的MDS患者中，SF也较正常参考值偏高，可能与低危/中危-1 MDS患者骨髓无效造血有关。铁过载组患者SF明显增高，但SI未同比例升高，可能与铁从巨噬细胞向血浆释放障碍有关。高铁浓度引起铁调素水平升高，可减少铁从巨噬细胞向血浆释放。继发性血色病造成转铁蛋白合成不足，可导致TIBC降低。祛铁治疗后TIBC较前升高。

EPO与EPO受体结合后可使受体胞内区的Stat5酪氨酸发生磷酸化而被激活，活化的胞内p-Stat5蛋白引发下游信号转导通路，使红细胞进一步增殖分化成熟[7]。Stat5还作为祖红细胞表面Epo-R下游区抗凋亡信号子发挥抗凋亡作用，维持祖红细胞的生存[8]。铁过载组患者EPO浓度明显升高，Stat5 mRNA和p-Stat5的表达却较对照组明显减少，表明铁过载可能导致了EPO抵抗，抑制了EPO-Stat5信号通路的表达。体内循环EPO水平升高，可能是对信号通路缺陷的一个补偿效应。过量铁促使线粒体内的蓄积铁（FtMt）高表达，FtMt可通过减少p-Stat5促进细胞调亡，并将胞质内游离铁隔离至线粒体内干扰血红素合成[9]。FtMt高表达时产生的病理效应，可能是导致Stat5减少的原因。祛铁治疗后，Stat5 mRNA和p-Stat5表达升高，可能与体内活性氧减少，线粒体内FtMt降低，减少了对Stat5的抑制有关。

激活的T细胞介导的免疫损伤是低危/中危-1 MDS重要发病机制之一。MDS患者自身T淋巴细胞在体外可以抑制红系祖细胞增殖，从骨髓细胞中移除T细胞则可以增强集落的形成[10]。Treg细胞是抑制免疫反应的重要细胞。T细胞受体诱导CD25（IL-2受体α链）高表达，IL-2受体激活Stat5，Stat5与Foxp3启动子结合，诱导Foxp3表达。MDS早期Treg细胞不能有效归巢至骨髓去调节免疫反应[11]，可能是导致T细胞过度活化介导免疫损伤的原因之一。铁过载组CD3⁺CD4⁺/CD3⁺细胞比例升高，表明T细胞免疫失衡加重。Foxp3 mRNA及CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD3⁺CD4⁺表达较对照组下降，祛铁后较前升高，表明铁过载可能影响Foxp3的表达。CD3⁺CD4⁺CD25⁺/CD3⁺CD4⁺比例降低，显示CD25表达受抑制。Foxp3低表达可能受Stat5降低的影响。Treg细胞低表达加重活化T细胞造成的免疫损伤。

综上所述，祛铁治疗可上调Stat5 mRNA和p-Stat5的表达，部分恢复EPO-Stat5通路对红系造血的作用，增强红系造血的功能；同时诱导CD3⁺CD4⁺ T细胞CD25和Foxp3表达，平衡免疫应答，减少T细胞介导的免疫损伤对红系造血的负面影响。