EBV相关淋巴瘤的靶向治疗研究进展

EBV是一种嗜人B淋巴细胞的双链DNA病毒，属于疱疹病毒科γ亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒。EBV感染呈全球性分布，90%以上的成人血清EBV抗体阳性。EBV主要通过唾液传播，也可以血液传播，感染者终生携带病毒[1]。通常EBV感染是无症状的。但是，EBV具有强大的淋巴细胞生长转化能力，并与淋巴增生性病变和恶性淋巴瘤相关[2]。与EBV相关的淋巴瘤包括B细胞来源的Burkitt淋巴瘤（BL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、移植后淋巴细胞增殖性疾病（PTLD）、NK/T细胞淋巴瘤等。EBV相关的淋巴瘤多为恶性肿瘤，预后极差，传统的手术、化疗及放疗疗效不佳，并伴严重的不良反应。利妥昔单抗（Rituximab）已经成为治疗CD20阳性B细胞淋巴瘤的一线用药，其在HSCT后的PTLD中的疗效可达65%~100%。但是利妥昔单抗常出现耐药[3]。因此，需要积极寻找新的治疗策略。近年来，随着对EBV致癌性基因表达产物及相关致癌机制研究的不断深入，基于靶向病毒的治疗策略日益重要。本文将对目前国内外针对EBV相关淋巴瘤的靶向治疗的进展以及应用现状进行综述。

一、EBV潜伏感染

EBV基因组可编码近100种病毒蛋白，但静息记忆细胞通过将基因表达限制为不同模式的9种病毒潜伏蛋白来逃避免疫识别，包括EBV基因核抗原1、2、3a、3b、3c和EBV基因核抗原-LP，EBV潜伏膜蛋白1、2a、2b，EBV编码的RNA（EBER1和EBER2）和BamHI-A区右向框（BART）[4]。基于潜伏感染的记忆B细胞中EBV抗原表达的模式的不同，分为4种类型：0型：EBV存在于记忆性B细胞中，表达EBER、miRNA，为健康携带者；Ⅰ型：EBNA1、EBER、miRNA的表达，主要出现于BL。Ⅱ型：表达EBNA1、LMP、EBER、miRNA，与鼻咽癌、HL、NK/T细胞淋巴瘤和老年DLBCL相关。Ⅲ型：全部表达EBNA、LMP及EBER、miRNA，与免疫受损患者的淋巴增生性疾病相关，如PTLD。

二、细胞通路抑制剂

LMP1是EBV潜伏期基因表达产物，能模拟组成性激活的CD40受体和细胞TNF受体相关因子（TRAF），诱导各种下游途径，包括NF-κB、PI3K-Akt和STAT3，促进B细胞增殖和抗凋亡。蛋白酶体抑制剂Bortezomib，可通过抑制NF-κB途径诱导EBV淋巴母细胞系凋亡[5]。有实验表明，抑制LMP1/LMP2A激活的PI3K-Akt信号通路也可降低NF-κB通路的激活[6]。PD-L1通过LMP1激活的NF-κB通路上调，并且和NK/T细胞淋巴瘤的不良预后有关[7]。Kwong等[8]用PD-1抗体Pembrolizumab治疗7例L-门冬酰胺酶治疗失败的复发难治的NK/T细胞淋巴瘤患者，有效率为100%，其中5例患者获得了完全缓解（CR）。Li等[9]用Pembrolizumab治疗晚期复发的7例NK/T细胞淋巴瘤患者，有效率为57.1%，其中2例获得了CR。将信号通路抑制剂及PD-L1/PD-1抗体用于EBV相关淋巴瘤中有望为更多患者提供生存机会。

LMP2A可增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达，改变DNA和RNA新陈代谢相关基因表达。在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中都能够检测出来，并且在鼻咽癌、淋巴瘤等肿瘤细胞中能稳定表达[10]。LMP2A可以通过调控Syk、PI3K/Akt/mTOR等细胞信号通路介导B淋巴细胞的生存与增殖。通过阻断Syk、PI3K、Akt、mTOR等信号通路成为治疗EBV相关肿瘤的潜在靶点。例如，Akt抑制剂MK2206已进行临床试验用于检测其治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）和HL的效果[10]–[11]。在EBV相关的B细胞淋巴瘤细胞及EBV阳性的PTLD组织样本中发现PI3K/Akt/mTOR通路被激活，mTOR抑制剂雷帕霉素能调节细胞周期并抑制细胞生长[12]。Furukawa等[13]发现，同时应用mTOR抑制剂及PI3Kδ抑制剂，可以增强EBV阳性B细胞淋巴瘤的增殖作用。Kawada等[14]的研究结果表明，在T和NK细胞淋巴瘤中，mTOR抑制剂可以减少细胞生长，但不能导致细胞死亡，单剂治疗是有限的。目前已经有一些mTOR抑制剂和其他抗癌药物的联合实验[15]。硼替佐米和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸对EBV相关淋巴瘤的抗肿瘤作用已被证实[16]–[17]。这些药物和mTOR抑制剂的组合有望改善EBV相关淋巴瘤的治疗策略。

三、细胞免疫疗法

病毒相关抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）通过过继输注来自异体或者自体的淋巴细胞，可重建T细胞免疫反应，不仅可直接清除受感染的B淋巴细胞，抑制B淋巴细胞扩增治疗PTLD，还可以产生长期记忆效应，防止疾病复发。CTL已经成为抗病毒及病毒相关肿瘤的一种有效治疗方案[18]。

1．潜伏期Ⅲ型淋巴瘤与CTL：EBV潜伏期Ⅲ型恶性肿瘤如PTLD表达所有的EBV核抗原，这使得PTLD具有高度免疫原性，从而成为EBV-CTL的过继性T细胞治疗的首选。将EBV血清反应为阳性的供者来源的病毒特异性淋巴细胞分离后，直接输注给患者，即供者淋巴细胞输注（DLI）来恢复患者的EBV特异性免疫，已达到了超过70%的有效率，但是这种方法发生GVHD风险高[19]。为了减少GVHD的风险，早期有研究者利用EBV转化的B淋巴母细胞系（LCL）作为抗原呈递细胞（APC），制备EBV特异性T细胞。101例患者在HSCT后接受EBV特异性CTL预防性治疗，没有患者发生PTLD。另外13例已经发生PTLD的患者中有11例在接受供者来源的EBV特异性T细胞治疗后获得了持久的CR[20]。为了验证EBV特异性CTL的安全性，Doubrovina等[19]研究了49例PTLD的患者，其中30例接受DLI治疗，19例接受EBV-CTL治疗，两组疗效相似，70%的患者获得了CR或者部分缓解（PR）。但是EBV-CTL组没有发生患者GVHD，DLI组有17%的患者发生了GVHD。更为重要的是，对比嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗方案，EBV-CTL输注不会导致“细胞因子风暴”的产生[21]。不过，EBV-CTL的缺点是制备流程较为复杂，制备时间过长（约10周）。

虽然有研究表明HLA-肽多聚体分离法、γ干扰素捕获法可以加快分离获得EBV-CTL的进程，但是由于该两种方法均需要大量外周血，从而限制了其发展和临床应用[18]。第三方CTL库为治疗EBV相关疾病提供了新的途径，利用第三方供者来源的外周血单个核细胞，从中分离EBV特异性的CTL或者在体外进行扩增后，制备成相应的CTL细胞系，随后用多个不同供者来源的CTL细胞系构建成CTL库，经过HLA匹配后可以直接用于临床治疗。供者CTL与患者之间HLA匹配程度越高，治疗效果越好[22]。目前国内外已经有相关成功案例[22]–[23]。虽然减少了制备和鉴定的时间，但是其安全性，例如如何选择合适的第三方供者、HLA匹配的标准以及CTL制备和储存流程的标准化都是未来需要继续解决的问题。

2．潜伏期Ⅱ型淋巴瘤与CTL：在免疫活性宿主中，大约40%的HL和很大一部分的NHL（20%的DLBCL和超过90%的NK/T细胞淋巴瘤鼻型）与Ⅱ型EBV潜伏期有关，存在弱免疫原性EBV抗原（LMP1、LMP2和EBNA1）表达[24]。在Ⅰ型潜伏期淋巴瘤如BL中，仅表达EBNA1和BARF1，其免疫原性更弱。为了增强抗EBV Ⅱ型潜伏性淋巴瘤的活性，Bollard等[25]使用腺病毒载体（AdV）转导的树突状细胞（DC）和EBV转化的B型LCL作为APC，激活和扩增LMP-特异性T细胞。50例EBV相关的HL或NHL患者接受LMP2或LMP1/2特异性CTL输注，29例高危或多发/复发的患者中，28例在CTL输注后在中位3.1年内仍处于缓解期；21例在CTL输注时复发或耐药患者中，13例有临床反应，其中11例达到了CR。Cho等[26]利用LMP1/LMP2a RNA转导DC体外诱导扩增LMP1-CTL和LMP2a-CTL治疗10例EBV相关性结外NK/T细胞淋巴瘤患者，4年无进展生存率、总生存率达100%，且接受治疗后无急性或者慢性不良事件发生。另有学者开发了一种更快速的EBV-CTL，其表达LMP1、LMP2和EBNA1，所述EBV-CTL使用抗原呈递复合物（KATPX），该复合物由EBV肽与共刺激HLA阴性K562细胞激活的自体T细胞组成[27]，该方法已开展相关临床试验。

根据肿瘤免疫逃逸机制，对EBV-CTL进行相应修饰或采用去甲基化等方法增强病毒靶抗原表达，将增强免疫治疗的效果。此外，许多宿主CTL反应是针对病毒裂解蛋白，故可将诱导病毒裂解感染策略与EBV-CTL免疫治疗策略联合应用，将能够达到更强的抗肿瘤效果。

四、诱导EBV裂解感染

EBV裂解周期的激活主要由BZLF1的编码产物Zta与BRLF1的编码产物Rta这两种转录激活因子的协同作用来控制。在潜伏期阶段，这两种基因被高度地抑制了表达，当它们过度表达后，能激活EBV裂解基因的表达，即通过激活处于潜伏状态的EBV进入裂解复制周期，使得病毒及子代病毒的病毒蛋白能在一个较高的水平表达[28]。EBV的裂解复制可杀伤癌细胞和其他EBV感染细胞，并可引发宿主细胞对EBV的免疫应答[29]。临床上有甲基化抑制剂5-氮杂胞苷治疗EBV相关肿瘤患者的病例报道[30]。Mentzer等[31]采用去乙酰化抑制剂丁氯倍他松与更昔洛韦联合治疗EBV相关淋巴瘤取得了一定疗效。并发现在此过程中，病毒基因组编码的一些激酶可将更昔洛韦磷酸化成细胞毒物质三磷酸更昔洛韦，并可观察到明显的“旁观者”杀伤效应[32]。而潜伏感染的病毒不能产生这种作用。利用这一特点，通过诱导潜伏感染的病毒进入裂解感染，同时联合更昔洛韦可增强对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤效应，并可抑制传染性病毒体的传播。

五、潜在抗原靶点

EBV miRNA有调节多种细胞通路的能力，包括TP53、c-MYC、RAS。这为miRNA靶向治疗方法提供了理论依据。有研究表明，被EBV感染的细胞可以通过外泌体将病毒miRNA释放到未感染的细胞。有两个主要的簇，BART miRNA和BHRF1 miRNA（BamH1片段H右开放阅读框1）很多的EBV miRNA参与到病毒和细胞基因相互作用的淋巴瘤发生[33]。BHRF1 miRNA在Ⅲ型潜伏期高表达，但在Ⅰ型或Ⅱ型潜伏期几乎检测不到。EBV-miR-BHRF1-2为BHRF1 miRNA成员之一。PRDM1是B、T细胞及NK细胞淋巴瘤中的抑癌基因。Ma等[34]发现具有潜伏期Ⅲ型模式的EBV阳性PTLD和DLBCL中EBV-miR-BHRF1-2高水平的表达将通过限制PRDM1的表达而有利于淋巴瘤细胞的生长。EBV阳性BL以EBV潜伏期Ⅰ型为特征，不具有可检测的EBV-miR-BHRF1-2表达。然而，EBV阳性BL的前体最初来源于EBV感染的B细胞，类似于LCL细胞系潜伏期Ⅲ型感染[35]。因此，尽管BHRF1-2在EBV阳性BL的终末期中没有高表达，但在其发病的初期阶段可能高表达，并有助于肿瘤的发生。EBV-miR-BHRF1-2有作为EBV相关淋巴瘤的治疗靶点的潜力。还有如EBV-miR-BART9和BART17-5P可下调Bcl-6表达，最终激活NF-κB通路，促进淋巴细胞增殖[36]。EBV miRNA可能成为未来有价值的生物标志物和治疗靶点。

另外，EBNA1在病毒基因组复制和繁殖中起重要作用，靶向EBMA1和抑制其活性的药物将削弱病毒的复制及繁殖。EBNA1在所有携带EBV的肿瘤中的表达，使其成为了一个潜在的肿瘤细胞特异性靶点。

六、总结与展望

EBV感染与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，EBV阳性的肿瘤预后相对于EBV阴性的肿瘤差，治疗EBV感染可改善EBV相关肿瘤的预后[37]。随着对EBV感染的发病机制的不断深入了解，我们可以从多角度，多方面去制定预防及治疗策略。近年来，很多EBV相关淋巴瘤的靶向治疗研究与临床实践虽然已经展现了良好的前景，但其具体机制和疗效还需要进一步地探索。同时，基于目前的靶向免疫治疗手段，形成联合治疗方案，优化EBV相关淋巴瘤的治疗策略，可能成为未来免疫治疗的新方向。