S100A6、Notch1在多发性骨髓瘤患者中的表达及其临床意义

Abstract

目的

探讨S100A6、Notch1在多发性骨髓瘤（MM）患者中的表达及其临床意义。

方法

以28例MM患者为研究对象，以20例白细胞、血小板略低但骨髓检查未见异常者为对照，采用real time PCR法检测骨髓单个核细胞S100A6、Notch1的表达；采用免疫组化染色法检测S100A6、Notch1蛋白在MM患者骨髓和髓外浸润组织活检病理切片中的表达；采用real time PCR法和Western blot法检测siRNA沉默骨髓瘤U266细胞S100A6基因后对Notch1 mRNA和蛋白水平的影响。并结合临床进行相关分析。

结果

①S100A6、Notch1 mRNA表达水平：初发MM患者组分别为2.19±1.25、2.98±0.64，均高于对照组（0.71±0.20、0.58±0.39）和稳定期患者组（0.85±0.26、0.72±0.40）（P值均<0.05）；伴髓外转移组（8例）分别为3.36±1.23、5.71±3.96，均高于无髓外转移组（20例）（1.40±0.25、1.16±1.00）。②S100A6与Notch1 mRNA表达呈正相关（r=0.505，P=0.007）。③MM患者骨髓和髓外浸润组织活检病理切片均可见浆细胞S100A6、Notch1阳性表达。④siRNA转染U266细胞48 h后S100A6基因表达沉默，Notch1 mRNA及蛋白水平明显下降。

结论

S100A6、Notch1表达与MM疾病发生、进展、髓外转移相关，二者具有显著相关性，可作为MM诊断及预后的指标。

近年来，随着硼替佐米、卡非佐米、来那度胺等新药的应用，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者的生存质量有了很大改善。但多数患者最终产生耐药，而异基因造血干细胞移植的相关死亡率较高，故深入研究其发病机制并寻找新的靶向基因显得十分必要[1]–[3]。

钙粒蛋白A6（S100A6）是S100蛋白家族的一个重要成员，通过与钙离子及靶蛋白的相互作用，在体内发挥多种生物学作用。其在多种实体肿瘤中表达异常，与肿瘤的增殖、浸润转移和凋亡密切相关[4]–[6]，但在血液系统肿瘤中的表达及作用尚鲜有报道。Notch信号通路是一个较为重要的涉及造血细胞增殖和凋亡的信号转导通路。Notch1能够抑制骨髓瘤细胞凋亡，且能诱导骨髓瘤细胞耐药[7]。我们通过检测MM患者S100A6及Notch1的表达旨在探索其在MM发生、发展中的意义，并通过siRNA沉默骨髓瘤U266细胞S100A6基因后观察其对Notch1的影响，以明确二者在MM中的相关性。

对象与方法

1．研究对象：以2010年1月至2014年12月在我院初诊的28例MM患者为研究对象，其中男16例，女12例，平均年龄62岁。MM诊断及疗效标准参照中国MM诊治指南（2015年修订）。国际分期系统（ISS）分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期7例，Ⅲ期13例；IgG型15例，IgA型8例，轻链型5例。28例患者均接受化疗，治疗方案包括VAD（长春新碱、多柔比星、地塞米松）、PD（硼替佐米、地塞米松）及PCD（硼替佐米、环磷酰胺、地塞米松）方案。以20例白细胞、血小板略低但骨髓检查未见异常者为对照，男12例，女8例，平均年龄60岁。随访资料通过查阅病历及电话联系获得。本研究得到患者及对照者知情同意并获得医院医学伦理委员会审批通过。

2．主要试剂与仪器：TRIzol、Lipofectamine™ 2000脂质体转染试剂为美国Invitrogen公司产品，cDNA第一链合成试剂盒为美国Thermo公司产品，普通梯度PCR仪为美国Labnet公司产品，荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，凝胶成像仪为美国BIO-RAD公司产品。siRNA为前期研究中从设计的靶向S100A6（Gen Bank Accession）的4条序列中确定的敲除效应最佳的干扰序列，siRNA-NC为与人类基因组序列无任何匹配的阴性对照序列，由上海吉玛制药技术有限公司合成。S100A6鼠抗人单克隆抗体购自美国BD公司，辣根过氧化物酶羊抗鼠二抗（FITC标记），购自美国Beckman Coulter公司。直标辣根过氧化物酶鼠抗人GAPDH抗体购自上海西唐生物科技有限公司。

3．real-time PCR法检测S100A6、Notch1 mRNA表达：化疗前和化疗4~6个疗程后分别采集MM患者骨髓3 ml（肝素抗凝），分离单个核细胞，对照组标本采集和处理方法同上。提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA。以GAPDH为内参照，实验中所用引物序列见表1。S100A6及Notch1 mRNA表达水平以2^−ΔΔCT表示，ΔCT=CT _目的基因−CT_GAPDH，ΔΔCT=ΔCT_待测标本−ΔCT_内对照。

表1. 检测S100A6、Notch1 mRNA表达所用引物序列.

基因名称	序列（5′→3′）	片段大小（bp）
S100A6	上游：CATCTTCTTTTGCGTCGCCA	107
	下游：TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC
Notch1	上游：GAAGGAGCTGATCCAGAAGG	156
	下游：AGTTCACCTCTGGTCCTTG
GAPDH	上游：GGACCTCATCAACTCACACG	115
	下游：GGTGTCTCCTCCCTGTTGTT

4．免疫组化染色法检测MM患者骨髓及髓外浸润组织S100A6、Notch1表达：对MM患者骨髓或髓外浸润组织活检病理石蜡标本行4 µm连续切片，常规脱蜡、复水、高压热修复，3% H₂O₂消除内源性过氧化物酶，5%胎牛血清封闭，滴加一抗4 °C过夜，滴加二抗，DAB显色，复染，脱水，树胶封片后观察。

5．U266细胞siRNA转染：U266细胞为我科实验室常规保存细胞。细胞于含1 mmol/L L-谷胺酰氨和10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37 °C、5%CO₂的环境下传代，取对数生长期的细胞用于实验。实验分组：①空白对照组：仅转染脂质体；②阴性对照组：转染阴性对照siRNA-NC；③S100A6 siRNA干扰组：转染S100A6 siRNA。每组设3个复孔，实验重复3次，实验数据以平均数表示。

6．real-time PCR法检测siRNA转染后U266细胞S100A6、Notch1 mRNA表达：提取转染48 h后的各组U266细胞总RNA，逆转录及real-time PCR法检测S100A6、Notch1 mRNA表达，方法同前。

7．Western blot法检测siRNA转染后U266细胞S100A6、Notch1蛋白表达：收集转染72 h后的各组U266细胞（1×10⁷），加细胞裂解液裂解，行120 g/L SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜，2%胎牛血清封闭过夜，加入抗S100A6、Notch1抗体孵育，0.1% Tween-PBS洗涤后加入羊抗鼠二抗孵育，ECL显色，暗室曝光显影。采用凝胶成像分析软件对条带进行分析。

8．统计学处理：随访截至2014年12月31日。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．real-time PCR法检测骨髓单个核细胞S100A6、Notch1 mRNA的表达：初发MM患者组S100A6的表达水平为2.19±1.25，高于对照组（0.71±0.20，t=3.938，P=0.001）和稳定期MM患者组（0.85±0.26，t=3.958，P=0.001），差异均有统计学意义；初发MM患者组Notch1 mRNA的表达水平为2.98±0.64，也高于对照组（0.58±0.39，t=2.205，P=0.037）和稳定期患者组（0.72±0.40，t=2.376，P=0.032），差异均有统计学意义。

28例MM患者中伴髓外转移者8例，无髓外转移者20例。伴髓外转移者S100A6、Notch1 mRNA的表达水平分别为3.36±1.23、5.71±3.96，均高于无髓外转移者（1.40±0.25、1.16±1.00）。

2．MM患者骨髓单个核细胞S100A6、Notch1表达的相关性分析：将28例初发MM患者单个核细胞S100A6与Notch1的表达进行相关性分析，r=0.505，P=0.007，S100A6与Notch1表达呈正相关。

3．MM患者骨髓及髓外浸润组织S100A6、Notch1的表达：免疫组化染色法检测结果显示无髓外转移和伴髓外转移的MM患者骨髓活检浆细胞均可见S100A6、Notch1表达阳性（图1A~D），髓外软组织转移灶中浆细胞也可见S100A6、Notch1表达阳性（图1E、F）。

图1. 免疫组化染色法检测多发性骨髓瘤患者S100A6、Notch1表达（低倍）.

A：无髓外转移患者骨髓活检浆细胞S100A6表达；B：无髓外转移患者骨髓活检浆细胞Notch1表达；C：伴髓外转移患者骨髓活检浆细胞S100A6表达；D：伴髓外转移患者骨髓活检浆细胞Notch1表达；E：患者髓外浸润组织浆细胞S100A6表达；F：患者髓外浸润组织浆细胞Notch1表达

4．siRNA对S100A6、Notch1 mRNA和蛋白表达的影响：real-time PCR法检测结果显示，siRNA转染U266细胞48 h后，S100A6基因表达沉默，Notch1 mRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2. real-time PCR法检测siRNA转染U266细胞48 h后对其S100A6、Notch1基因表达的影响（x±s）.

组别	S100A6			Notch1
	表达水平	t值	P值	表达水平	t值	P值
阴性对照组	1.18±0.32			0.94±0.28
空白对照组	1.27±0.41	−0.223	0.828	0.96±0.32	0.140	0.892
S100A6 siRNA干扰组	0.05±0.02	7.694	0.002	0.08±0.03	6.959	0.002

注：表中t、P值均为与阴性对照组比较。每组设3个复孔，实验重复3次

Western blot法检测结果显示，SiRNA转染U266细胞72 h后，S100A6 siRNA转染组S100A6、Notch1表达较空白对照组和阴性对照组明显下降。内参GAPDH表达三组无差别。示S100A6 siRNA干扰可致U266细胞S100A6、Notch1总蛋白表达下降（图2）。

图2. Western blot法检测siRNA对U266细胞S100A6、Notch1蛋白表达的影响.

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：S100A6 siRNA干扰组

讨论

新近研究发现Notch1信号通路参与MM的发生、发展，且是影响肿瘤侵袭、耐药的关键因素[8]。检测MM细胞株及MM患者骨髓标本结果显示存在Notch1蛋白的过度表达，初步表明Notch信号与MM发病相关。Notch1的活化信号可抑制药物诱导的细胞凋亡，活化的Notchl可阻断骨髓瘤细胞的凋亡，而蛋白酶体抑制剂诱导MM细胞株凋亡的同时伴有Notch1表达的降低。Notch1通过磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）-eIF4E途径抑制mTOR，进一步抑制p53，使细胞具有化疗抗性[9]。

Notch1信号通路与MM的发生具有密切的联系，骨髓瘤细胞和骨髓瘤基质细胞表达大量Notch1受体和配体，激活Notch1信号通路对骨髓瘤的发生和耐药起重要作用，因此，Notch1信号通路成为骨髓瘤治疗的候选新靶点[10]。但其诱导骨髓瘤细胞凋亡的机制尚未完全明确，其如何通过受体、配体、下游基因及其他效应物影响骨髓瘤的发生、转移、浸润机制亦需进一步阐明。

S100A6的分布具有细胞、组织特异性，并与肿瘤的增殖、浸润转移和凋亡密切相关[4]–[5]。S100A6与肿瘤的相关性近年多有报道。Hua等[11]报道S100A6在肝细胞上表达增高，并对肝细胞肿瘤生长、侵袭起促进作用。Vimalachandran等[12]的实验表明S100A6在胰腺恶性细胞上的表达较良性细胞明显增高，在恶性细胞，胞核S100A6的表达较胞质增高。单因素分析显示胞核高表达S100A6的患者生存时间明显缩短。多因素分析表明胞核高表达S100A6为影响胰腺癌患者生存的独立预后因素，但相关机制尚不清楚。

在血液肿瘤中，Tamai等[13]的研究表明S100A6基因上调及p53-caspase 8-caspase 3途径的抑制可能为MLL-AFF1阳性急性淋巴细胞白血病（ALL）患者预后差的原因之一。通过siRNA干扰S100A6，表明S100A6可通过抑制p53-caspase 8-caspase 3途径抑制TNF-α，从而抑制MLL-AFF1阳性ALL细胞凋亡。但在MM中，S100A6的作用尚未见报道。

我们采用real time PCR法检测28例MM患者骨髓单个核细胞S100A6、Notch1基因的表达，比较MM患者组与对照组、疾病初诊期与稳定期、伴髓外转移与无髓外转移者之间S100A6、Notch1表达的差异，并通过免疫组化染色法检测S100A6、Notch1蛋白在MM患者骨髓及髓外浸润组织活检病理切片中的表达，siRNA沉默骨髓瘤U266细胞S100A6基因后观察其对Notch1的影响，以明确二者在MM中的相关性。结果表明：初诊的MM患者骨髓单个核细胞较对照组高表达S100A6及Notch1（P值均<0.05），MM患者疾病初发期S100A6与Notch1基因表达均高于治疗后稳定期（P值均<0.05）。伴髓外转移者S100A6与Notch1基因表达亦较无髓外转移者高，且统计学分析初诊患者的S100A6与Notch1表达明显相关。MM患者骨髓活检及髓外浸润组织中浆细胞免疫组化S100A6、Notch1表达均阳性，siRNA沉默骨髓瘤U266细胞S100A6基因后，Notch1基因及蛋白明显下降，进一步印证Notch1与S100A6表达的相关性。

综上，我们的实验结果表明在MM患者中S100A6及Notch1水平与MM发生、发展、髓外浸润相关，可共同作为预测MM发病、提示预后的相关指标。S100A6、Notch1在MM中的表达存在明显相关性，二者在MM发病中如何相互作用及具体作用机制仍需进一步实验证明。

Funding Statement

基金项目：南京医科大学科技发展基金重点项目（2012NJMU089）；江苏省“六大人才高峰”第11批次高层人才选拔培养资助项目（WSN-019）

Fund program: The Key Projects of Science and Technology Development Fund in Nanjin Medical University（2012NJMU089）；The Eleventh Batches of Senior Personnel Selection and Training Projects Fund for the Six Major Talent Peak in Jiangsu Province（WSN-019）