自噬在白血病中的作用及研究进展

白血病是一类造血干细胞克隆增殖性疾病，目前有许多关于其发病机制及治疗方面的研究。自噬是将无功能细胞组分包裹至双层膜囊泡，随后与溶酶体融合成为自噬溶酶体，降解被包裹物质为小分子物质从而实现能量再循环的过程。自噬在正常细胞中以低水平活化形式存在，具有维持细胞、机体稳态的作用，参与体内的多种生理病理过程，包括代谢、造血、免疫监视、感染、炎症等。随着自噬分子机制的揭示，自噬在血液恶性疾病中的作用日益得到重视。自噬在不同类型的白血病中发挥不同的作用，为改善临床疗效提供了一条新的途径。

一、自噬的定义及功能

自噬，又被称为细胞的“自我消化”（self-digestion），是细胞在应对内外持续性应激时，通过在自噬溶酶体中降解受损的蛋白质、细胞器等实现维持细胞结构、代谢和功能平衡的过程[1]。

自噬包括多种类型，哺乳动物细胞自噬主要分为大分子自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA），其机制及功能各不相同。大分子自噬指胞质内待降解底物被脂质双分子层的自噬体包裹，随后与溶酶体融合后实现降解的过程；微自噬是溶酶体膜通过内陷直接将胞内物质包裹实现降解；CMA则需底物蛋白特定的五肽序列与胞质中的分子伴侣结合，再被运送至溶酶体腔实现降解的过程[2]。目前对于自噬的研究主要集中在大分子自噬，其机制也研究得较为清楚，故自噬在狭义上即为大分子自噬。

自噬是一个多步骤发生的连续复杂过程，主要由自噬相关基因（autophagy-related genes, ATG）介导发生，目前报道已有超过30种ATG蛋白参与自噬的发生。自噬过程的发生主要分为以下几个阶段：自噬信号诱导、囊泡成核、自噬体延长封闭、自噬体与溶酶体融合并对底物进行降解。在诱导阶段，上游信号（如饥饿、缺血、缺氧等）激活ULK1激酶复合体，随后核化过程募集更多蛋白分子至自噬体组装位点（PAS），促进胞质和内质网来源的膜相互聚集，形成具有双层膜结构的自噬泡；随后，自噬泡不断延伸并包裹部分细胞质和待降解的蛋白质、细胞器，形成封闭的成熟自噬体；最后，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将内容物呈递给溶酶体酶进行降解并再次进入胞内循环[3]。

正常情况下，自噬可清除损伤的线粒体，减少活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生、维持基因组的稳定性、参与DNA损伤的修复[4]。应激条件下，自噬通过降解细胞内的大分子物质和受损的细胞器，产生葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等能量物质，从而有效应对应激。同时，自噬发生过度，又能导致细胞死亡，是非凋亡死亡的一种主要形式。自噬已成为科学研究的重要领域[5]。研究表明自噬广泛参与运动生理适应过程，与免疫系统形成、发育、造血及衰老相关，此外自噬与许多疾病的发生密切相关，如癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性炎症、阿尔茨海默病和帕金森病等[6]–[7]。

二、自噬调控的分子机制

自噬发生的核心机制在果蝇高达40种蛋白，在哺乳动物则更多，过程十分复杂。自噬的启动主要与是通过ULK1复合体实现。人类ULK1复合体主要由ULK1、FIP200、ATG13和ATG101组成，可作用于下游class Ⅲ PI3K复合体、ATG9、ATG2等多个蛋白诱导自噬启动及囊泡成核[8]。鉴于自噬在维持细胞内环境稳定、应对应激及多种生理病理过程中的重要作用，自噬必然受到严格的调控以避免过度活化或活化不足。目前报道有多条信号通路与ULK1复合体相互作用以应对不同的外界应激[9]–[10]。

其中研究最多的自噬调节因子是mTOR复合体（mTOR complex, mTORC）。mTOR是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是生长因子、营养及能量状态的核心感受器，调节细胞生长、增殖、运动、存活等多个过程，在细胞生长和凋亡中发挥重要作用。mTOR存在两种不同复合物形式，根据两者对雷帕霉素的敏感性分为对雷帕霉素敏感的mTORC1和不敏感的mTORC2[11]。其中，mTORC1是调节自噬的关键蛋白，在自噬发生中起“门控作用”（gate keeper）。在整合胰岛素、生长因子、能量代谢等信号后，class Ⅰ PI3K与AKT相互作用，活化mTORC1，后者磷酸化ULK1复合体，抑制后者对下游ATG蛋白的激活作用，从而抑制自噬发生[10]。mTORC1在细胞营养缺乏或者生长因子低水平时失活，对ULK1复合体的抑制作用消失，此时ULK1发生自磷酸化并磷酸化Atg13，募集其他ATG蛋白至PAS并可磷酸化下游底物促进自噬的启动及自噬体的形成。其中，Vps34复合体是ULK1复合体的重要底物，既可促进自噬的启动也可促进囊泡核化及自噬体成熟[1]。Vps34复合体由Beclin1、p150和Vps34构成核心成份，其中Vps34属于class Ⅲ PI3K家族。研究表明，在营养充足的情况下，Beclin1主要与抑凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL）结合，处于抑制状态；同时，mTORC1可通过Rubicon抑制Vps34复合体活化[12]。在营养不足及其他应激情况下，ULK1可直接磷酸化Beclin1和FIP200或通过Ambra1间接活化PI3K3C，调节脂质激酶Vps34活性，促进Beclin1-Vps34-p150复合体Ⅰ/Ⅱ（Atg14L/UVRAG）的形成，参与自噬体的形成和成熟[13]–[14]。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞和机体能量稳态的主要调节因子，可协调多种代谢途径以平衡能量供需，最终调节细胞和器官生长。作为机体能量感受器，AMPK主要通过监测AMP和ADP水平来检测细胞能量的微小变化，因而可被各种减少ATP生成的细胞应激激活，包括代谢毒素以及病理学提示，如葡萄糖缺乏、缺血和缺氧。当ATP/AMP比值下降时，AMP与AMPK结合引起后者构象改变并暴露LKB1磷酸化位点，使AMPK激活，能够直接磷酸化激活ULK1，或通过抑制mTORC1活性，间接激活ULK1复合体，从而促进自噬的启动[9],[15]（图1）。

图1. 自噬调控通路示意图.

此外，ULK1也能够反馈调节上游通路调控自噬[16]。ULK1能够磷酸化Raptor，从而抑制mTORC1活性，保证在自噬启动阶段mTORC1活性迅速下降，维持营养缺乏情况下自噬通路持续活化。同时，ULK1也能磷酸化AMPK使其处于抑制状态，从而发挥负反馈调节作用。近年发现，ULK1还能通过磷酸化Ambra1，促进后者与Beclin1的结合，进而促进自噬进展[10]。

自噬的分子诱导、调控机制十分复杂，除上述主要途径外，自噬还受到其他途径的调控，包括miRNA、表观修饰（如乙酰化、甲基化）及代谢[17]等的调控。近年发现，miRNA在自噬发生的多个环节均有影响，有研究表明，miR-30a可在自噬囊泡核化阶段抑制自噬的发生[18]；miR-23b则可在自噬体延伸阶段发挥作用[19]。Fullgrabe等[20]发现，在细胞启动自噬过程中，如果H4乙酰化水平降低，与自噬相关的基因就会表达减少，从而使自噬细胞发生死亡；此外，精氨酸甲基转移酶CARM1依赖性的组蛋白精氨酸甲基化也是自噬中一个至关重要的细胞核事件，AMPK-SKP2-CARM1信号轴在营养饥饿后可调节自噬和溶酶体相关基因表达[21]。这些都为研究自噬相关调控通路开辟了新领域。

三、自噬与白血病

白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。由于白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，使细胞分化停留在不同阶段，并导致骨髓及其他造血组织的浸润，正常造血功能受到抑制，临床表现为不同程度的贫血，出血，感染及肝脾、淋巴结肿大等症状。自噬与白血病的发生发展及治疗有密切联系，但在不同白血病类型中其作用亦可能随之发生改变。

1．自噬与白血病发生、发展：不同的生物学特性，包括疾病类型、驱动基因及抑癌基因活性，甚至不同方法构建的疾病模型等均会造成自噬对白血病的不同影响；同时，自噬本身调控的复杂多样性，同样可能导致其在肿瘤中的复杂作用[22]。

（1）自噬抑制白血病发生、发展：正常情况下，在细胞遭受严重的代谢压力时，DNA和蛋白质受到损伤，细胞依赖自噬将其清除，自噬能力下降将造成损伤的累积，最终引起肿瘤的发生，这可从许多发生癌变的细胞自噬能力下降得到证实[23]。PI3K-AKT-mTOR信号通路的组成性活化可以导致自噬水平的下降，而研究发现，该通路的过度活化与多种类型白血病的耐药及较差预后相关[24]。提示自噬对抑制白血病发生、进展均有重要作用。

自噬在肿瘤抑制中的作用在小鼠Beclin1（Beclin1^+/−）单等位基因缺失模型中最先得到证明。与Beclin1^+/+小鼠相比，Beclin1^+/−小鼠自发性肿瘤（包括淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌和腺癌）的发生率明显升高[23]。研究表明，mTOR抑制剂RAD001主要通过诱导自噬（而非凋亡）降低肿瘤负荷、延长生存期[25]；在儿童急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）中，往往发生低水平的自噬，以E2A-PBX1融合蛋白阳性的B-ALL为例，应用雷帕霉素促进自噬后可导致白血病细胞发生周期阻滞、增殖受抑，融合蛋白降解增多，小鼠肿瘤负荷明显下降[26]。对于化疗诱导的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），则必需依赖于自噬过程，后者通过增加ICD所必须的ATP促进这一过程[27]。

（2）自噬促进白血病发生、发展：自噬在肿瘤细胞发生应激如缺血、缺氧等情况时，可以通过降解胞内蛋白质、细胞器为肿瘤细胞提供营养和能量，还可以去除受损的细胞器，稳定细胞内环境，提高肿瘤细胞在恶劣环境中的生存能力，即作为一种促存活机制发挥作用。多项研究均支持自噬促进肿瘤发展的作用：在Palb2基因缺失的小鼠乳腺癌模型中，部分降低自噬水平可促进细胞凋亡，显著延缓乳腺癌的发展[28]；KRAS基因激活导致的小鼠肺癌的发生及浸润依赖于自噬水平的提高，而降低自噬水平可明显延缓肿瘤进展[29]。

融合性激酶如BCR-ABL可不依赖生长信号而持续活化，并导致肿瘤发生。研究表明，BCR-ABL阳性细胞依赖自噬存活，当敲除Atg3或使用自噬抑制剂阻断自噬发生后，可导致融合基因阳性的细胞应对应激能力下降，迅速发生凋亡，致白血病作用消失[30]。与正常骨髓细胞相比，慢性髓性白血病（CML）患者CD34⁺白血病干/祖细胞ATG4和Beclin1基因转录及表达水平明显升高，从而通过活化自噬促进CML干/祖细胞的存活[31]。白血病起始细胞（leukemia-initiating cell, LIC）是白血病细胞中具有自我更新能力的细胞，对疾病的维持及耐药均有重要作用。研究发现，自噬对急性髓系白血病（AML）小鼠LIC的存活具有重要作用，敲除Atg7抑制自噬可导致出现LIC出现ROS堆积，细胞死亡增加，疾病进展延缓[32]。这些现象均提示，抑制自噬可能改善耐药患者的临床疗效。

自噬发生及调控机制复杂，在不同类型白血病中可能发挥不同的作用，不同的研究方法或疾病模型对于研究自噬在白血病中的功能也可能导致不同的研究结果。因而自噬在肿瘤细胞中究竟是发挥促进存活还是促进死亡的作用仍然存在很大争议。总体说来，正常情况下，基础水平的自噬可通过清除有害细胞器、减少有害物质的产生从而保护正常细胞，避免其向肿瘤细胞转化，阻止肿瘤发生，即作为抑癌机制存在；而在进入肿瘤的状态后，自噬则反而会起到帮助肿瘤细胞，促进其自身存活的作用，也使肿瘤细胞出现对放化疗的耐受，此时自噬则可作为促癌机制存在。

2．自噬与白血病治疗：在化疗或放疗时，肿瘤细胞中可检测到自噬流改变，但究竟是促进细胞死亡还是存活仍有争议[33]。自噬在白血病治疗中的作用与其在白血病的发生发展的两面性一致。一方面，自噬也可以发挥抑制肿瘤的作用，通过允许有效的抗肿瘤免疫（effective antitumor immunity），保护正常组织细胞免受治疗影响发挥作用。另一方面，自噬作为促存活机制，参与某些类型白血病的耐药的发生，并且与白血病干细胞对药物的低敏感性有关。

（1）激活自噬治疗白血病：自噬在细胞遭受饥饿或应激状态时发生过度活化会使细胞发展为自噬性死亡，可以降解白血病融合蛋白，促进终末分化，介导放化疗的抗肿瘤免疫反应，自噬还可以维持未转化细胞稳态，保护正常细胞免受放化疗的不良影响，降低肿瘤治疗的不良反应[34]。因此，诱导自噬治疗白血病亦得到广泛关注。

融合蛋白PML-RARα和BCR-ABL1分别是急性早幼粒细胞白血病和CML的主要致病基因，研究证实的它们的降解有赖于药物引起的自噬反应[35]。PML-RARα能够与自噬降解蛋白p62/SQSTM1结合，抑制p62/SQSTM1的表达可以减弱维甲酸诱导的髓细胞的分化成熟，加入RAD001后在增强自噬的同时能够促进PML-RARα蛋白的降解和髓系细胞的分化成熟[36]；同样，砷剂诱导的BCR-ABL融合蛋白降解也需要自噬的参与[37]。

通过增加ROS的产生（褪黑激素，一氧化碳），激活AMPK（A-769662，Metformin）等促进自噬的启动在临床前研究中取得一定效果。目前用于临床研究的主要是靶向抑制mTORC1的药物。mTORC1的抑制剂RAD001在ALL小鼠模型中能够降低mTORC1下游蛋白磷酸化水平，提高Beclin1基因的表达，对ULK1复合体活性的抑制作用减弱，从而促进自噬，明显降低肿瘤负荷，延长小鼠生存期。mTORC1抑制剂联合化疗药也能够增强后者的杀伤作用。RAD001联合hyper-CVAD方案治疗复发/难治ALL取得较好效果，目前已完成Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT00968253）[38]；Temsirolimus联合UKALL R3方案治疗二次或二次以上复发儿童ALL可使超过50%的患者获得再次缓解（NCT01403415）[39]。PI3K/mTORC1双分子抑制剂BEZ235用于治疗复发/难治急性白血病目前也处于Ⅰ期临床试验（NCT01756118），有望改善该类患者的预后。

（2）抑制自噬治疗白血病：大量研究表明，肿瘤细胞存在凋亡缺陷，主要通过自噬来维持其存活。自噬以上述促存活机制，提高肿瘤细胞在恶劣环境如放化疗时的生存能力，参与白血病的化疗耐药等过程[40]–[41]。多项研究表明，自噬抑制剂既可作为单独的药物治疗肿瘤，也可作为通过促进肿瘤细胞对化疗敏感性发挥治疗作用。

抑制调控自噬启动基因的小分子化合物在临床前研究中取得较大进展，包括靶向AMPK、Vps34、ULK1、ATG4或ATG7等在内的多种抑制剂。研究表明，AMPK能保护AML细胞的LIC应对应激，敲除AMPK或使用AMPK抑制剂Compound C抑制自噬发生均能使细胞对应激如低糖适应能力下降，胞内ROS堆积，细胞凋亡增加[42]。3-MA及LY294002通过抑制Vps34活性，MRT67307及MRT68921通过抑制ULK1活性，均可达到抑制自噬的作用。

目前通过影响自噬改善肿瘤治疗效果的临床试验83%为羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ），15%为氯喹（chloroquine, CQ）。CQ及其衍生物可抑制溶酶体腔酸化，抑制溶酶体对囊泡内容物的降解从而达到抑制自噬的作用。利用CQ或HCQ单药或联合放化疗治疗淋巴瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤及多种实体瘤的临床试验已取得良好效果[41]。伊马替尼作为酪氨酸激酶抑制剂（TKI），是治疗CML的一线药物，其通过将BCR-ABL融合蛋白封闭到自噬体中实现降解。但CML干细胞多发生对伊马替尼和第2、3代TKI的耐药，体外实验表明可能与药物诱导的自噬促存活机制有关，利用药物或基因敲除法抑制自噬活性均可重建CML干/祖细胞[31]对TKI敏感性，增加TKI诱导的细胞死亡[43]。目前，第一个应用自噬抑制剂治疗CML的CHOICES（CHlOroquine and Imatinib Combination to Eliminate Stem cells, NCT01227135）方案正在进行Ⅱ期临床试验。在表达AML1-ETO融合蛋白的AML中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）联合CQ可大幅降低肿瘤细胞的集落形成能力，并导致与细胞死亡相关的泛素化蛋白大量积聚，从而使肿瘤细胞大量死亡[44]。

需要注意的是，目前对于自噬抑制剂的开发仍处于早期阶段，因此应用于临床试验的药物多数作用于自噬相关调控基因，尚无直接靶向自噬发生机制的药物[45]。此外，当前研究所使用的自噬诱导剂或抑制剂特异性仍较差，对靶标基因缺乏特异性选择（如3-MA除影响Vps34之外，还可影响其他PI3K的酶活性），除影响自噬外，还可能参与其他细胞过程（如雷帕霉素除了能够激活自噬外，还能抑制翻译、细胞生长及增殖，因而往往导致T细胞增殖受抑，机体发生免疫抑制[46]），对于化疗药效发挥或正常细胞存活均可造成影响。

四、结语

虽然自噬早在20世纪50年代就被提出，真正得到重视却是在近二十年内，自噬广泛参与机体功能、活动，自噬分子机制及生理功能的发现，更使自噬得到迅速发展，其在肿瘤中的作用更是得到深入研究。白血病作为一种难治性疾病，其预后虽然已得到很大改善，但耐药、复发等仍然是亟待解决的问题，促使人们进一步探索其发病机制、改进其治疗方案。自噬的功能复杂，在白血病的发生发展中同时具有促癌和抑癌的双重作用。同样的，自噬在白血病治疗中的作用也表现为两面性。根据不同的白血病类型及自噬在其中的作用具体分析后再决定用药类型，对于自噬正确发挥治疗作用非常重要。此外，提高靶向自噬调节因子药物的特异性，或找到能够直接作用于自噬核心元件的药物，或许能够成为改善自噬相关药物在白血病治疗中的重要途径。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81670147）；上海市优秀学术带头人（16XD1402000）；上海市专科疾病临床“五新”转化项目（16CR3008A）