Abstract
目的
研究全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）与 VEGF 联合应用对于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）定向成骨分化的影响。
方法
取 NIH 孕鼠（孕 12～15 d）子宫内的胎鼠，去掉头、心、肝等器官后，采用胰蛋白酶消化贴壁法分离培养 MEFs。利用 HEK-293 细胞采用反复冻融法扩增重组腺病毒红色荧光蛋白（recombinant adenovirus-red fluorescent protein，Ad-RFP）及 Ad-VEGF。采用 ALP 染色和 ALP 定量检测法检测单独 ATRA 或 VEGF 以及 ATRA 和 VEGF 联合应用培养 MEFs 第 3、5 天 ALP 活性变化。将第 3～4 代 MEFs 分为 A、B、C、D 4 组，分别加入 DMSO+Ad-RFP、ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF。实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测第 3、7 天成骨相关标志物 ALP、Ⅰ 型胶原、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）及成血管相关标志物 VEGF、血管生成素 1（angiopoietin 1，ANGPT1）、内皮黏蛋白（endomucin，EMCN） mRNA 表达；免疫组织化学染色检测各组第 3、5、7 天 OPN、VEGF 蛋白表达；茜素红染色检测各组成骨诱导 14、21 d 钙盐沉积水平。取 15 只 4～6 周龄无胸腺雌性裸鼠，随机分为 3 组，每组 5 只，分别于背侧与腹侧皮下注射经 ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF 处理后的 MEFs。植入后 5 周行 X 线片观察、大体观察及组织学染色（Masson、HE 及番红 O-固绿染色），观察各组裸鼠体内异位成骨情况。
结果
成功分离培养 MEFs；扩增后的 Ad-RFP 及 Ad-VEGF 成功转染 MEFs，转染效率约为 50% 和 20%。ALP 活性检测示，单独使用 ATRA 或 VEGF 均能增强 MEFs 中 ALP 活性，且 ATRA 作用较 VEGF 强；ATRA 和 VEGF 联合使用较单独使用显著增强了 MEFs 中 ALP 活性（P<0.05）。qRT-PCR 检测示，ATRA 联合 Ad-VEGF 使用上调了早期成骨分化相关标志物 ALP、OPN、Ⅰ 型胶原 mRNA 相对表达量（P<0.05）；7 d 时成血管相关标志物 VEGF、EMCN 及 ANGPT1 mRNA 相对表达量有所上升（P<0.05）。免疫组织化学染色示，ATRA 联合 Ad-VEGF 不仅增强了 OPN 蛋白表达，VEGF 蛋白表达在第 7 天也有所增强。茜素红染色示，单独应用 ATRA 或 Ad-VEGF 诱导钙盐沉积作用较弱，二者联合应用明显增强了 MEFs 成骨晚期钙盐沉积的效应。裸鼠体内植入实验结果显示，X 线片观察发现与其余两组相比，ATRA+Ad-VEGF 组存在明显骨块，且骨块体积较大，组织学染色可见大量胶原及成熟骨小梁、骨基质形成以及胶原骨组织。
结论
ATRA 与 VEGF 联合应用能诱导 MEFs 定向成骨分化。
Keywords: 全反式维甲酸, VEGF, 小鼠胚胎成纤维细胞, 成骨分化, 成血管
Abstract
Objective
To investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and vascular endothelial growth factor (VEGF) on the osteogenic differentiation of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
Methods
The fetal mice in the uterus of NIH pregnant mice (pregnancy 12-15 days) were collected, and the heads and hearts etc. were removed. Then MEFs were separated from the rest tissues of the fetal mice and cultured by trypsin digestion and adherent culture. HEK-293 cells were used to obtain recombinant adenovirus-red fluorescent protein (Ad-RFP) and Ad-VEGF by repeatedly freezing and thawing. Alkaline phosphatase (ALP) staining and quantitative detection were used to detect the changes of ALP activity in MEFs applied with ATRA or VEGF alone or combined use of ATRA and VEGF on the 3rd and 5th days. The cultured 3rd to 4th generation MEFs were divided into groups A, B, C, and D, and were cultured with DMSO plus Ad-RFP, ATRA, Ad-VEGF, ATRA plus Ad-VEGF, respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the mRNA expressions of osteogenic markers including ALP, collagen type Ⅰ, osteopontin (OPN), osteocalcin (OCN), and angiogenic markers including VEGF, angiopoietin 1 (ANGPT1), and endomucin (EMCN) on the 3rd and 7th days. Immunohistochemical staining was used to detect the protein expressions of OPN and VEGF on the 3rd, 5th, and 7th days in each group. Alizarin red staining was used to detect calcium salt deposition levels in each group at 14 and 21 days after osteogenic induction. Fifteen athymic female nude mice aged 4 to 6 weeks were randomly divided into 3 groups and 5 mice in each group. Then MEFs treated with ATRA, Ad-VEGF, and ATRA plus Ad-VEGF were injected subcutaneously into the dorsal and ventral sides, respectively. X-ray observation, gross observation, and histological staining (Masson, HE, and Safranin O-fast green stainings) were performed at 5 weeks after implantation to observe the ectopic bone formation in nude mice in each group.
Results
MEFs were successfully isolated and cultured. The acquired Ad-RFP and Ad-VEGF were successfully transfected into MEFs with approximately 50% and 20% transfection rates. ALP activity tests showed that ATRA or Ad-VEGF could enhance ALP activity in MEFs (P<0.05), and ATRA had a stronger effect than Ad-VEGF; and the combined use of ATRA and Ad-VEGF significantly enhanced the ALP activity in MEFs (P<0.05). qRT-PCR test showed that the combined use of ATRA and Ad-VEGF also increased the relative mRNA expressions of early-stage osteogenesis-related markers ALP, OPN, and collagen type I (P<0.05); the relative mRNA expressions of angiogenesis-related markers VEGF, EMCN, and ANGPT1 increased at 7 days (P<0.05). Immunohistochemical staining showed that ATRA combined with Ad-VEGF not only enhanced OPN protein expression, but also increased VEGF protein expression on 7th day. Alizarin red staining showed that the application of ATRA or Ad-VEGF induced weak calcium salt deposition, and the combined use of ATRA and Ad-VEGF significantly enhanced the effect of calcium salt deposition in MEFs. The results of implantation experiments in nude mice showed that X-ray films observation revealed obvious bone mass in the ATRA plus Ad-VEGF group, and the bone was larger than that in other groups. Histological staining showed a large amount of collagen and mature bone trabeculae, bone matrix formation, and gray-green collagen bone tissue, indicating that the combined use of ATRA and Ad-VEGF significantly enhanced the osteogenic effect of MEFsin vivo.
Conclusion
The combined use of ATRA and VEGF can induce the osteogenic differentiation of MEFs.
Keywords: All-trans retinoic acid, vascular endothelial growth factor, mouse embryonic fibroblasts, osteogenic differentiation, angiogenesis
骨骼损伤后的修复离不开多种生物因子的参与，研究因子间相互作用对于骨修复重建具有重要临床价值。大量研究表明，构建组织工程骨是治疗骨折、骨缺损的理想方法，其三大要素包括种子细胞、生长因子及生物相容性优良的支架材料[1-2]。MSCs 是来源于中胚层的一类多能干细胞，可以成骨、成软骨、成脂肪细胞分化，是组织工程骨理想的种子细胞。如何利用生物因子有效促进 MSCs 成骨分化、诱导新骨形成并加速骨组织改建，是目前该领域的研究热点[3-4]。
小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）是来源于胚胎的 MSCs，具有多向分化潜能，因其具有自我更新和复制能力强、培养过程中细胞增殖与形态维持能力强的优点，更适合用于 MSCs 定向分化研究。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA ）是维生素 A 的活性代谢产物，能够通过影响成骨细胞与破骨细胞的活性，从而影响骨形成与骨吸收。而 VEGF 是目前发现的作用最强的诱导血管生成的细胞因子，对于成骨细胞与破骨细胞的增殖、分化及功能活性具有重要调节作用，参与骨骼发育与骨骼形成。研究表明[5-6]，ATRA 的应用促进了骨髓基质细胞的成骨分化，也刺激了骨髓基质细胞及 MSCs 中 VEGF 等成血管相关因子的表达。因此，ATRA 和 VEGF 联合应用可能对 MEFs 定向成骨分化有调节作用。本研究拟通过体外及体内实验，探讨 ATRA 与 VEGF 联合应用诱导 MEFs 定向成骨分化的效果。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物、细胞及腺病毒
NIH 孕鼠（孕 12～15 d）1只，购自重庆医科大学实验动物中心；4～6 周龄无胸腺雌性裸鼠 15 只，购自北京实验动物研究中心，于重庆医科大学实验动物中心饲养。HEK-293 细胞购自中国科学院上海细胞库；提取的 MEFs 以及重组腺病毒红色荧光蛋白（recombinant adenovirus-red fluorescent protein，Ad-RFP）、Ad-VEGF 由美国芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室 TC He 教授提供。
1.2. 主要试剂及仪器
ATRA（采用 DMSO 为溶剂）、茜素红 S 染色液、地塞米松、β 磷酸甘油二钠、DMSO（北京索莱宝科技有限公司）；BCIP/NBT ALP 显色试剂盒、ALP 检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒、Trizol（Takara 公司，日本）；骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、VEGF 一抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。CO2 培养箱、台式低温离心机（Thermo 公司，美国）；荧光倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；qRT-PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.3. MEFs 分离培养
取 NIH 孕鼠以脱颈法处死，开腹后将子宫取出转移至无菌培养皿，PBS 反复冲洗 3 遍。将子宫剪开，暴露每一个胚胎，打开卵黄囊分出整个胎鼠，切去鼠头、心、肝等器官后，PBS 反复冲洗并转移至新的无菌培养皿中。将剩余组织剪碎，加入 0.25% 胰蛋白酶 2～3 mL，37℃ 消化约 30 min 至肉眼观察不到组织碎片，加入 2 倍体积含 10%FBS 的 DMEM 培养基以终止消化。将细胞以 1.5×108 个/L 密度接种于 100 mm 培养皿，37℃ 培养 2～3 d。于 37℃、5% CO2 条件下，用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素及 100 μg/mL 链霉素的 H-DMEM 培养基培养 MEFs 并传代，取第 3～4 代细胞备用。根据文献[7]方法鉴定分离培养的细胞为 MEFs。
1.4. Ad-RFP、Ad-VEGF 扩增及转染 MEFs
取 HEK-293 细胞于 37℃、5%CO2 条件下，用含 10%FBS、100 U/mL 青霉素及 100 μg/mL 链霉素的 H-DMEM 培养基培养并传代，取第 3～4 代细胞扩增腺病毒。当 HEK-293 细胞生长至约 70% 融合时，在 100 mm 培养皿中加入 10 mL 完全培养基与解冻后的 Ad-RFP、Ad-VEGF （0.5 μL/皿）。36 h 后荧光倒置显微镜下观察，可见 HEK-293 细胞表达大量红色荧光。当镜下可见 1/3～1/2 HEK-293 细胞开始脱落并见大量荧光时，轻轻吹打贴壁细胞使其完全脱落，移入 15 mL 离心管中，以离心半径 10 cm、800 r/min 离心 5 min，弃上清，在液氮及 37℃ 水浴中快速来回冻融细胞 5 次，提取上清液即为有效病毒，−80℃ 分装保存。
取第 3～4 代 MEFs，以 3×104 个/孔密度接种于 24 孔板，每孔加入 1 mL 完全培养基和 1 μL Ad-RFP 或 1 μL Ad-VEGF，24 h 后在荧光倒置显微镜下观察 Ad-RFP 和 Ad-VEGF 荧光表达情况；于放大 400 倍下随机选取 5～7 个视野，计数阳性细胞和总细胞，按以下公式计算转染效率：阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.5. ATRA 和 VEGF 对 MEFs 成骨分化的影响
1.5.1. ALP 活性检测
将 MEFs 以 3×104 个/孔密度接种于 24 孔板，首先检测单独 ATRA 或 VEGF 对 MEFs 成骨分化后 ALP 活性的影响。取 6 孔 MEFs，每孔中分别加入 DMSO（a 组）及 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L ATRA（分别设为 b、c、d、e、f 组）；再取 6 孔 MEFs，每孔中分别加入 DMSO（a1 组）及 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μL Ad-VEGF（分别设为 b1、c1、d1、e1、f1 组）。各组于处理第 3、5 天按 BCIP/NBT ALP 显色试剂盒说明书进行 ALP 染色，并使用 ALP 检测试剂盒定量检测 ALP 活性。每组重复 3 次，取均值。
然后检测 ATRA 和 Ad-VEGF 联合应用是否有协同增强 ALP 活性的功能。取 5 孔 MEFs，每孔中分别加入 DMSO（a2 组）、1.6 μmol/L ATRA（b2 组）、1.6 μmol/L ATRA+0.5 μL Ad-VEGF（c2 组）、1.6 μmol/L ATRA+1.0 μL Ad-VEGF（d2 组）、1.6 μmol/L ATRA+1.5 μL Ad-VEGF（e2 组）；再取 5 孔 MEFs，每孔中分别加入 DMSO（a3 组）、1.0 μL Ad-VEGF（b3 组）、1.0 μL Ad-VEGF+0.4 μmol/L ATRA（c3 组）、1.0 μL Ad-VEGF+0.8 μmol/L ATRA（d3 组）、1.0 μL Ad-VEGF+1.6 μmol/L ATRA（e3 组）。培养第 3、5 天时，同上法检测各组 ALP 活性。
1.5.2. 后续实验分组
根据联合应用后 ALP 活性检测结果，选择最佳剂量浓度组合进行后续实验。将 MEFs 以 3×104 个/孔密度接种于 24 孔板。实验分为 4 组，A 组加入 DMSO+Ad-RFP，B 组加入 ATRA，C 组加入 Ad-VEGF，D 组加入 ATRA+Ad-VEGF。其中，ATRA 浓度为 1.6 μmol/L，Ad-RFP 及 Ad-VEGF 用量为 1 μL/孔，DMSO 用量为 10 μL/孔。
1.5.3. qRT-PCR 检测
各组于处理第 3、7 天使用 Trizol 提取总 RNA，按照逆转录试剂盒说明书将各组 RNA 逆转录为 cDNA，反应液稀释 5 倍后作为 qRT-PCR 模板，进行 qPCR 检测。反应条件：95℃、30 min，95℃、5 min，60℃、30 min，39 个循环；融解曲线分析：温度 65～95℃。用 2−ΔCt法计算各组成骨相关基因 ALP、Ⅰ 型胶原、OPN、骨钙素（osteocalcin，OCN）及成血管相关基因 VEGF、血管生成素 1（angiopoietin 1，ANGPT1）、内皮黏蛋白（endomucin，EMCN）的 mRNA 相对表达量。每组重复 3 次，取平均值。各基因引物序列见表 1。
表 1.
Primer sequences of the related to osteogenesis and angiogenesis
成骨及成血管相关标志基因的引物序列
| 基因
Gene |
引物序列（5’→3’）
Primer sequence (5’→3’) |
|
| 上游
Forward |
下游
Reverse |
|
| ALP | CACGGCGTCCATGAGCAGAAC | CAGGCACAGTGGTCAAGGTTGG |
| Ⅰ 型胶原（Collagen typeⅠ） | GAGCGGAGAGTACTGGATCG | GCTTCTTTTCCTTGGGGTTC |
| OPN | CCTCCCGGTGAAAGTGAC | CTGTGGCGCAAGGAGATT |
| OCN | AGACTCCGGCGCTACCTTGG | CGGTCTTCAAGCCATACTGGTCTG |
| VEGF | AGCACAGCAGATGTGAATGC | AATGCTTTCTCCGCTCTGAA |
| ANGPT1 | AACCAGCGCCGAAATCCA | AATCCGGCTCCACGTGTG |
| EMCN | GTCCAACAGTCTCTGCCACAGTG | TGACACGATGCCTGGTATTGTGAC |
| GAPDH | GCACAGTCAAGGCCGAGAAT | GCCTTCTCCATGGTGGTGAA |
1.5.4. 免疫组织化学染色观察
各组细胞处理第 3、5、7 天时，于 37℃、4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗涤 3 遍，然后用 0.5%Triton X-100 于室温下通透，并用山羊血清封闭 30 min。在培养板中添加 1∶500 稀释的 OPN、VEGF 一抗，4℃ 孵育过夜；次日添加与一抗对应的辣根过氧化物酶标记二抗温育 20 min；最后用 DAB 染色液染色 5 min，苏木素复染细胞核，倒置显微镜下观察。
1.5.5. 茜素红染色观察
将 MEFs 铺于 24 孔板，待细胞贴壁后按分组相应处理细胞，然后用成骨诱导培养基（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素及 100 μg/mL 链霉素、50 mg/L 维生素 C、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β 磷酸甘油二钠的 DMEM 培养基）培养，于 14、21 d 时常规行茜素红染色，检测钙盐沉积。每组实验重复 3 次。
1.6. ATRA 和 Ad-VEGF 对裸鼠体内异位成骨的影响
1.6.1. 实验分组
将 15 只无胸腺雌性裸鼠随机分为 3 组，即 ATRA 组、Ad-VEGF 组及 ATRA+Ad-VEGF 组，每组 5 只。取第 3～4 代 MEFs，分别加入 1.6 μmol/L ATRA、1 μL/孔 Ad-VEGF（转染效率 20% 以上）和 1.6 μmol/L ATRA+1 μL/孔 Ad-VEGF。培养 24 h 观察到 MEFs 表达红色荧光后，继续培养 24 h 让 ATRA 充分作用细胞。收获各组细胞并用 PBS 重悬，乙醇消毒后按分组分别注射至无胸腺裸鼠的背侧与腹侧，每个部位注射 200 μL 细胞（密度为 1×107 个/mL）。
1.6.2. 观测指标
① X 线片观察：细胞植入后 5 周，乙醚吸入麻醉法处死裸鼠， X 线片观察各组裸鼠皮下成骨包块。② 大体观察：将裸鼠植入部位骨块取出，比较大小。③ 组织学观察：取各组骨块，EDTA-Na2 液脱钙、10% 甲醛固定并包埋于石蜡中；脱石蜡及再水化后，常规行 HE、Masson 及番红 O-固绿染色观察。
1.7. 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni t 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. Ad-RFP 和 Ad-VEGF 转染 MEFs 的荧光表达
将扩增后的 Ad-RFP 或 Ad-VEGF 转染 MEFs 24 h 后荧光倒置显微镜观察示，MEFs 发出红色荧光，分布均匀。Ad-RFP 和 Ad-VEGF 的转染效率分别约 50% 和 20%，表明已扩增的 Ad-RFP 和 Ad-VEGF 可以有效转染 MEFs。见图 1。
图 1.
Fluorescence expression of MEFs transfected with Ad-RFP or Ad-VEGF (Fluorescence inverted microscope×100)
Ad-RFP 及 Ad-VEGF 转染 MEFs 的荧光表达（荧光倒置显微镜×100）
a. Ad-RFP 转染的 MEFs；b. Ad-VEGF 转染的 MEFs
a. Ad-RFP transfected MEFs; b. Ad-VEGF transfected MEFs
2.2. ATRA 和 Ad-VEGF 联合应用对 MEFs 成骨分化的影响
2.2.1. ALP 活性检测
① 培养第 3、5 天，ATRA 和 Ad-VEGF 均呈浓度或剂量依赖性增强 MEFs 中 ALP 活性，其中 ATRA 作用更强；与 a、a1 组相比，即使最小浓度 ATRA（0.1 μmol/L）也具有显著 ALP 活性促进作用，0.5 μL 以上 Ad-VEGF 剂量也有 ALP 活性促进作用，差异均有统计学意义（P<0.05）。但是当 Ad-VEGF 使用剂量在 1.0 μL 以上时，d1、e1、f1 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。②ATRA 和 Ad-VEGF 联合应用时，Ad-VEGF 可明显促进 ATRA 诱导的 ALP 活性，c2、d2、e2 组 ALP 活性显著高于 a2、b2 组（P<0.05），c2、d2、e2 组间差异无统计学意义（P>0.05）。ATRA 也可促进 Ad-VEGF 诱导的 ALP 活性，随着 ATRA 浓度增加 ALP 活性也逐渐增强，e3 组 ATRA 浓度为 1.6 μmol/L 时显示出最强的 ALP 活性，与其余各组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。表明 ATRA 和 Ad-VEGF 联合应用可能具有促进 MEFs 成骨分化的功能。因此，本研究选择 1.6 μmol/L ATRA 和 1.0 μL Ad-VEGF 进行后续实验。
图 2.
ATRA and Ad-VEGF applied alone to promote ALP activity
ATRA 和 Ad-VEGF 单独应用促进 ALP 活性观察
a. ATRA 从左至右依次为 a、b、c、d、e、f 组，上下 2 排分别为培养 3、5 d；b. Ad-VEGF 从左至右依次为 a1、b1、c1、d1、e1、f1 组，上下 2 排分别为培养 3、5 d；c. ATRA 促进 ALP 活性定量检测；d. Ad-VEGF 促进 ALP 活性定量检测
a. ATRA From left to right for groups a, b, c, d, e, and f, respectively; and the upper and the lower rows were cultured for 3 or 5 days, respectively; b. Ad-VEGF From left to right for groups a1, b1, c1, d1, e1, and f1, respectively; and the upper and lower rows were cultured for 3 or 5 days, respectively; c. Quantitative detection of ALP activity after cultured with ATRA; d. Quantitative detection of ALP activity after cultured with Ad-VEGF
图 3.
ATRA and Ad-VEGF were combined to promote ALP activity
ATRA 和 Ad-VEGF 联合应用促进 ALP 活性观察
a. 1.6 μmol/L ATRA 联合不同剂量 Ad-VEGF 从左至右依次为 a2、b2、c2、d2、e2 组，上下 2 排分别为培养 3、5 d；b. 1.0 μL Ad-VEGF 联合不同浓度 ATRA 从左至右依次为 a3、b3、c3、d3、e3 组，上下 2 排分别为培养 3、5 d；c. 1.6 μmol/L ATRA 联合不同剂量 Ad-VEGF 促进 ALP 活性定量检测；d. 1.0 μL Ad-VEGF 联合不同浓度 ATRA 促进 ALP 活性定量检测
a. 1.6 μmol/L ATRA combined with different doses of Ad-VEGF From left to right for groups a2, b2, c2, d2, and e2, respectively; and the upper and the lower rows were cultured for 3 or 5 days，respectively; b. 1.0 μL Ad-VEGF combined with different concentrations of ATRA From left to right for groups a3, b3, c3, d3, and e3, respectively; and the upper and the lower rows were cultured for 3 or 5 days, respectively; c. Quantitative detection of ALP activity after cultured with 1.6 μmol/L ATRA and different doses of Ad-VEGF; d. Quantitative detection of ALP activity after cultured with 1.0 μL Ad-VEGF and different concentrations of ATRA
2.2.2. qRT-PCR 检测
处理第 3、7 天，D 组早期成骨相关标志物 ALP、Ⅰ 型胶原、OPN mRNA 相对表达量均显著高于 A、B、C 组，且 D 组 7 d 时显著高于 3 d 时，差异均有统计学意义（P<0.05）。但各组晚期成骨相关标志物 OCN mRNA 均呈低表达，D 组 7 d 时 OCN mRNA 相对表达量显著高于其余 3 组且高于 D 组 3 d 时，差异均有统计学意义（P<0.05）。处理 3、7 d，C、D 组成血管相关标志物 VEGF、EMCN、ANGPT1 mRNA 均呈高表达，D 组 7 d 时 VEGF、EMCN mRNA 相对表达量显著高于 C 组，且 D 组 7 d 各成血管相关标志物 mRNA 相对表达量高于 3 d 时，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图 4.
The relative mRNA expressions of osteogenesis- and angiogenesis-related markers detected by qRT-PCR in each group
qRT-PCR 检测各组成骨或成血管相关标志物 mRNA 相对表达量
a. ALP；b. Ⅰ 型胶原；c. OPN；d. OCN；e. VEGF；f. ANGPT1；g. EMCN
a. ALP; b. Collagen typeⅠ; c. OPN; d. OCN; e. VEGF; f. ANGPT1; g. EMCN
2.2.3. 免疫组织化学染色观察
随时间延长，各组 OPN 蛋白和 VEGF 蛋白表达均逐渐增加。各时间点 D 组 OPN 蛋白表达均显著强于其余各组；C 组 VEGF 蛋白表达显著强于其余各组，但 D 组也有较高 VEGF 蛋白表达。见图 5、6。
图 5.
The expression of OPN protein in each group by immunohistochemical staining (Inverted microscope×100)
免疫组织化学染色观察各组 OPN 蛋白表达（倒置显微镜×100）
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. 3 d；b. 5 d；c. 7 d
From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. At 3 days; b. At 5 days; c. At 7 days
图 6.
The expression of VEGF protein in each group by immunohistochemical staining (Inverted microscope×100)
免疫组织化学染色观察各组 VEGF 蛋白表达（倒置显微镜×100）
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. 3 d；b. 5 d；c. 7 d
From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. At 3 days; b. At 5 days; c. At 7 days
2.2.4. 茜素红染色观察
成骨诱导培养 14、21 d 茜素红染色示，D 组钙盐沉积效果明显强于其余各组，且 21 d 时钙盐沉积效果更强；B、C 组均未出现明显的钙盐沉积。见图 7。
图 7.
Observation of calcium deposition by alizarin red staining at each time point after osteogenesis induction (Inverted microscope×100)
成骨诱导各时间点茜素红染色观察各组钙盐沉积（倒置显微镜×100）
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. 14 d；b. 21 d
From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. At 14 days; b. At 21 days
2.3. ATRA 和 Ad-VEGF 对裸鼠体内异位成骨的影响
① X 线片观察：ATRA+Ad-VEGF 组裸鼠植入部位存在明显骨块，而 ATRA 组仅可见较小骨块，Ad-VEGF 组未见明显骨块。见图 8。② 大体观察：ATRA+Ad-VEGF 组骨块明显大于 ATRA 组和 Ad-VEGF 组。见图 9。③ 组织学观察：HE、Masson 和番红 O-固绿染色示，ATRA+Ad-VEGF 组可见大量蓝染胶原及成熟骨小梁、骨基质形成以及灰绿色胶原骨组织；ATRA 组可见较多蓝染胶原及骨小梁、部分骨基质形成及部分灰绿色的胶原骨组织；而 Ad-VEGF 组仅见少量蓝染胶原、大量未成熟前成骨细胞及未成熟骨基质，以及少量灰绿色胶原骨组织。见图 10。
图 8.
X-ray films of nude mice at 5 weeks after implantation
裸鼠体内植入后 5 周 X 线片观察
a. ATRA 组；b. Ad-VEGF 组；c. ATRA+Ad-VEGF 组
a. ATRA group; b. Ad-VEGF group; c. ATRA+Ad-VEGF group
图 9.
Gross observation of bone at 5 weeks after implantation in nude mice
裸鼠体内植入后 5 周大体观察
从上至下依次为 ARTA 组、Ad-VEGF 组、ARTA+Ad-VEGF 组
From the top to bottom for ATRA, Ad-VEGF, and ATRA+Ad-VEGF groups, respectively
图 10.
Histological observation at 5 weeks after implantation (Inverted microscope×100)
裸鼠体内植入后 5 周组织学观察（倒置显微镜×100）
从左至右依次为 ATRA 组、Ad-VEGF 组、ATRA+Ad-VEGF 组 a. Masson 染色；b. HE 染色；c. 番红 O-固绿染色
From left to right for groups ATRA, Ad-VEGF, and ATRA+Ad-VEGF, respectively a. Masson staining; b. HE staining; c. Saffranin O-fast green staining
3. 讨论
3.1. ATRA 在成骨分化中的作用
ATRA 作为维生素 A 的活性代谢产物，承担维生素 A 大部分生物学作用。目前临床上主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病、骨髓异常增生[8]。但同时，ATRA 对脊椎动物的生长发育和生理活动有非常重要作用，不仅可以调节神经细胞[9]、足细胞[10]等多种细胞的分化和成熟，对骨骼也有一定调节作用。研究表明，ATRA 在 MSCs、骨肉瘤细胞 143B/MG63、人脂肪来源基质细胞中上调多种成骨相关基因的表达，促进骨形成，并促进基质矿化[11-13]。另外，还有研究表明，适当剂量的 ATRA 能够刺激骨生长，促进成骨分化[14-15]；而高浓度的 ATRA 则会强烈抑制骨生长和形成[15]。流行病学研究表明，维生素 A 通过增加破骨细胞形成和减少皮质骨量来增加骨骼脆性，与骨量减少及骨折风险息息相关[16-17]。以上研究表明 ATRA 对骨形成和骨吸收都产生影响，而骨形成和骨吸收主要是基于成骨细胞与破骨细胞的活性，表明 ATRA 对成骨细胞和破骨细胞均产生影响。
关于 ATRA 在成骨细胞分化中的作用，不仅与研究时使用的细胞类型和品系相关，一定程度上还取决于 ATRA 浓度。研究发现，在 nmol/L 浓度 ATRA 能抑制成骨细胞分化[18]，而在 μmol/L 浓度其具有促进成骨分化作用[19-20]。本研究也表明，当 ATRA 浓度为 1.6 μmol/L 时能够有效刺激 MEFs 成骨分化，即使单独使用 ATRA 也有成骨作用。因此，适当浓度的 ATRA 能够刺激骨生长，促进骨形成。
同时，ATRA 在促进成骨分化的过程中上调了成骨相关基因以及蛋白的表达。在本实验中，ATRA 和 Ad-VEGF 促进了早期成骨标志物 ALP、OPN、Ⅰ 型胶原基因表达，晚期成骨标志物 OCN 基因表达在第 7 天上升。Wan 等[21]在人脂肪来源成体基质细胞中添加 ATRA 后，不仅促进了鼠抗人骨 γ 羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、ALP mRNA 表达，还增强了 Runx2 的转录活性，导致矿化结节形成增强，同时抑制基质细胞向脂肪细胞分化。
3.2. VEGF 在成骨分化中的作用
VEGF 由 Senger 发现于 20 世纪 80 年代早期，能够特异性刺激血管内皮细胞增殖、分裂并诱导血管形成，是目前发现的作用最强的诱导血管生成的细胞因子[22]。众多研究表明，VEGF 不仅能够促进血管生长，在骨骼组织中也发挥重要作用。早期在建立小鼠股骨骨折实验模型时发现，给予外源性 VEGF 能促进血管形成、骨化以及新骨形成[23]。而 Liu 等[24]在 MSCs 中敲减 VEGF，则发现成骨分化降低、成脂分化增加；而敲减 VEGF 受体 1/2 出现同样现象；当重新加入 VEGF 时，成骨分化却不受影响。表明 VEGF 以细胞-细胞相互接触的方式促进成骨分化并抑制成脂分化。Chung 等[25]在对大鼠骨折模型进行修复时发现，缺乏 VEGF 时血管形成数量减少，骨小梁数量和松质骨量明显降低，间接证明 VEGF 在促进血管形成的同时，也促进了骨生长。表明 VEGF 在骨修复与重塑过程中是不可或缺的细胞因子。本研究中，虽然单独使用 Ad-VEGF 对成骨分化影响不大，但是 Ad-VEGF 能够明显促进 ATRA 的促骨形成作用，二者联合应用明显增强了 MSCs 成骨分化能力，ALP 活性以及 ALP、OPN 等成骨相关标志物基因表达均明显增加。因此，本研究结果表明 ATRA 和 Ad-VEGF 联合应用可以诱导 MSCs 成骨分化。
在研究 ATRA 和 Ad-VEGF 诱导 MEFs 成骨分化的同时，我们发现二者有促血管形成的趋势。qRT-PCR 检测到在早期成骨分化较晚的时间点（即第 7 天），成血管相关标志物基因表达有所升高；同时第 7 天免疫组织化学染色也显示 VEGF 蛋白弱表达，提示 ATRA 和 Ad-VEGF 可能具有促血管生成作用。而 Weng 等[5]在大鼠牵张成骨模型中给予 ATRA 后，发现 ATRA 不仅增强了成骨分化，而且增强了 VEGF 等成血管相关因子的表达，与本研究结果一致。另外，本研究中我们通过对裸鼠皮下注射经 ATRA、Ad-VEGF 以及二者联合处理的 MEFs，发现 ATRA 和 Ad-VEGF 联合处理组形成的骨块最大，X 线片、大体观察和组织学染色结果也表明二者联合应用对成骨分化促进作用最强。
综上述，本研究体外和小鼠体内异位成骨实验均表明 ATRA 和 VEGF 能够促进 MEFs 成骨分化。至于 ATRA 和 VEGF 是直接调节骨形成，还是通过调节血管生成影响骨形成，或者通过其他机制发挥作用，我们将继续探索，以期为组织工程骨构建提供实验及理论依据。
作者贡献：冯玮负责实验实施、数据收集整理及文章撰写；涂小林负责科研课题设计及数据收集整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：所有动物实验均经重庆医科大学（中国重庆）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验动物使用许可证号：SYXK（渝）2018-0003。
Funding Statement
国家自然科学基金-广东联合基金项目（U1601220）
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