3-D 成球培养 MSCs 的研究进展及临床应用前景

Abstract

Objective

To review the research progress and clinical prospect of three-dimensional spheroid culture of mesenchymal stem cells (MSCs).

Methods

Recent literature about three-dimensional spheroid culture of MSCs was summarized, mainly on the formation of MSCs spheroids collected by three-dimensional culture, differences between MSCs spheroids and MSCs collected by traditional two-dimensional culture, and the mechanism underlying these differences. Last, its clinical prospect was discussed.

Results

Compared with MSCs collected by traditional two-dimensional culture, MSCs spheroids collected by three-dimensional culture get a salient up-regulation in anti-apoptosis, multiple differentiation potential, paracrine, and anti-inflammatory effect, which may be related to the morphology and cytoskeleton organization, cell-to-cell contact and gap junctions, and the hypoxia microenvironment. The animal experiments show obvious effects in repair of refractory wounds, repair of ischemic injury, and tissue remodeling, so MSCs spheroid has broad clinical prospect.

Conclusion

MSCs spheroids collected by three-dimensional culture have stronger biological potential and treatment effect than MSCs collected by traditional two-dimensional culture, MSCs spheroids can be used to optimize stem cell therapy and improve its treatment effect.

MSCs 是多能干细胞家族中的一员，因其强大的自我更新与多向分化能力而备受关注。最初，MSCs 从骨髓中提取，称为 BMSCs^[1]，在体外培养时表现为一种成纤维细胞形态的贴壁细胞。早期研究发现^[2]，MSCs 还能从脂肪、脐带、软骨、牙龈等多种结缔组织中提取。这些 MSCs 具有与 BMSCs 类似的生物学特性，能在特定环境下形成干细胞巢，并分化为神经、心肌、肝脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞^[3]。因此，MSCs 在再生医学中被视为修复组织损伤和对抗缺血性疾病的理想种子细胞。

然而，近年研究发现传统贴壁培养扩增后的 MSCs 在临床应用及动物实验中存活率较低，且生物活性与治疗效果均达不到其理论高度^[4]。究其原因，许多学者认为传统的 2-D 贴壁细胞培养法虽简便易行，但贴壁培养法提供的平面生长环境与细胞在生物体内生长的微环境大相径庭，且改变了细胞生长的原始形态，使得细胞的生物学特性无法充分表达^[5]。而 3-D 培养模式可以给细胞提供一个更加接近于体内生长的环境，增加了细胞外基质（extra-cellular matrixc，ECM）的分泌，增强了细胞之间的接触，更有利于激发MSCs的生物活性^[6]。现探讨 3-D 悬浮成球培养模式下获取的 MSCs 细胞球，较传统 2-D 贴壁培养模式下的 MSCs 在旁分泌、增殖、分化、抗凋亡等生物学功能上的变化，以及造成这些变化的生物学机制，并分析 MSCs 细胞球的治疗优势与临床应用前景。

1. 细胞成球培养技术及原理

在常规的干细胞贴壁培养时，原本悬浮在培养液中的干细胞会逐渐沉积并黏附在培养瓶底面，称为贴壁。后来，为了模拟细胞在生物体内的生长环境，学者们开创了 3-D 培养体系，3-D 培养体系为细胞的体外培养提供了一个支持细胞-细胞和细胞-ECM 间相互作用、交换信号的平台。3-D 培养体系中有支架模型和无支架模型，3-D 成球培养属于无支架模型中的常见方法，该原理是利用贴壁细胞趋向聚集成团的生物学特性，从而形成球状的细胞聚合体。此方法通常选用低黏附力或无黏附力的培养基，使悬浮细胞通过细胞间的相互作用聚集成团。早期，旋转培养法和溶液覆盖法都曾用于促进细胞的聚集^[7]。转瓶培养法通过持续搅拌高密度细胞悬液来减小细胞与培养瓶壁之间的接触，加大细胞与细胞之间的接触，从而促使细胞聚集成团；溶液覆盖法则通过琼脂来防止细胞贴壁。这两种方法最终只能形成形态不一的细胞球。另一个广泛运用的方法是悬滴法^[8]，通过将细胞包裹在悬滴中来防止细胞与培养皿壁的接触，再通过重力作用及细胞间的相互作用使细胞在悬滴底部聚集并形成细胞球，此方法获得的细胞球大小均匀，且可通过操纵悬滴来控制细胞球的大小，而且通过悬滴法还可实现多种细胞的共混培养。此外，还有一种新型技术，采用生物隔膜将 2-D 培养下的细胞转化为 3-D 培养，隔膜通常采用水凝胶、壳聚糖、透明质酸、海藻酸钙等生物材料，且这些材料已被证实对细胞的迁移、增殖、分泌等生物功能有促进作用^[9]。还有通过热力释放 ECM、低速离心等方法诱导细胞聚集^[10]。

通常情况下，在低黏附力的培养环境中，细胞与细胞之间先通过整合蛋白与 ECM 的接触形成一个结构松散的多细胞团块，之后细胞之间的接触愈加频繁，通过钙黏蛋白相互建立连接，此时原本松散的细胞团块逐渐压缩，最终变成致密的多细胞聚合体，即细胞球^[11]。但采用有黏附力的生物材料制备细胞球，成球原理则完全不同。细胞先被生物材料黏附，并在材料上伸展，然后再收起伪足变为球形聚集成团^[12]。细胞球一旦形成，则可模拟生物体内细胞生存的微环境，细胞与细胞之间由细胞外基质连接，留有一定的间隙可供外界氧气和养分的供给，以及代谢废物的排出。此外，与复杂支架模型中的细胞相比，细胞球在显微镜下更容易被观察，更符合实验需求^[8]。

2. MSCs 细胞球的生物学功能

2.1. MSCs 细胞球的多向分化潜能

MSCs 的分化能力与培养基中所添加的生物材料密切相关，不同生物材料具备不同的生物力学，其中弹力和黏附力是决定 MSCs 分化方向的关键因素。以脂肪组织为例，有研究^[13]发现负压吸引与静态悬吊有利于脂肪前体细胞诱导组织再生，而固定与压迫则抑制再生，组织学结果提示，低张力的微环境更利于脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖与成脂分化。究其原因，学者们进一步研究发现^[14]，经原子力显微镜检测出人体成熟脂肪细胞的弹力为（0.9±0.8）kPa，而 ADSCs 的弹力为（2.5±1.2）kPa，高于成熟脂肪细胞。因此，ADSCs 向成熟脂肪细胞分化的过程中需要在低张力环境下降低其弹性力学。所以，弹力较低的生物材料（2～3 kPa）可在体外无化学诱导的环境下促进 ADSCs 的成脂分化。若采用弹力较大的生物材料（11～30 kPa）则会诱导 ADSCs 成软骨分化^[15]。此外，还有研究发现^[16]将 3-D 悬浮培养的 MSCs 包埋于无黏附力的透明质酸中，MSCs 的细胞骨架发生改变，具体表现为刚度变低、应力纤维和黏着斑减少，这种改变有利于 MSCs 的成脂分化；反之包埋于黏附力较强的壳聚糖中，其细胞骨架的刚度变高，应力纤维和黏着斑也随之增多，成脂分化能力受抑制，而成骨分化能力增强。此外，还有研究表明^[17]3-D 悬浮培养的 MSCs 细胞球中 Nanog、Sox-2、POU5FI/OCT4 等多能干细胞标记物的表达较贴壁培养的 MSCs 明显增强，进一步证明了 3-D 成球培养可增强 MSCs 的多向分化潜能。

2.2. MSCs 细胞球的寿命及增殖能力

有研究表明^[18]体外 3-D 成球培养可延长 MSCs 的寿命，减缓 MSCs 的老化，具体表现在 3-D 培养的 MSCs 细胞球高表达抗凋亡基因 Bcl-2，低表达促凋亡基因 Bax。Lee 等^[19]在小鼠缺血的肢端组织中注射 MSCs 细胞球与贴壁培养的 MSCs 进行比较，结果表明注射 MSCs 细胞球的组织成活面积大于对照组，且经免疫组织化学染色发现注射 MSCs 细胞球的组织中增殖细胞核抗原表达明显高于对照组。该研究表明 MSCs 细胞球在生物体内移植区中较 MSCs 有更强的增殖能力，若用 MSCs 细胞球替代 MSCs，可优化传统干细胞疗法的治疗效果。由此可见，3-D 培养 MSCs 可成为施行干细胞疗法前预处理 MSCs、增强细胞活性的一种手段。关于 3-D 培养增强 MSCs 细胞活性和存活能力的机制，目前仍未完全阐明，有学者认为^[20]细胞球核心部分细胞处于低氧状态，正是这种低氧环境下产生的缺氧诱导因子（hypoxic inducible factor，HIF）作用于 MSCs，提高了 MSCs 的多向分化能力以及对缺血缺氧环境的耐受能力；也有学者认为^[21]是细胞间接触增多，信号交换频繁所致。

2.3. MSCs 细胞球的旁分泌作用

与 2-D 贴壁培养的 MSCs 相比，3-D 培养的 MSCs 细胞球具有更强大的旁分泌作用，其分泌的抗炎因子、细胞生长因子对提高干细胞疗法的治疗效果有着重要意义。比如，BMSCs 细胞球分泌的抗炎因子 TNF-α 刺激基因 6（TNF-α stimulated gene 6，TSG-6）能有效控制小鼠心肌梗死的炎性反应，保护心肌细胞^[6]；MSCs 细胞球通过提高前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）分泌来调控巨噬细胞的活性^[22]；IL-24 的分泌能降低肿瘤细胞的活性^[23]。此外，MSCs 细胞球旁分泌的多种细胞生长因子如 VEGF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、FGF、趋化因子受体 4（chemokine receptor 4，CXCR4）、单核细胞趋化蛋白 3、趋化因子 RANTES、基质细胞衍生因子1和血管生成素等，与贴壁培养的 MSCs 相比均有增加^[24]。这些细胞因子的释放对治疗缺血性疾病和在组织移植早期快速启动血管新生都有着重要意义。同时，HGF 的抗纤维化作用及 TGF-β₃ 减少瘢痕增生作用均已被证实^[25]，而 MSCs 细胞球旁分泌 HGF 和 TGF-β₃ 的能力显著强于单层贴壁培养的 MSCs^[11]，因此 MSCs 细胞球比 MSCs 具有更强大的抑制瘢痕形成的作用。

3. 3-D 成球培养法增强 MSCs 生物功能的机制

与传统的 2-D 贴壁培养 MSCs 相比，3-D 培养的 MSCs 细胞球在分化能力、存活能力、旁分泌能力等多项功能中均表现出显著优势。造成这些变化的主要因素在于 3-D 培养下 MSCs 的形态差异、细胞间作用力的增强、ECM 分泌增多和低氧微环境的刺激。近年大量研究证明，这些因素都参与调控 MSCs 的生物功能，并对其调控机制展开了更深层面的研究。

3.1. MSCs形态与细胞骨架的改变

与贴壁培养的 MSCs 相比，3-D 培养的 MSCs 细胞球在细胞形态、细胞骨架、黏附力、张力等属性上均有着显著差异，而这些差异正是影响 MSCs 生物学功能的因素。从形态学角度分析，MSCs 细胞球的表层细胞形态规则呈扁平状，而中央区域的细胞呈不规则的球形。细胞形态对其分化潜力有着重要影响，比如在中央区球形的 MSCs 表面张力较低，表现出向脂肪细胞分化的倾向；而周边的细胞收缩力大，更容易向骨细胞分化^[26]。

3.2. 细胞接触的作用

在探索如何提高移植区 MSCs 的存活率时，有许多学者尝试采用缺氧预处理 MSCs 提高干细胞对缺血缺氧环境的耐受，采用生物支架给干细胞提供可攀附的基础，添加生长因子增强干细胞的存活等多种方法，但这些思路都忽视了一个关键问题，就是增强细胞间的接触。3-D 培养的 MSCs 细胞球在这个问题上有极大突破，每个细胞球都可视为一个高密度的细胞集合体，给细胞之间的物质交换提供了良好的微环境。有研究表明^[26]MSCs 细胞球中细胞接触的作用主要表现在钙黏蛋白信号通路与缝隙连接作用增强，可促进 MSCs 的存活、增殖、分化、旁分泌能力。钙黏蛋白是一种细胞内黏附蛋白，它可以在组织修复与再生时参与细胞分类及细胞聚集的信号识别^[27]。N-钙黏蛋白在高密度的间叶细胞中高表达，参与细胞的增殖与分化，在动物实验中人为地抑制 N-钙黏蛋白表达，则间叶细胞成软骨分化能力减弱，肢体发育受阻^[28]。在体外实验中，由壳聚糖生物隔膜制备的 MSCs 细胞球中可检测到 N-钙黏蛋白和 P-选择蛋白的表达，两者与 MSCs 的自我更新以及成脂、成软骨、成骨分化均有一定联系^[29]。N-钙黏蛋白除了调控 MSCs 的增殖和分化作用，还可促进细胞因子的分泌。有研究发现^[30]，N-钙黏蛋白能通过活化细胞外信号调节激酶以及加强细胞接触来促进 VEGF 的分泌。

连接蛋白-43 是重要的缝隙连接蛋白，由细胞接触增多而产生，在 3-D 培养的 MSCs 细胞球中高表达^[31]。连接蛋白-43 已被证实与 MSCs 成脂、成软骨、成骨分化有着不同的调控作用。在成脂分化早期，连接蛋白-43 表达逐渐增强，而在脂肪细胞成熟过程中逐渐减弱；若抑制连接蛋白-43 表达，则 MSCs 成脂分化受抑制，成骨分化潜能增强；而在成软骨分化过程中均可检测到连接蛋白-43 的表达^[32]。因此，细胞接触的增多可同时激活钙黏蛋白及连接蛋白，对 MSCs 分化能力的调控有着重要意义。

3.3. ECM 的作用

最理想的 MSCs 体外培养模型应具备体内干细胞巢的微环境，ECM 是不可缺少的成分。ECM 是由动物细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括胶原蛋白、黏多糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白等^[33]。3-D 悬浮培养模式给予 MSCs 更宽裕的生长空间，ECM 的释放也明显高于传统贴壁培养 MSCs，可形成一定规模的 ECM 网^[34]。在材料学上，ECM 被视为一种具有生物活性的天然生物材料，它对组织细胞起支撑、保护、营养的作用，为干细胞的增殖、分化、旁分泌提供了舒适的环境，并且通过细胞膜表面的整合蛋白将信号传入细胞内，系统地调控细胞的生命活动^[35]。此外，干细胞疗法中单纯的干细胞注射疗效并不理想，其主要原因之一在于局部炎性反应募集了大量巨噬细胞，巨噬细胞可吞噬部分干细胞，导致治疗效果降低。而 ECM 可以充当干细胞疗法中对抗巨噬细胞的屏障。近年来，学者们通过大量动物实验证明，采用 3-D 培养法预处理 MSCs 并以细胞球的形式注入生物体内，可提高移植区的种子细胞密度，增强 MSCs 对炎性细胞吞噬作用及缺血缺氧环境的耐受，提高 MSCs 的存活率及增殖能力，在缺血心肌的修复、软骨修复及脂肪组织修复中均有突出作用^[36]。

3.4. 低氧微环境对 MSCs 的作用

MSCs 细胞球是个复杂的多细胞聚合体，细胞球的大小直接关系单个细胞的活性，目前虽然对 3-D 培养 MSCs 细胞球的最适粒径无权威报道，但学者们普遍认为粒径过大会损伤 MSCs 的活性，其主要原因在于粒径过大，中央的细胞难以接受外界营养物质和氧气的供给，易发生中央区域的细胞坏死^[37]。而适当控制细胞球的粒径可使 MSCs 处于轻度缺氧状态，反而能增强 MSCs 的抗氧化、抗凋亡能力。因为在低氧微环境中，HIF 的产生可刺激 VEGF、FGF-2、HGF、CXCR4 等细胞因子以及 PGE-2，TSG-6 等抗炎因子的分泌；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和抗凋亡因子 Bcl-2 的高表达，可增强细胞的抗凋亡能力，延长细胞寿命^[20]。然而，除了低氧微环境，糖酵解产物如丙酮酸和乳酸也可活化 HIF 的转录，并在缺氧环境下维持 HIF 的稳定表达^[38]。传统贴壁培养的 MSCs 因缺乏对移植后这种恶劣微环境的适应而过早凋亡，失去治疗能力，而 3-D 成球培养形成的低氧微环境恰好可以模拟临床上缺血再灌注损伤、难愈性创面、组织移植等病理模型，若在移植前通过 3-D 成球培养预处理，可诱导 MSCs 提前适应低氧环境，激活 HIF、SOD 等多种抗氧化基因，释放多种促血管化细胞因子及抗炎因子，从而增强移植后 MSCs 的存活率和治疗效果。

4. MSCs 细胞球的应用前景

传统的干细胞疗法可视为一种离散的干细胞移植术，移植后干细胞的活性和存活时间均不理想。与之相比，移植 3-D 培养获得的 MSCs 细胞球具有以下优势：① MSCs 细胞球可视为一种富含 ECM 的多细胞聚合体，ECM 的富集给干细胞提供了一个适宜的微环境来对抗移植后的短期高强度炎性反应，降低微环境中的细胞毒性。② ECM 与细胞间作用力增强了干细胞移植后的黏附力和存活力，为干细胞定向分化提供了信号传递的媒介。③ 干细胞对移植后低氧环境的适应能力增强，在低氧诱导因子的激发下，多种促血管化细胞因子的释放有利于早期的血管新生和宿主受损组织的保留。基于以上优势，3-D 培养获得的 MSCs 细胞球在难愈性创面愈合、缺血组织修复以及组织重塑方面具有广阔的应用前景。

4.1. MSCs 细胞球在创面及缺血组织修复中的应用前景

在临床上对于难愈性创面、缺血组织的修复上常采用干细胞疗法，即通过细针将干细胞精准注入损伤区域，种子细胞的存活能力、再生能力直接决定最终治疗效果。所以我们认为，可在注射前先对种子细胞进行预处理，使零散细胞聚集成团，并以 ECM 和生物材料作为包埋细胞团的生物隔膜，既可营养种子细胞，激发其生物活性，又可在移植后发挥屏障作用抵抗炎性细胞的吞噬，大量细胞因子的释放还能促进移植区早期血管新生，这正是 3-D 成球培养模式下获得的 MSCs 细胞球的临床优势所在。研究表明，牙龈来源的 MSCs（gingiva derived stem cells，G-MSCs）成球培养后对化疗后口腔黏膜炎的治疗效果显著大于贴壁培养的 G-MSCs，且通过静脉注射 G-MSCs 细胞球发现其具有很强的归巢能力，可自主向受损组织区域迁移^[39]。2015 年日本东京大学 Yoshimura 的研究团队^[40]将透明质酸溶液中形成的 ADSCs 微球注入小鼠缺血再灌注损伤的脂肪垫中，取得了理想的治疗效果；同时，该实验与单纯注射 ADSCs 的对照组相比，无论是早期抑制炎性反应和血管新生，还是后期脂肪组织再生方面，均具有突出效果。在脑梗死大鼠模型中^[41]，采用颈动脉注射 3-D 成球培养的 MSCs 细胞球同样获得了理想治疗效果，术后 24 h，MSCs 细胞球组脑组织损伤面积减少了 55%，明显高出贴壁培养的 MSCs 治疗组（27.5%），且术后 14 d MSCs 细胞球组的脑组织保留率高达 72.9%，同样明显高出 MSCs 治疗组（42.6%）。治疗效果显著提升的原因主要在于注射后受损区域 MSCs 细胞球的高存活率，以及 MSCs 细胞球注射早期降低组织炎性反应以及促进血管新生的作用；该研究还意外发现，单纯颈动脉注射贴壁培养 MSCs 的大鼠均出现小动脉栓塞症状，造成不同程度视力损伤，还有部分大鼠在注射后出现大脑中动脉栓塞；而这些并发症在 MSCs 细胞球治疗组均未出现。该实验组认为其主要原因在于细胞体积，MSCs 细胞球的体积较贴壁培养 MSCs 减小了约 40%，故不易造成小动脉栓塞。此研究为提高干细胞血管内注射的治疗效果和有效避免并发症方面提供了有效解决方案。

4.2. MSCs 细胞球在组织工程中的应用前景

MSCs 细胞球在组织重塑及与生物支架复合方面较传统贴壁培养的 MSCs 更具优势。根据前文所述，通过对包埋 MSCs 材料刚度、黏附力的调控，可诱导 MSCs 的定向分化。与体外实验的化学诱导相比，这种生物力学的诱导因素更具临床应用价值。此外，成球培养的 MSCs 更适合担当组织工程中的种子细胞，MSCs 细胞球的分化能力、存活能力、旁分泌能力均优于贴壁培养的 MSCs，对于组织缺损的修复有重要价值^[42]。这类研究多用于骨组织和软骨组织的修复，主要表现在 MSCs 细胞球在软骨内成骨和膜内成骨方面具有突出表现，从而加速骨组织修复。而且，ECM 的作用和细胞间作用力可促进成骨因子的释放，微环境的改变加速了 MSCs 成骨分化的进程^[43]。在软骨修复模型中有研究发现，MSCs 细胞球凭借其出色的黏附力持久贴附于软骨缺损部位表面，促进软骨修复^[44]。还有研究将软骨细胞与滑膜干细胞共混 3-D 成球培养后，注射至软骨缺损部位，局部微环境中 ECM 的含量显著增多，修复效率明显提高^[45]。由此可见，3-D 成球培养法可成为修复组织缺损中预处理种子细胞的一种手段，更加高效地诱导组织新生。

5. 小结及展望

3-D 培养的 MSCs 细胞球已被证实较传统贴壁培养的 MSCs 在抗凋亡、抗炎、多向分化及旁分泌细胞因子等生物功能方面均有显著提升，为临床上提高干细胞疗法的治疗效果提供了新的思路。目前，尽管对 3-D 成球培养增强 MSCs 生物活性的机制以及相关信号通路有一定了解，但还有大量问题需要进一步深入研究。比如，在 3-D 培养模式下诱导 MSCs 聚集成球的信号通路；MSCs 细胞球抗凋亡作用的具体机制；MSCs 细胞球细胞骨架与其生物学功能增强有何联系；3-D 成球培养过程中生物力学的改变影响细胞分化的机制；MSCs 细胞球粒径控制在什么范围可达到促进细胞生物活性而不至于导致中央区细胞缺氧坏死的程度，这对建立长期而稳定的 MSCs 3-D 成球培养模式尤为重要。揭开这些问题有助于进一步了解 MSCs 细胞球的理化性质，建立更加稳定的 3-D 成球培养体系，推动 MSCs 细胞球的临床应用。

Funding Statement

江西省自然科学基金资助项目（20151BAB205034）；江西省科技支撑计划资助项目（2010BSA15100）

Natural Science Foundation of Jiangxi Province (20151BAB205034); Science and Technology Support Program of Jiangxi Province (2010BSA15100)