TLR4/MyD88/NF-κB通路基因及相关炎症因子在继发性脊髓损伤患者中的表达

Abstract

目的

探讨Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子（MyD88）/NF-κB通路基因及相关炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6在继发性脊髓损伤（SSCI）患者中的表达及与预后的相关性。

方法

回顾性分析2017年7月至2018年6月浙江省台州医院收治的105例SSCI患者及40名健康体检者的临床资料。根据Frankel脊髓损伤分级评估结果将SSCI患者分为完全损伤组和不完全损伤组，根据日本矫形外科学会（JOA）患者神经功能改善率将SSCI患者分为预后优良组和预后不良组。对比SSCI患者与健康体检者、完全损伤组与不完全损伤组、预后优良组与预后不良组外周血单个核细胞（PBMC）中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平；采用Logistic回归分析法分析导致SSCI患者预后不良的危险因素，并采用Pearson相关性分析法分析JOA改善率与上述指标的相关性。

结果

SSCI患者PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均高于健康体检者（均 P < 0.01），完全损伤组上述指标均高于不完全损伤组，且预后不良组高于预后优良组（均 P < 0.01）。预后不良组Frankel分级A级、脊髓水肿或出血、脊髓损伤长度超过4 cm患者的比例均高于预后优良组（均 P < 0.01），且经Logistic回归分析证实Frankel分级、脊髓水肿或出血、脊髓损伤长度及PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量、血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均是导致SSCI患者预后不良的危险因素（ P < 0.05或 P < 0.01）。Pearson相关性分析结果显示，JOA改善率与PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量以及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均呈负相关（ P < 0.05或 P < 0.01）。

结论

TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及其相关炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6表达上调参与SSCI疾病进展且与神经炎症损伤关系密切，可作为评估SSCI患者预后的参考指标。

近年来，急性脊髓损伤发病率逐年升高，随之引起急性脊髓损伤后继发性脊髓损伤(secondary spinal cord injury，SSCI)发病率升高 ^{[ 1]} 。急性脊髓损伤可通过手术缓解或去除病因，但部分患者由于椎体移位、血肿压迫未及时解除，可导致残余脊髓神经受氧化应激及炎症反应损伤，出现SSCI，危及患者生命 ^{[ 2]} 。

Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)属于机体固有免疫系统的感受器，可激活下游髓样分化因子(myeloid differentiation factor，MyD88)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路，诱导相关细胞因子释放，参与炎性或免疫性疾病进展 ^{[ 3]} 。已有研究证实，TLR4在急性脑梗死、神经认知功能障碍疾病中起重要调控作用 ^{[ 4- 5]} ，但关于其在SSCI中的具体调控机制仍需要进一步探讨。为此，本研究对收治的105例脊髓外伤或术后SSCI患者的临床资料进行回顾性分析，探讨TLR4/MyD88/NF-κB通路基因及其相关炎症因子在患者外周血中的表达与疾病预后的关系，以期为SSCI早期防治提供临床依据。

1 对象与方法

1.1 对象

回顾性分析2017年7月至2018年6月浙江省台州医院收治的105例因脊髓外伤或术后出现SSCI患者的临床资料。纳入标准：①MRI检查明确诊断；②临床资料完整。排除标准：①颈椎基础疾病患者；②合并炎性疾病、恶性肿瘤者；③合并其他脏器功能障碍者。105例患者中，男性62例，女性43例；年龄33~72岁，平均(48±10)岁；受伤至就诊时间1 h~2周，平均(22±4)h；车祸伤47例，坠落伤26例，砸伤13例，摔伤19例；颈段损伤22例，胸腰段损伤67例，骶尾段损伤16例；Frankel脊髓损伤 ^{[ 6]} A级33例(完全损伤组)，B~D级72例(不完全损伤组)；手术治疗37例，非手术治疗68例，其中应用大剂量甲泼尼龙冲击治疗29例；表现为脊髓水肿或出血77例。另回顾性分析同期医院体检中心40名健康体检者的临床资料，其中男性25名，女性15名；年龄30~65岁，平均(48±7)岁；排除颈椎基础疾病、炎性疾病、恶性肿瘤患者。SSCI患者与健康体检者年龄、性别构成差异无统计学意义(均 P＞0.05)。

研究获浙江省台州医院伦理委员会审批通过(K20170810)，患者对相关检查和治疗知情同意。

1.2 样本获取

收集SSCI患者及健康体检者上臂静脉血2 mL加入抗凝管中，然后采用Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMC)：15 mL离心管中加入2 mL Ficoll淋巴细胞分离液，沿管壁加入2 mL抗凝血与2 mL PBS混匀液，754.65× g水平离心15 min，移液管吸取云雾层的PBMC至另一离心管中，加入4 mL PBS，754.65× g离心10 min共2次，末次离心后收集PBMC置于-20 ℃备用。

1.3 实时荧光定量PCR检测PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达

TRIzol法提取PBMC中总RNA，凝胶电泳鉴定及定量后进行实时荧光定量PCR。反应体系20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 11.0 μL，2.0 μmol/L上下游引物各1.0 μL，双蒸水5.5 μL，cDNA 1.5 μL；反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，42个循环。以β-actin为管家基因、2 ^-△△CT为目的基因计算相对表达强度。引物序列见 表 1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物	引物序列
TLR4	上游：5′-TAGCGAGTAGCTGATGCT-3′
	下游：5′-ATCGTAGCTGTAGCTGAC-3′
MyD88	上游：5′-CTAGCTAGCTGTAGCTGC-3′
	下游：5′-ATCGTATCGTATCTATCGT-3′
NF-κB	上游：5′-ATCGTAGCTAGCTGTAG-3′
	下游：5′-TGCTAGCTAGCTAGCTC-3′
β-actin	上游：5′-TAGCTAGCTAGCTAGCT-3′
	下游：5′-CGTATGCGTACGTGATC-3′

1.4 ELISA检测血清TNF-α、IL-12、IL-6水平

收集SSCI患者及健康体检者上臂静脉血2 mL，704.34× g离心15 min，取上层血清，采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-12、IL-6水平，试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，按试剂盒说明书操作，于450 nm波长处测定待测样品吸光度值，并根据制作的标准曲线计算待检指标浓度。

1.5 随访及临床资料收集

随访12个月，应用日本矫形外科学会(JOA)的标准 ^{[ 7]} 评估患者神经功能恢复情况，根据JOA标准评估患者改善率，改善率＞75 %为优，改善率＞50 %且≤75 %为良，改善率＞25 %且≤50 %为可，改善率≤25 %为差。改善率(%)=[(末次随访评分-治疗前评分)/17-治疗前评分]×100 %。改善率为50 %以上定义为预后优良，50 %及以下定义为预后不良。

收集可能导致SSCI患者预后不良的相关因素，包括性别、年龄、致伤原因、受伤至就诊时间、损伤部位、Frankel分级、脊髓水肿或出血、脊髓损伤长度、治疗方式(手术或非手术)、是否应用大剂量甲泼尼龙冲击治疗，以及PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量和血清TNF-α、IL-12、IL-6水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0处理数据，计量资料以均数±标准差( x ± s)描述并进行 t检验；计数资料以例数(百分率)[ n(%)]描述并进行 χ ²检验，等级计数资料进行秩和检验。两计量资料的相关性采用Pearson相关性分析。对可能引起预后不良相关因素进行赋值，并以之为自变量，以是否发生预后不良为因变量进行多因素Logistic回归分析( 表 2)。 P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 影响因素赋值说明

Table 2 Valuation notes of influencing factors

变量名称	变量	赋值说明
性别	X1	女=0、男=1
年龄	X2	不超过60岁=0、超过60岁=1
致伤原因	X3	车祸伤=0、坠落伤=1、砸伤=2、摔伤=3
受伤至就诊时间	X4	不超过8 h=0、超过8 h=1
损伤部位	X5	骶尾段=0、胸腰段=1、颈段=2
Frankel分级	X6	A级=0、B~D级=1
脊髓水肿或出血	X7	无变化=0、脊髓水肿或出血=1
脊髓损伤长度	X8	不超过4 cm=0、超过4 cm=1
治疗方式	X9	手术=0、非手术=1
大剂量甲强龙冲击治疗	X10	是=0、否=1
PBMC中TLR4 mRNA	X11	连续变量
PBMC中MyD88 mRNA	X12	连续变量
PBMC中NF-κB mRNA	X13	连续变量
血清TNF-α	X14	连续变量
血清IL-12	X15	连续变量
血清IL-6	X16	连续变量

TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子；NF-κB：核因子-κB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-12：白细胞介素-12；IL-6：白细胞介素-6.

2 结果

2.1 SSCI患者与健康体检者TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及TNF-α、IL-12、IL-6水平比较

SSCI患者PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均高于健康体检者(均 P＜0.01)，见 表 3。结果提示，SSCI患者TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及其相关炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6表达上调。

表3 SSCI患者与健康体检者TLR4/MyD88/NF-κB基因及相关炎症因子表达比较

Table 3 Expression of TLR4/MyD88/NF-κB pathway genes and related inflammatory factors of SSCI patients and healthy subjects   ( x ± s)

组别	n	TLR4	MyD88	NF-κB	TNF-α(pg/mL)	IL-12(pg/mL)	IL-6(pg/mL)
SSCI患者	105	2.14±0.35	3.18±0.45	2.52±0.37	38.50±4.22	22.13±3.50	3.58±0.64
健康体检者	45	0.95±0.13	1.03±0.16	1.07±0.15	7.61±0.91	5.15±0.84	2.13±0.37
t值	—	22.127	31.166	25.371	48.534	32.093	23.990
P值	—	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01

“—”：无相关数据.SSCI：继发性脊髓损伤；TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子；NF-κB：核因子-κB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-12：白细胞介素-12；IL-6：白细胞介素-6.

2.2 完全损伤组与不完全损伤组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及TNF-α、IL-12、IL-6水平比较

完全损伤组PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均高于不完全损伤组(均 P＜0.01)，见 表 4。结果提示，SSCI患者TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及其相关炎症因子表达上调与疾病进展有关。

表4 SSCI完全损伤组与不完全损伤组TLR4/MyD88/NF-κB基因及相关炎症因子表达比较

Table 4 Expression of TLR4/MyD88/NF-κB pathway genes and related inflammatory factors of complete and incomplete injury groups of SSCI patients   ( x ± s)

组别	n	TLR4	MyD88	NF-κB	TNF-α(pg/mL)	IL-12(pg/mL)	IL-6(pg/mL)
完全损伤组	33	3.62±0.52	5.71±0.80	4.13±0.61	52.01±7.25	30.00±4.59	5.84±0.72
不完全损伤组	72	1.46±0.27	2.02±0.34	1.78±0.30	32.31±5.80	17.15±3.14	2.71±0.40
t值	—	28.042	33.260	26.523	14.907	16.735	28.674
P值	—	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01

“—”：无相关数据.SSCI：继发性脊髓损伤；TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子；NF-κB：核因子-κB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-12：白细胞介素-12；IL-6：白细胞介素-6.

2.3 预后不良组与预后优良组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及TNF-α、IL-12、IL-6水平比较

随访12个月，SSCI患者预后不良率为35.24 % (37/105)；预后不良组PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均高于预后优良组(均 P＜0.01)，见 表 5。结果提示，SSCI患者TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及其相关炎症因子表达上调与预后神经功能恢复不良有关。

表5 SSCI预后不良组与预后优良组TLR4/MyD88/NF-κB基因及相关炎症因子表达比较

Table 5 Expression of TLR4/MyD88/NF-κB pathway genes and related inflammatory factors of prognosis and good prognosis groups of SSCI patients   ( x ± s)

组别	n	TLR4	MyD88	NF-κB	TNF-α(pg/mL)	IL-12(pg/mL)	IL-6(pg/mL)
预后不良组	37	3.48±0.54	5.44±0.72	3.92±0.53	50.43±6.23	31.37±4.59	5.29±0.75
预后优良组	68	1.41±0.21	1.95±0.26	1.76±0.31	32.01±4.51	17.10±2.78	2.65±0.39
t值	—	28.038	36.003	26.377	17.418	19.844	23.771
P值	—	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01

“—”：无相关数据.SSCI：继发性脊髓损伤；TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子；NF-κB：核因子-κB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-12：白细胞介素-12；IL-6：白细胞介素-6.

2.4 预后不良组与预后优良组其他可能影响因素比较

预后不良组与预后优良组性别、年龄、致伤原因、受伤至就诊时间、损伤部位、治疗方式及应用大剂量甲泼尼龙冲击治疗患者构成比差异均无统计学意义(均 P＞0.05)；但预后不良组Frankel分级A级、脊髓水肿或出血、脊髓损伤长度超过4 cm患者构成比均高于预后优良组，差异有统计学意义( P＜0.05或 P＜0.01)，见 表 6。结果提示，Frankel分级A级、脊髓水肿或出血、脊髓损伤长度超过4 cm与SSCI患者神经功能恢复不良有关。

表6 其他可能影响SSCI患者预后的因素比较

Table 6 Other factors that may affect the prognosis of patients with SSCI

可能的影响因素	预后不良组( n=37)	预后优良组( n=68)	χ 2/t 值	P值
性别
男	23	39	0.229	＞0.05
女	14	29
年龄(岁)
＞60	16	24	0.642	＞0.05
≤60	21	44
致伤原因
车祸伤	15	32	0.157	＞0.05
坠落伤	10	16
砸伤	5	8
摔伤	7	12
受伤至就诊时间(h)
＞8 h	10	15	0.326	＞0.05
≤8 h	27	53
Frankel分级
A	18	15	7.861	＜0.01
B~D	19	53
损伤部位
颈段	10	12	1.231	＞0.05
胸腰段	21	46
骶尾段	6	10
脊髓水肿或出血
无	16	12	8.028	＜0.01
有	21	56
脊髓损伤长度(cm)
＞4	6	2	5.999	＜0.05
≤4	31	66
治疗方式
手术	12	25	0.197	＞0.05
非手术	25	43
大剂量甲泼尼龙
冲击治疗
是	9	20	0.310	＞0.05
否	28	48

SSCI：继发性脊髓损伤.

2.5 SSCI患者预后不良危险因素Logistic回归分析结果

Logistic回归分析结果显示，Frankel分级，脊髓水肿或出血，脊髓损伤长度及PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量，血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均是导致SSCI患者预后不良的危险因素(均 P＜0.05)，见 表 7。结果提示，导致SSCI患者预后神经功能恢复不良的危险因素较多，临床应综合评估上述危险因素判断疾病预后。

表7 SSCI患者预后不良危险因素的多因素Logistic回归分析

Table 7 Logistic regression analysis of risk factors for poor prognosis in SSCI patients

变量	β值	SE	Wald χ 2 值	P值	OR值	95% CI
Frankel分级	0.553	0.250	4.893	＜0.05	1.738	1.214~2.263
脊髓水肿或出血	0.629	0.252	6.230	＜0.01	1.876	1.220~2.531
脊髓损伤长度	0.714	0.262	7.427	＜0.01	2.042	1.317~2.767
PBMC中TLR4 mRNA	0.850	0.301	7.975	＜0.01	2.340	1.464~3.215
PBMC中MyD88 mRNA	0.932	0.328	8.074	＜0.01	2.540	1.532~3.547
PBMC中NF-κB mRNA	0.994	0.334	8.857	＜0.01	2.702	1.540~3.864
血清TNF-α	1.136	0.351	10.475	＜0.01	3.114	1.975~4.252
血清IL-12	1.247	0.366	11.608	＜0.01	3.480	2.061~4.899
血清IL-6	1.334	0.368	13.141	＜0.01	3.796	2.100~2.492
常数项	-31.017	0.013	6.782	＜0.01	0.000	—

“—”：无相关数据；SSCI：继发性脊髓损伤；PBMC：外周血单个核细胞；TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子；NF-κB：核因子-κB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-12：白细胞介素-12；IL-6：白细胞介素-6.

2.6 JOA改善率与TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量及TNF-α、IL-12、IL-6水平的相关性

随访12个月，JOA改善率为优、良、可、差的患者例数分别为26、42、26、11例。经Pearson相关性分析，JOA改善率与PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均呈负相关( r=-0.803、-0.812、-0.754及-0.521、-0.559、-0.630， P＜0.05或 P＜0.01)，见 图 1。结果提示，SSCI患者TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及其相关炎症因子表达上调与预后神经功能恢复进程负相关。

图1.

JOA改善率与SSCI患者TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达量及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平的Pearson相关性分析散点图( n=105)

JOA：日本矫形外科学会；SSCI：急性脊髓损伤后继发性脊髓损伤；TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子；NF-κB：核因子κB；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IL-12：白细胞介素-12；IL-6：白细胞介素-6.

3 讨论

急性脊髓损伤是临床高致残率的外伤性疾病，可造成感觉、运动障碍、二便失控，并可引发压疮、肢体疼痛、痉挛、尿路及呼吸系统感染等多种并发症 ^{[ 8]} 。急性脊髓损伤后的病理进程主要包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段，前者是由机械性原因导致脊髓直接性损伤，多不可逆；后者是在原有损伤的基础上出现局部氧化应激、炎症反应，进而导致持续性病理改变 ^{[ 9]} 。研究发现，SSCI疾病进展期间伴随炎症因子大量释放、自身免疫损伤、氧自由基生成等病理变化，继而引起一系列连锁反应，加速脊髓神经细胞凋亡、结构和功能丧失，脊髓损伤范围逐渐扩大 ^{[ 10]} 。因此，有效预防SSCI病程进展，最大限度地控制脊髓损伤范围扩大，成为改善疾病预后的关键。

TLR4是Toll样受体家族的重要成员之一，可与特异性病原相关分子模式结合，识别病原，从而激活机体固有免疫系统 ^{[ 11]} 。MyD88依赖途径是TLR4胞内主要信号通路，两者信号分子结合可激活下游NF-κB级联反应，从而刺激单核细胞、巨噬细胞等炎症细胞合成和释放大量炎症因子，如TNF-α、IL-12、IL-6等 ^{[ 12]} 。TNF-α可诱导神经元及神经胶质细胞凋亡，可导致肢体运动和感觉功能异常，同时参与调节痛觉过敏 ^{[ 13]} 。IL-12、IL-6可通过刺激星形胶质细胞增生，加速SSCI进展，同时可促进神经干细胞分化为胶质细胞，引起神经病理性疼痛 ^{[ 14]} 。本研究SSCI患者PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均高于健康体检者，完全损伤组上述指标均高于不完全损伤组，提示TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及其相关炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6表达上调参与SSCI疾病进展。

脊髓神经元细胞受损后，其自身及局部聚集的白细胞共同分泌大量细胞因子，通过复杂的调控网络影响神经元细胞功能，从而调控SSCI疾病进展，影响预后转归。既往研究证实，外周血炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6在颅脑损伤过程中异常升高，且部分细胞因子水平升高程度与疾病严重程度和转归关系密切 ^{[ 15]} 。黄玉琴等 ^{[ 16]} 研究发现，通过抑制NF-κB炎症信号通路及相关炎症因子TNF-α、IL-1β可有效减轻急性脊髓损伤继发性损伤，提示炎症因子在SSCI进展中起重要作用。本研究预后不良组PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均高于预后优良组，且经Logistic回归分析证实均是导致SSCI患者预后不良的危险因素，进一步提示TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及其相关炎症因子与SSCI预后关系密切。JOA改善率是反映脊髓神经功能恢复情况的重要指标，相关性分析发现，随访12个月后SSCI患者JOA改善率与PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平均呈负相关，提示上述指标变化与脊髓功能恢复关系密切。

综上所述，TLR4/MyD88/NF-κB通路激活及相关炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6表达上调参与SSCI疾病进展，且PBMC中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA及血清TNF-α、IL-12、IL-6水平与神经炎症损伤关系密切，可作为评估预后的参考指标，并提示临床可通过靶向调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制脊髓神经继发性损伤，为SSCI临床治疗提供理论基础。

Funding Statement

浙江省中医药科技计划（2018ZB138）