Abstract
目的
探讨外消旋雌马酚及其对应异构体对乌拉坦诱导小鼠肺癌的影响及其可能机制。
方法
120只小鼠随机分为8组，实验组予以染料木素或不同剂量的雌马酚，每周2次连续4周皮下注射乌拉坦后测量并记录各组小鼠体质量、摄食量和肺癌发生率。处死小鼠后收集小鼠血液、肝和肺，用相应的试剂盒检测血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxydeoxygunosine, 8-OHdG)的含量，蛋白免疫印迹法检测肝中核因子红系2相关因子2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2, Nrf2]的表达。
结果
120只小鼠中49只出现肺癌，肺癌总体发生率为40.8%。与喂养基础饲料的对照组相比，各实验组肺癌发生率均更低，且差异具有统计学意义，同种药物高剂量实验组肺癌发生率显著低于低剂量实验组，但是同等剂量下3种雌马酚组和染料木素组小鼠肺癌发生率相当。与对照组相比，高剂量实验组小鼠血清中SOD含量更高，MDA和8-OHdG的含量更低，且差异具有统计学意义。蛋白免疫印迹检测结果显示，除低剂量外消旋雌马酚组外其余各组小鼠的Nrf2蛋白表达水平均高于对照组小鼠，并且同种药物高剂量雌马酚组的Nrf2蛋白表达水平高于低剂量雌马酚组。
结论
雌马酚及其对应异构体可能通过抗氧化效应抑制肺癌的发生。
Keywords: 雌马酚, 雌马酚对应异构体, 肺癌, 抗氧化活性, 核因子红系2相关因子2(Nrf2)
Abstract
Objective
To investigate the effects and mechanisms of equol and its enantiomers on urethane-induced lung cancer in mice.
Methods
A total of 120 5-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into 8 groups: lung cancer tumor control group (CG), genistein control group (GCG), low dose racemic equol group (LEG), high dose racemic equol group (HEG), low dose R-equol group (LRE), high dose R-equol group (HRE), low dose S-equol group (LSE) and high dose S-equol group (HSE). Urethane was injected subcutaneously twice a week for 4 weeks to induce lung cancer and then the mice were fed for 4 months. The body weight and food intake of each group were measured and recorded weekly. After the mice were sacrificed, the blood, livers and lungs of the mice were collected. The incidence of lung cancer in each group was recorded. The concentration of serum superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and 8-hydroxydeoxygunosine (8-OHdG) were detected by the corresponding kits. Western blotting was used to detect the expression of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) in the livers. Between-group differences in body weight and food intake of the mice were compared using repeated measures ANOVA, and ANOVA for the differences between non-repeated measurements, with post hoc analysis using Tukey's method if there were between-group differences. Comparisons of categorical data were performed by chi-square test, and if there were differences between the groups, the Bonferroni method was used for pairwise comparison.
Results
A total of 49 in the 120 mice developed lung cancer. The overall incidence of lung cancer was 40.8%. Compared with the control group, the incidence of lung cancers in each experimental group was lower, and the difference was statistically significant. The incidence of lung cancer in the high-dose experimental group was significantly lower than that in the low-dose experimental group. However, the incidence of lung cancer was similar in the three equol groups and the genistein group at the same dose. Compared with the control group, the high-dose experimental group had higher serum SOD concentration, lower MDA and 8-OHdG concentrations, and the differences were statistically significant. Western blotting analysis showed that the expression levels of Nrf2 protein in the experimental groups were higher than those in the control group except the low-dose racemic equol group, and the Nrf2 protein expression level in the high-dose equol groups was higher than that in the low-dose equol groups.
Conclusion
Racemic equol and its enantiomers mayinhibit lung carcinogenesis through antioxidant effects.
Keywords: Equol, Equol enantiomers, Lung cancer, Antioxidant activity, Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一, 根据组织学类型分型，肺癌可以分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中非小细胞肺癌是肺癌中最常见的类型，约占肺癌的85%[1]。根据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)2020年发布的报告，在美国所有癌症中，肺癌的发病率和病死率分别为第2位和第1位，接近四分之一的癌症患者死于肺癌[2]。在我国，肺癌的发病率呈逐年上升趋势，1988—2005年间，肺癌发病率的年平均增长为1.63%，其中男性为1.30%，女性为2.34%[3]。2015年我国肺癌新发病例达73.3万人，死亡61.0万人，占所有肿瘤发病和死亡人数的17.1%和21.7%[4]。目前NSCLC患者的治疗方案主要包括根治性手术、放化疗和分子靶向治疗。虽然在手术方式的优化、辅助支持治疗和综合治疗方面取得了进展，但是NSCLC患者的预后仍不理想，5年生存率仅约21%[5-6]。药物化疗作为肺癌一种常用治疗手段，在中晚期肺癌的治疗中发挥着重要的作用，但是NSCLC对传统治疗药物并不敏感，并且常常出现耐药[7-8]。因此，寻找对肺癌防治更加有效的方法至关重要。
天然食物及其活性成分在改变肺癌风险中所发挥的作用目前越来越受到研究者重视。大量证据已经证实，水果、蔬菜、豆类及其所含的特定抗氧化剂和活性成分(如植物雌激素)对肺癌具有预防作用[9]。大豆异黄酮是植物雌激素的一种，是大豆生长过程中形成的次生代谢产物，存在游离型的苷元和结合型的糖苷两种形式，其中苷元主要为染料木素、大豆苷元和黄豆黄素3种。雌马酚是大豆苷元在体内生物转化产生的具有较稳定化学结构的代谢产物，是大豆异黄酮及其代谢产物中雌激素样活性和抗氧化活性最高的一种[10]。与前体物质大豆苷元不同，雌马酚在呋喃环的C-3位置处有一个手性碳，因此是手性分子，存在R、S两种对应异构体，体内代谢产物均为S型，人工合成的雌马酚则为二者混合物，即外消旋雌马酚。目前雌马酚(尤其是雌马酚对应异构体)对肺癌影响的研究较少见，雌马酚及其对应异构体对肺癌的影响及其机制尚不清楚。本研究以C57BL/6小鼠为研究对象，探讨外消旋雌马酚及雌马酚对应异构体对肺癌的影响和其可能机制。
1. 材料和方法
1.1. 仪器与试剂
酶联免疫检测仪购自美国Thermo公司，外消旋雌马酚及其对应异构体(98%)购自美国LC Laboratories公司，核因子红系2相关因子2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2, Nrf2]抗体购自美国Abcam公司，β-actin(AC001-M)购自美国Santa Cruz Biotecnology公司，二抗抗体购自爱尔兰Rockland公司，胰酶、胎牛血清、细胞培养基购自美国Invitrogen公司，蛋白提取、定量及蛋白免疫印迹相关试剂购自美国Bio-rad公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehye, MDA)和8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxydeoxygunosine, 8-OHdG)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2. 动物实验
5周龄雄性C57BL/6小鼠120只，购自北京维通利华实验动物有限公司[实验动物生产许可证：SCXK(京)2016-0006]，饲养于北京大学医学部实验动物科学部SPF级动物实验室。实验室温度(23±2)℃，湿度50%±5%，通风良好，光线12 h明暗交替，动物自由饮水和摄取配方饲料。采用改良的AIN-93G配方饲料，为了排除饲料中大豆异黄酮的影响，其中的大豆油用玉米油代替。适应性喂养1周后进行动物分组，同时进行肺癌的造模。本研究开始前获得北京大学生物医学伦理委员会审查批准(LA2020048)。
120只小鼠随机分为8组(表 1)，每组15只，分别为肺癌肿瘤对照组(control group, CG组)、染料木素对照组(genistein control group, GCG)、低剂量外消旋雌马酚组(low equol group, LEG)、高剂量外消旋雌马酚组(high equol group, HEG)、低剂量R-雌马酚组(low R-equol group, LRE)、高剂量R-雌马酚组(high R-equol group, HRE)、低剂量S-雌马酚组(low S-equol group, LSE)和高剂量S-雌马酚组(high S-equol group, HSE)。调整人与啮齿动物的异速生长比例后，250 mg/kg的雌马酚与人类从日常大豆食品的摄入量相当[11]。因此，本研究雌马酚及其对应异构体各设两个剂量组，即250 mg/kg和500 mg/kg，比较常规大豆饮食和高剂量的雌马酚对肺癌的影响，设置染料木素组比较雌马酚及其对应异构体与经典大豆异黄酮对肺癌的影响。
表 1.
各实验组饲料成分
Feed composition of each group
| Group | Diets |
| CG，control group；GCG，genistein control group；LEG，low equol group；HEG，high equol group；LRE，low R-equol group；HRE，high R-equol group；LSE，low S-equol group；HSE，high S-equol group. | |
| CG | modified AIN-93G diet |
| GCG | modified AIN-93G diet+500 mg/kg genistein |
| LEG | modified AIN-93G diet+250 mg/kg equol |
| HEG | modified AIN-93G diet+500 mg/kg equol |
| LRE | modified AIN-93G diet+250 mg/kg R-equol |
| HRE | modified AIN-93G diet+500 mg/kg R-equol |
| LSE | modified AIN-93G diet+250 mg/kg S-equol |
| HSE | modified AIN-93G diet+500 mg/kg S-equol |
乌拉坦粉末溶于0.9%(质量分数)生理盐水中，充分振荡混匀配成4%(质量分数)的乌拉坦溶液，于棕色玻璃瓶中保存。皮下注射方式给与每只小鼠800 mg/kg剂量的乌拉坦溶液，每周2次, 连续4周诱导肺癌动物模型。乌拉坦连续注射4周后再继续喂养4个月(17周)后结束实验，脱颈椎法处死小鼠。开始实验的每周第1天及实验结束当天称量并记录小鼠体质量和食物摄入量，观察小鼠状态和生长情况。实验结束时处死解剖小鼠，取肺，肉眼进行初步的肿瘤形态学鉴定，并进行肿瘤取材，经多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤制作病理切片，显微镜下核实判断。记录各组发生肿瘤的小鼠数，计算各组肿瘤发生率，肿瘤发生率=(各组发生肿瘤的小鼠数/各组小鼠总数)×100%。
1.3. 血液氧化/抗氧化指标检测
实验结束处死小鼠前对小鼠进行麻醉，使用摘眼球法取血，所得血液立即经离心机3 000 r/min离心15 min，分离出血清，置于-20℃冰箱保存。血清中的SOD、MDA和8-OHdG的含量按照说明书步骤使用相应的试剂盒进行检测。
1.4. 蛋白表达水平的测定
称量50~100 mg肝左叶组织放在玻璃匀浆器中，加入含有1 mol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethyl-sulfonyl fluorid, PMSF)的细胞裂解液，冰上裂解30 min后，4 ℃，12 000 r/min离心5 min取上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白浓度测定法进行定量。50 μg总蛋白等量上样，10%(质量分数)的聚丙稀酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转至聚偏氟乙烯膜。5%(质量分数)脱脂奶溶液室温封闭2 h后，Nrf2和β-actin的一抗抗体用5%脱脂奶稀释，4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液(tris buffered saline，with Tween-20, pH 8.0)漂洗3次后加入二抗，室温下孵育1 h，使用增强荧光发光试剂显影，然后使用图像成像系统检测条带。
1.5. 统计学分析
采用SPSS 22.0软件，小鼠体质量、食物摄入量等计量资料数据以x±s表示，小鼠体质量和食物摄入量用重复测量数据的方差分析是否存在组间差异，若存在组间差异则用Tukey法进行两两比较；其余非重复测量数据间差异比较使用ANOVA方差分析，若存在组间差异则用Tukey法进行两两比较。计数资料以率表示，多组间率的比较采用卡方检验，若存在组间差异则用Bonferroni法进行两两比较，双侧检验，P < 0.05认为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 小鼠体质量和摄食量情况
每组小鼠平均体质量周变化情况如图 1，随机分组后各组小鼠体质量差异无统计学意义，皮下注射乌拉坦造模期间小鼠体质量呈基本不变或略有下降趋势，随后各组小鼠随时间增加体质量增加。总体来看，CG组小鼠体质量最高而LRE和HRE组小鼠体质量较低，但重复测量数据的方差分析发现各组小鼠体质量差异无统计学意义。
图 1.
实验期间小鼠体质量周变化情况
Weekly changes in body weight of mice during the experiment
CG, control group; GCG, genistein control group; LEG, low equol group; HEG, high equol group; LRE, low R-equol group; HRE, high R-equol group; LSE, low S-equol group; HSE, high S-equol group.
每组小鼠平均食物摄入量周变化如图 2，总体来看，CG组和HEG组小鼠平均食物摄入量较高，而LRE和HRE组较低，且LRE组和HRE组与CG组和HEG组小鼠平均食物摄入量间差异具有统计学意义。
图 2.
实验期间小鼠单位体质量食物摄入量周变化情况
Changes in weekly food intake per unit weight of mice in each group
CG, control group; GCG, genistein control group; LEG, low equol group; HEG, high equol group; LRE, low R-equol group; HRE, high R-equol group; LSE, low S-equol group; HSE, high S-equol group.
2.2. 小鼠肺癌发生情况
乌拉坦致小鼠肺癌切片经HE染色结果发现全部为肺腺癌，诱导时间短且无小鼠死亡。120只小鼠中49只出现肺癌，肺癌总体发生率为40.8%，各组小鼠的肺癌发生情况如表 2，CG组肺癌发生率最高为86.7%(13/15)，HRE和HSE组肺癌发生率最低为13.3%(2/15)。与CG组相比，各实验组肺癌发生率均更低，且差异具有统计学意义。同种药物高剂量实验组肺癌发生率显著低于低剂量实验组。同等剂量下，3种雌马酚组小鼠肺癌发生率差异没有统计学意义，并且与GCG组小鼠肺癌发生率相当。
表 2.
各组小鼠肺癌发生情况
The incidence of lung cancer in each group
| Group | Total | Number of cases of lung cancer | Incidence of lung cancer/% |
| * P < 0.05，# P < 0.01，compared with group CG. GCG，genistein control group；LEG，low equol group；HEG，high equol group；LRE，low R-equol group；HRE，high R-equol group；LSE，low S-equol group；HSE，high S-equol group. | |||
| CG | 15 | 13 | 86.7 |
| GCG | 15 | 3 | 20.0# |
| LEG | 15 | 9 | 60.0* |
| HEG | 15 | 3 | 20.0# |
| LRE | 15 | 8 | 53.3* |
| HRE | 15 | 2 | 13.3# |
| LSE | 15 | 9 | 60.0* |
| HSE | 15 | 2 | 13.3# |
2.3. 氧化/抗氧化指标结果
ELISA检测各组小鼠血清中SOD、MDA和8-OHdG的含量(表 3)发现，与CG组相比，GCG、HRE和HSE组小鼠血清中SOD的含量较高，且差异具有统计学意义；HEG、LRE和LSE组小鼠血清中SOD含量高于CG组，但差异无统计学意义。与CG组相比，LEG组小鼠血清中MDA含量较低，但差异无统计学意义，其余各组小鼠血清中MDA含量均显著低于CG组，且同种药物高剂量雌马酚组小鼠血清中MDA含量显著低于低剂量雌马酚组。与CG组相比，LSE组小鼠血清中8-OHdG含量较低，但差异无统计学意义，其余各组小鼠血清中8-OHdG含量均显著低于CG组，且同种药物高剂量雌马酚组小鼠血清中8-OHdG含量显著低于低剂量雌马酚组。同等剂量下，3种雌马酚组小鼠血清中氧化/抗氧化指标差异无统计学意义，并且与GCG组小鼠相当。
表 3.
各组小鼠血清中氧化/抗氧化指标结果
The result of oxidation/anti-oxidation indices in serum of each group
| Group | SOD | MDA | 8-OHdG |
| # P < 0.01，compared with group CG. CG，control group；GCG，genistein control group；LEG，low equol group；HEG，high equol group；LRE，low R-equol group；HRE，high R-equol group；LSE，low S-equol group；HSE，high S-equol group. | |||
| CG | 59.70±12.72 | 3.48±0.12 | 7.16±0.38 |
| GCG | 68.50±2.09# | 2.85±0.54# | 6.08±0.65# |
| LEG | 54.55±14.65 | 3.24±0.18 | 6.51±0.22# |
| HEG | 64.02±6.47 | 2.61±0.43# | 5.41±0.55# |
| LRE | 64.86±10.49 | 3.04±0.86# | 6.45±0.40# |
| HRE | 70.61±1.88# | 2.27±0.25# | 5.39±0.64# |
| LSE | 61.40±11.60 | 3.04±0.60# | 6.88±0.70 |
| HSE | 70.27±5.19# | 2.51±0.42# | 5.62±0.71# |
为了进一步探讨雌马酚及其对应异构体影响肺癌发生的抗氧化机制，通过Western blotting法检测了肝组织中Nrf2蛋白的表达(图 3)，发现除LEG组外，其余各组小鼠的Nrf2蛋白表达水平均高于CG组小鼠，并且同种药物高剂量雌马酚组的Nrf2蛋白表达水平高于低剂量雌马酚组。
图 3.
各组小鼠Nrf2蛋白的表达情况
Nrf2 protein expression profile in each group
CG, control group; GCG, genistein control group; LEG, low equol group; HEG, high equol group; LRE, low R-equol group; HRE, high R-equol group; LSE, low S-equol group; HSE, high S-equol group.
3. 讨论
本研究以C57BL/6小鼠为研究对象，探讨了外消旋雌马酚及雌马酚对应异构体对乌拉坦诱导的肺癌发生发展过程影响及其机制，并与经典大豆异黄酮染料木素比较，发现雌马酚及其对应异构体可能通过上调Nrf2基因的表达，增强小鼠的抗氧化能力，进而降低乌拉坦诱导的肺癌发生率。3种雌马酚降低肺癌发生率的作用差异无统计学意义，且与同等剂量的染料木素作用相当。
细胞外及细胞内SOD、MDA和8-OhdG的含量可一定程度反映细胞的氧化损伤情况。SOD是机体抗氧化系统中重要的酶类，可以特异性地结合机体内的超氧阴离子，清除自由基，通过阻断氢原子供体和终止自由基连锁反应，抑制机体内脂质过氧化反应，起到抗氧化作用。MDA是脂质过氧化的反应终产物，MDA的增加表明组织细胞脂质过氧化产物量的增加，可以间接反映出机体细胞受自由基攻击的程度。8-OHdG是活性氧自由基氧化损伤细胞核DNA或线粒体DNA后形成的产物，在机体内稳定存在，不会通过非DNA氧化途径形成，也不再被机体进一步代谢，因此常作为内源性及外源性因素对DNA氧化损伤作用的生物标志物。大豆异黄酮含有多个酚羟基作为配氢体，可以为活性氧自由基提供电子和氢，使这些自由基得以稳定发挥其抗氧化作用[12]。既往研究发现，大豆异黄酮及其代谢产物雌马酚可降低大鼠血清中8-羟基脱氧鸟苷的含量，增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的表达[13-14]。本研究通过测量各组小鼠血清中SOD、MDA和8-OHdG的含量来衡量各组小鼠血液氧化/抗氧化水平，结果表明雌马酚及其对应异构体可显著提高小鼠的抗氧化能力，且同种药物高剂量雌马酚组的小鼠血清抗氧化水平显著高于低剂量雌马酚组，即雌马酚具有的抗氧化性可能存在一定的剂量反应关系。
Nrf2是细胞调节氧化应激的一种关键转录因子，通过与抗氧化反应原件结合，启动下游抗氧化基因的转录和表达，进而提高细胞抗氧化能力。有研究报道Nrf2可诱导抗氧化酶的表达来降低肝、肺等组织的氧化损伤，进而发挥其化学防癌的作用[15-16]。本研究测量了各组小鼠Nrf2蛋白的表达，结果表明雌马酚及其对应异构体可上调小鼠Nrf2蛋白的表达。这些结果与各组小鼠肺癌发生率及血清中氧化/抗氧化相关指标结果一致，提示雌马酚及其对应异构体可能通过上调Nrf2基因的表达来增强小鼠的抗氧化能力，进而降低了乌拉坦诱导的肺癌发生率。
综上所述，雌马酚及其对应异构体可能通过抗氧化效应抑制肺癌的发生，本研究结果为利用雌马酚，发挥其有益效应，避免其有害影响提供了理论依据。
Funding Statement
国家自然科学基金(81573130)和北京市自然科学基金(7172117、S160004)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (81573130) and the Beijing Natural Science Foundation (7172117, S160004)
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