丹参酮IIA通过抑制RIP3/FUNDC1信号通路减轻LPS诱导的小鼠肾小管上皮细胞凋亡

Abstract

目的

探讨丹参酮IIA在防治脓毒血症急性肾损伤（AKI）方面的作用及潜在机制。

方法

将30只C57BL/6小鼠随机分为对照组（10 mg/kg LPS等体积无菌生理盐水）、LPS组（10 mg/kg LPS作用24 h）、LPS+丹参酮IIA组（10 mg/kg丹参酮IIA预处理15 min再给予10 mg/kg LPS作用24 h）（10只/组）。给药后检测小鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮水平(BUN)，PAS染色观察小鼠肾组织病理变化，Western blot检测小鼠肾组织RIP3、Cleaved-caspase3、p¹⁸-FUNDC1表达水平。将体外培养正常的人肾小管上皮细胞（HK-2）分为空白对照组、LPS刺激组（LPS，10 μg/mL）、LPS+siNC组（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siNC）、LPS+siRIP3组（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siRIP3）、丹参酮IIA干预组（LPS 10 μg/mL+ 丹参酮IIA 10 mg/L），分别给予以上干预措施。采用TUNEL方法检测各组HK-2细胞的凋亡情况，Western blot检测各组RIP3、Cleaved-caspase3、p¹⁸-FUNDC1表达水平，qT-PCR检测RIP3基因表达水平。

结果

与对照组相比，LPS作用小鼠24 h后，小鼠Scr及血BUN水平升高，PAS染色提示近段肾小管损伤，肾组织中RIP3、Cleaved-caspase3、p¹⁸-FUNDC1蛋白表达上调（P<0.001）。与LPS组相比，丹参酮IIA预处理后，小鼠Scr及BUN水平下降，PAS染色显示近段肾小管损伤减轻，肾组织中RIP3、Cleaved-caspase3、p¹⁸-FUNDC1蛋白表达下降（P<0.001）。体外研究显示，与对照组相比，LPS刺激的HK-2细胞后，TUNEL染色显示细胞凋亡水平明显增加，Cleaved-caspase3、RIP3、p¹⁸-FUNDC1表达上调（P<0.05）。应用丹参酮IIA预处理或体外沉默RIP3表达后再次予以LPS刺激细胞，TUNEL染色显示细胞凋亡水平较LPS组明显减少，Cleaved-caspase3、RIP3、p¹⁸-FUNDC1表达水平较LPS组下降（P<0.05）。

结论

丹参酮IIA可能通过抑制RIP3/FUNDC1信号通路来改善LPS诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

脓毒血症是危重患者发生AKI的主要病因之一，尽管目前诊疗水平不断提高，但脓毒血症AKI在危重患者中的患病率及死亡率仍较高^[1]。因此积极探索脓毒血症AKI的发病机制，对寻找有效的诊治方案具有重要的临床意义。

肾小管上皮细胞（RTECs）损伤是AKI发病的重要原因^{[2, 3]}，内毒素通过受体相互作用蛋白激酶（RIP）3导致RTECs死亡是AKI的重要机制。一方面，RIP3可介导RTEC发生凋亡性坏死^[4-6]；另一方面，它可以通过介导FUN14结构域蛋白1（FUNDC 1）诱导细胞凋亡^[7]。FUNDC1是一种线粒体受体蛋白，参与线粒体自噬、细胞凋亡及线粒体Ca²⁺稳态的调控，近年来研究发现FUNDC1在肾脏疾病中发挥重要作用^[7-9]。然而RIP3/FUNDC1信号通路在脓毒血症AKI中的作用，目前尚无报道。

丹参作为临床常用中药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效，丹参酮IIA是从丹参中提取的脂溶性化合物，具有广泛的生理活性，包括抗氧化、抗凋亡、抗炎等^{[10, 11]}。近年来研究表明，丹参酮IIA对脂多糖所致的AKI动物具有防治作用^{[12, 13]}，但其机制尚不清楚。

本研究分别建立LPS诱导的脓毒血症AKI小鼠模型以及LPS刺激的HK-2细胞凋亡细胞模型，观察丹参酮IIA对脓毒血症AKI的保护作用以及其对RIP3/FUNDC1通路的影响。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 药物与试剂

丹参酮IIA，分子式C₁₉H₁₈O₃，相对分子质量：294.34（成都植标化纯生物技术有限公司），用DSMO配制为1g/L的原液，用时根据需要应用培养基进行稀释。DMEM/F12培养基（CORNING）、二甲基亚砜（DMSO）(Sigma)、脂多糖（L-2880）（Sigma）、RIP3 siRNA（广州锐博生物有限公司）、胎牛血清（FBS）（Hyclone）、Anti-RIP3（Cat No. 17563-1-AP）（Proteintech）、Anti-cleaved-caspase3抗体（ab2302）（Abcam）、Anti-p-FUNDC 1（Tyr18）（Abgent）、TUNEL试剂盒（瑞士罗氏公司）、Scr、BUN试剂盒（美国博世生物技术有限公司）、糖原PAS染色试剂盒（Solarbio Life Sciences）。

1.1.2. 细胞

人源性肾小管上皮细胞株HK-2细胞（广州永诺生物科技有限公司）。

1.1.3. 仪器

超净工作台（Thermo Fisher）；CO₂培养箱（Thermo Fisher）；电泳仪（Bio-Rad）；垂直电泳槽和Trans-Blot转印槽（Bio-Rad）；研究级正置荧光显微镜Eclipse Ni-E（Nikon）。

1.2. 实验方法

1.2.1. 动物建模

动物实验通过广州永诺生物动物中心伦理审查（编号IACUC-AEWC-F2109012）。30只雄性C57BL/6小鼠饲养于广州永诺生物科技有限公司，10只/组，饲养于SPF级的动物房，小鼠自由进水及进食。造模前全部小鼠均禁食12 h，造模条件如下：对照组予以腹腔注射与LPS等体积的生理盐水；LPS组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS，刺激24 h；LPS+丹参酮IIA组预先腹腔注射10 mg/kg丹参酮IIA处理15 min再给予10 mg/kg LPS作用24 h。

1.2.2. 细胞培养

HK-2细胞置于有10%胎牛血清的培养基（DMEM/F12）、5% CO₂ 37 ℃条件下进行培养，每1~2 d换液，细胞生长至密度约90%时即可传代。实验分为5组：空白对照组、LPS组（LPS 10 μg/mL，24 h）、LPS+丹参酮IIA组（丹参酮IIA 10 mg/L预处理1 h后，再给予LPS 10 μg/mL刺激24 h）、LPS+siNC组（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siNC）、LPS+siRIP3组（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siRIP3）。

1.2.3. TUNEL染色

将约1×10⁴细胞接种于无菌盖玻片上，培养24~48 h，进行相应刺激后，PBS清洗细胞1次，4%多聚甲醛固定细胞30 min，用0.1%Triton X-100透化2 min。按说明书配置TUNEL检测液，将TUNEL检测液滴加至各待检测样本中，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后，荧光显微镜下观察。

1.2.4. siRNA干扰

去除细胞培养基，PBS清洗细胞，加入适量无血清DMEM/F12培养基。将已混匀的siRNA-Lipo2000混合液培养基中，使含有siRNA的混合液均匀分布于细胞表面，并将培养皿放入5% CO₂ 37 ℃培养箱中。6~8 h后观察细胞转染情况及细胞状态，细胞表面出现透亮的圆孔，提示转染成功，即可更换10%FBS完全培养基。

1.2.5. Western blot检测

去除细胞培养基，PBS清洗细胞后，加入细胞裂解液充分裂解细胞，收集上清液，离心后取上清液，根据BCA法检测蛋白浓度，各组样本根据相同质量配齐蛋白，加入Loading buffer后煮沸后加样，进行SDS-PAGE电泳实验。应用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育后显影。

1.3. 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。所有数据进行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布的计量资料，采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用Bonferroni多重比较法。当P<0.05认为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2. 结果

2.1. 丹参酮IIA改善小鼠脓毒血症肾损伤

应用LPS刺激小鼠建立脓毒血症AKI小鼠模型，LPS刺激小鼠24 h后，Scr及BUN明显高于对照组（P<0.001，图 1C），肾组织PAS染色显示，LPS组小鼠近段RTEC出现空泡变性，管腔狭窄，上皮细胞脱落，基底膜裸露，而对照组没有这些改变（图 1A、B）。这些结果表明LPS刺激成功建立了脓毒血症AKI模型，损伤部位主要为近段RTEC。应用丹参酮IIA预处理后（LPS+丹参酮IIA组），小鼠Scr及BUN水平较LPS组下降（P<0.001），肾组织病理显示，和LPS组比较，近段RTEC空泡变性、上皮细胞脱落、基底膜裸露等损伤改变显著减轻。

1.

各组小鼠肾组织肾脏病理情况（PAS染色）及肾功能水平（Scr、BUN）

Renal pathology and serum creatinine and blood urea nitrogen levels in the mice in different groups. A: Representative acid-Schiff-stained kidney sections in the three groups (PAS staining, original magnification: × 200). B: Quantification of tubular injury (10 fields for each kidney section). C: Serum creatinine and blood urea nitrogen levels in the 3 groups. ^*P<0.001 vs control, ^#P<0.001 vs LPS.

2.2. 丹参酮IIA可抑制小鼠RIP3/FUNDC1信号通路及肾脏凋亡水平

应用Western blot检测肾组织中Cleaved-caspase3的表达水平，结果显示，与对照组相比，LPS组肾组织中Cleaved-caspase3表达上调，丹参酮IIA预处理后（LPS+ 丹参酮IIA组），再给予LPS刺激，小鼠肾组织中Cleaved-caspase3表达水平较LPS组明显下降（图 2A、B）。

2.

各组小鼠肾组织中p¹⁸-FUNDC1、C-caspase3、RIPK3表达水平

Expression levels of p¹⁸-FUNDC1, cleaved caspase-3 and RIP3 in the kidney of the mice detected by Western blotting. A: Western blots of p¹⁸-FUNDC1, C-caspase-3 and RIP3. B: Quantification of p¹⁸-FUNDC1, C-caspase-3 and RIP3 protein expressions. ^*P<0.001 vs control, ^#P<0.001 vs LPS.

检测肾组织中RIP3及p¹⁸-FUNDC1的表达水平，结果显示LPS刺激后，肾组织中RIP3、p¹⁸-FUNDC表达上调，而LPS+丹参酮IIA组，RIP3、p¹⁸-FUNDC表达水平较LPS组下降（图 2A、B）。

2.3. 丹参酮IIA可减轻LPS诱导的HK-2细胞凋亡水平

与对照组相比，LPS刺激HK-2细胞24 h后（LPS组），细胞凋亡水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。丹参酮IIA预处理后，LPS诱导的HK-2细胞（LPS+丹参酮IIA组）凋亡水平明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）（图 3A、B）。

3.

LPS刺激下不同处理组细胞凋亡水平

Apoptosis of HK-2 cells with LPS exposure in different treatment groups. A: TUNEL staining of the cells with different treatments (×200). B: Quantification of TUNEL-positive cells in each group. ^*P<0.05 vs control, ^#P<0.05 vs LPS. ^*P<0.001 vs control, ^#P<0.001 vs LPS.

通过Western blot检测各组凋亡蛋白Cleavedcaspase3表达水平发现，与对照组相比，LPS刺激后，HK-2细胞Cleaved-caspase3表达增加，丹参酮IIA预处理后，LPS刺激下的HK-2细胞表达Cleaved-caspase3表达较LPS组下降（图 4A、B）。

4.

LPS刺激下不同处理组细胞RIP3、c-caspase3、p¹⁸-FUNDC1表达水平

Expression of RIP3 and cleaved caspase-3 in HK-2 cells in different groups. A: Western blot of p¹⁸-FUNDC1, C-caspase-3 and RIP3 in HK-2 cells with different treatments. B: Quantification of p¹⁸-FUNDC1, C-caspase3 and RIP3 protein expressions. C: RIP3 mRNA expression detected using qRT-PCR in HK-2 cells following different treatments. ^*P<0.05 vs control, ^#P<0.05 vs LPS.

2.4. 抑制RIP3/FUNDC1信号通路可减轻HK-2细胞凋亡水平

通过TUNEL检测发现，转染siRIP3后给予LPS刺激（LPS+siRIP3组），细胞凋亡水平明显较LPS组减少（图 3A、B）。Western blot检测各组细胞Cleaved-caspase-3的表达水平发现，LPS+siRIP3组细胞蛋白Cleavedcaspase-3表达较LPS组明显下调（图 4A、B，P<0.05）。

通过Western blot各组细胞p¹⁸-FUNDC1表达水平发现，转染siRIP3后给予LPS刺激（LPS+siRIP3组），而p¹⁸-FUNDC1的表达水平下降（P<0.05）。

2.5. 丹参酮IIA可抑制HK-2细胞RIP3/p¹⁸-FUNDC1信号通路

通过Western blot检测各组RIP3及p¹⁸-FUNDC1的表达水平发现，与对照组相比，LPS组RIP3、p¹⁸-FUNDC1表达水平增加。丹参酮IIA预处理下，LPS刺激的HK-2细胞，RIP3、p¹⁸-FUNDC1表达水平下调（图 4A~C，P<0.05）。

3. 讨论

AKI是脓毒血症最常见并发症之一，脓毒血症AKI在危重患者中具有较高的死亡率，其高死亡率与其发病机制尚不完全明确有关。RTEC损伤是脓毒血症AKI主要的发病基础^[14-16]，研究显示，RTEC凋亡在脓毒血症AKI的发病中起重要作用^[17-20]。本研究分别用LPS注射小鼠和体外刺激RTEC构建了体内及体外脓毒血症AKI模型。在这些模型中，丹参酮IIA能抑制RIP3/FUNDC1信号通路，减少细胞凋亡，并改善LPS刺激小鼠的肾功能。

RIP3是受体相互作用蛋白家族成员，由N端激酶结构域及C端RIP同型相互作用基序组成，具有磷酸化酶活性，在体内广泛分布，主要表达于肾脏、心脏、脑、脾脏等部位^[21-26]。RIP3是凋亡性坏死通路中的关键因子，此外RIP3还可以通过介导FUNDC1参与细胞凋亡的发生。有研究显示脓毒血症AKI患者血、尿中RIP3水平增加，进一步动物研究也发现LPS诱导脓毒血症AKI小鼠，肾组织中RIP3表达增加，并参与脓毒血症AKI中RTEC凋亡的发生，然而机制尚不明确^[27]。为验证RIP3是否通过调控FUNDC1介导RTEC凋亡的发生，本研究分别在体内、体外模型中检测RIP3、FUNDC1蛋白的表达情况。

在RIP3/FUNDC1信号通路介导的细胞凋亡途径中，RIP3通过磷酸化FUNDC1上的Tyr18位点，使其失活，进而FUNDC1介导的线粒体自噬被抑制，引起Caspase依赖的细胞凋亡的发生^[7]。因此在RIP3/FUNDC1信号通路凋亡通路中，RIP3将介导p¹⁸-FUNDC1表达上调。本研究在LPS诱导的小鼠AKI模型及LPS刺激的HK-2细胞中检测RIP3及p¹⁸-FUNDC1的表达水平发现，LPS诱导的AKI小鼠模型，肾组织中RIP3、p¹⁸-FUNDC1蛋白表达上调；LPS刺激下HK-2细胞中RIP3、p¹⁸-FUNDC1表达同样增加，提示RIP3、FUNDC1可能参与LPS诱导的细胞凋亡损伤过程。在体外进一步沉默RIP3后，LPS介导的RTEC凋亡显著减少，p¹⁸-FUNDC1蛋白表达减少，表明RIP3/FUNDC1信号通路可能参与介导RTEC凋亡。

中药单体丹参酮IIA是中药丹参的主要成分，其分子结构及相关药理学功效都较为明确，具有抗凋亡、清除氧自由基、抗炎、抗肿瘤等作用。前期研究观察到，丹参酮IIA具有潜在的肾脏保护效应^[28-30]，但目前还没有关于丹参酮IIA对保护脓毒血症AKI的效应及机制研究。本研究中，我们发现丹参酮IIA可减轻LPS诱导的RTEC凋亡损伤。我们首先证实了丹参酮IIA可下调LPS诱导的AKI小鼠肾组织中凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表达；还可减少TUNEL染色的阳性细胞数及下调HK-2细胞中蛋白Cleaved-caspase-3的表达。进一步，我们在体外模型中证实了丹参酮IIA的这一保护效应。

丹参酮IIA是通过什么机制减轻RTEC损伤？我们首次发现丹参酮IIA可下调RIP3的表达水平，并通过抑制RIP3/p¹⁸-FUNDC1信号通路改善RTEC凋亡水平。这为这种单体中医成分的肾保护提供了一种可能的机制假说。因此，我们提出丹参酮IIA一种新的RTEC保护途径。本研究不足之处，所选丹参酮IIA的剂量单一，对AKI的具体保护机制尚不清楚，故仍需进一步研究。

综上，丹参酮IIA可通过抑制RIP3/p¹⁸-FUNDC1信号通路来保护LPS诱导的RTEC损伤。丹参酮IIA作为中药丹参的主要活性成分，其现代药理作用丰富，毒副作用小，在临床中具有较好的应用价值。

Biography

张舒，博士研究生，E-mail: zhangshucherry@163.com

Funding Statement

市校（院）联合资助项目基础与应用基础研究项目（202201020322）