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########### Rat AEC expression analysis code in R #########################
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#To create eSet, need
# 1) Assay Data- file="GSE38570.txt"
# 2) phenoData- file="Table5-Meta data for rat AEC.csv"
# 3) featureData-file is downloable from reMoat website:
#  "Annotation_Illumina_Rat-RS-V1_rn4_V1.0.0_Aug09.csv"
# For limma, need "design table"
# 4) design data- file="Table6-LIMMA design matrix rat.txt"

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########### Load in packages ##############################################
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library(Biobase)
library(lumi)
library(limma)
library(genefilter)
library(org.Hs.eg.db)
library(heatmap.plus)
library(matlab)
library(biomaRt)
library(vsn)
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######## Load in sample data & check quality ##############################
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sampleFileRat="GSE38570.txt"
x.lumi.rat<-lumiR(sampleFileRat, lib="lumiRatAll")
x.lumi.rat<-addNuID2lumi(x.lumi.rat, lib.mapping="lumiRatIDMapping")
plot(x.lumi.rat, what="density")
plot(x.lumi.rat, what="boxplot", col=rainbow(15))
meanSdPlot(x.lumi.rat, main="meanSdPlot of raw rAEC")
plot(x.lumi.rat, what='sampleRelation')
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############ Attach phenoData #############################################
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pDatRat<-read.csv("Table5-Meta data for rat AEC.csv", header=T)
head(pDatRat)
rownames(pDatRat)=pDatRat$Sample
head(pDatRat)
mt=match(sampleNames(x.lumi.rat), rownames(pDatRat))
mt
phenoData(x.lumi.rat)=new("AnnotatedDataFrame", data=pDatRat[mt,])
pData(x.lumi.rat)
table(pData(x.lumi.rat)$Sample)
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##########Attach featureData ##############################################
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remRat<-read.csv("Annotation_Illumina_Rat-RS-V1_rn4_V1.0.0_Aug09.csv", header=T)
remRat[1:5,1:5]
remRat2<-remRat[!duplicated(remRat$Lumi_id),]
featureData(x.lumi.rat)<-new("AnnotatedDataFrame", data=remRat2)

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################ Attach Annotation package ################################
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annotation(x.lumi.rat) <- "lumiRatIDmapping"

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########### Raw P.Values ##################################################
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Rat<-read.table("Table6-LIMMA design matrix rat.txt", row.names=1, header=T, sep="\t")
matrixRat<-as.matrix(Rat)
class(matrixRat)
fit.raw.rAEC <- lmFit(x.lumi.rat, matrixRat)
contrasts_rAEC<- makeContrasts("D8-D0",levels=matrixRat)
fit_rAEC.raw<- contrasts.fit(fit.raw.rAEC, contrasts_rAEC)
fit.rAEC.eBayes<- eBayes(fit_rAEC.raw)
rAEC.raw.p.values<-fit.rAEC.eBayes$p.value
hist(rAEC.raw.p.values, col="lightblue")
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########## Normalization using VSN+0.5quantile#############################
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x.lumi.vsn.rat <- lumiN(x.lumi.rat, method='vsn', lts.quantile=0.5)
meanSdPlot(x.lumi.vsn.rat)
class(x.lumi.vsn.rat)
plot(x.lumi.vsn.rat, what="density")
plot(x.lumi.vsn.rat, what="boxplot", col=rainbow(15))
meanSdPlot(x.lumi.vsn.rat, main="meanSdPlot of VSN rAEC")
plot(x.lumi.vsn.rat, what='sampleRelation', main="Sample relation of normalized rAEC")
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################ Principal Component analysis #############################
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pc<-prcomp(t(exprs(x.lumi.rat)))
plot(pc, col="lightblue", main="Principal Component Analysis of rAEC")
pdat<-pData(x.lumi.rat)
dim(pdat)
cc<-ifelse(pdat$PREPDATE=="Round1", "purple", "hotpink")
cc<-ifelse(pdat$PREPDATE=="Round2", "magenta", cc)
do<-ifelse(pData(x.lumi.vsn.rat)$DAY=="D0", "D0", "D8")
do<-ifelse(pData(x.lumi.vsn.rat)$DAY=="D2", "D2", do)
do<-ifelse(pData(x.lumi.vsn.rat)$DAY=="D4", "D4", do)
do<-ifelse(pData(x.lumi.vsn.rat)$DAY=="D6", "D6", do)
table(do)
plot(pc$x, type="n", main="First two Principal components")
text(pc$x, do, cex=1.5, col=cc)

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##########Heatmap of preprocessed data#####################################
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lumi.nqz=nsFilter(x.lumi.vsn.rat,var.cutof=0.95,require.entrez=FALSE, remove.dupEntrez=FALSE)$eset
standardize=function(z){
  rowmed=apply(z,1,median)#
  rowmad=apply(z,1,mad)   #mad: median absolute deviation
  rv=sweep(z,1,rowmed)
  rv=sweep(rv,1,rowmad,"/")
  return(rv)
}
mye<-standardize(exprs(lumi.nqz.rat))
row.dist<-as.dist(1-cor(t(mye)))
col.dist<-as.dist(1-cor(mye))
ColhClust<-hclust(col.dist, method="average")
RowhClust<-hclust(row.dist, method="average")
dim(exprs(lumi.nqz.rat))

cc1<-ifelse(pData(lumi.nqz.rat)$PREPDATE=="Round1", "pink", "darkviolet")
cc1<-ifelse(pData(lumi.nqz.rat)$PREPDATE=="Round3", "deeppink4", cc1)
cc2<-ifelse(pData(lumi.nqz.rat)$DAY=="D0", "gray86", "black")
cc2<-ifelse(pData(lumi.nqz.rat)$DAY=="D2", "gray68", cc2)
cc2<-ifelse(pData(lumi.nqz.rat)$DAY=="D4", "gray54", cc2)
cc2<-ifelse(pData(lumi.nqz.rat)$DAY=="D6", "gray44", cc2)
cc.col<-matrix(as.character(c( cc1, cc2)), nrow=15, ncol=2)

hmp.dist<-heatmap.plus(mye, Colv=as.dendrogram(ColhClust), Rowv=as.dendrogram(RowhClust), col=jet.colors(64), ColSideColors=cc.col)
#The heatmap for D0 and D2 samples was spun around the dendrogram axis for publication in PLoS Genetics##

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##########################P values ########################################
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Rat_Design<-read.table("Table6-Limma_design_matrix_rat.txt", row.names=1, header=T, sep="\t")
Rat_Design_matrix<-as.matrix(Rat_Design)
class(Rat_Design_matrix)
fit_Rat <- lmFit(x.lumi.vsn.rat, Rat_Design_matrix)
contrasts_rAEC<- makeContrasts("D8-D0",levels=Rat_Design_matrix)
fit_rAEC<- contrasts.fit(fit_Rat, contrasts_rAEC)
fit.rAEC.eBayes<- eBayes(fit_rAEC)
rAEC.p.values<-fit.rAEC.eBayes$p.value
hist(rAEC.p.values, col="lightblue") #generates histogram of normalized pvalues

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############### Benjamini-Hotchburg adjustment of p-values ################
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adjpvalALLRat<-p.adjust(rAEC.p.values, method="BH")

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################ VOLCANO PLOT #############################################
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log10BH_rat<--log10(adjpvalALLRat)
coefficients_rat<-fit.rAEC.eBayes$coefficients
plot((coefficients_rat), (log10BH_rat), type="n",  xlab="Change in Gene Expression", ylab="-10logBH-pvalue", main="Mean Significant Gene Expression Changes rAEC TII-> TI",  cex=0.3)
points(coefficients_rat, log10BH_rat, col="black", cex=0.3, pch=19)
abline(h=1.3, lwd=3, col="black")
points(coefficients_rat[(coefficients_rat>0.3&log10BH_rat>1.3)], log10BH_rat[(coefficients_rat>0.3&log10BH_rat>1.3)], col='red', cex=0.5, pch=19)
points(coefficients_rat[(coefficients_rat< -0.3&log10BH_rat>1.3)], log10BH_rat[(coefficients_rat< -0.3&log10BH_rat>1.3)], col="forestgreen", cex=0.5, pch=19)

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###### creating a data table with all normalized rAEC data ################
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rat_data_matrix<-as.matrix(x.lumi.vsn.rat)
rat_data_pvalues<-cbind(rat_data_matrix, adjpvalALLRat)
write.csv(rat_data_pvalues, file="rAEC.expression.and.significance.csv")# This data table, when filtered for p<0.05 is what is included in Table 7.

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############ Correlating Entrez with human IDs ############################
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correlated_file<-read.csv("Table8-Rat and human ENTREZ correlated probe information.csv", header=T)
attach(correlated_file)
pval.change <- function(fold, pval) (ifelse( ((fold) >= 0), -1*log10(pval), log10(pval)))
rAEC_correlatePlot<-pval.change(coefficients.rat, BH-corrected.p-values.rat)
hAEC_correlatePlot<-pval.change(coefficients_human, BH-corrected.p.value.D8.D0.human)
plot(rAEC_correlatePlot, hAEC_correlatePlot, pch=19, cex=0.5, main="hAEC-rAEC correlation", xlab="rAEC Gene expression: log10-BHadj", ylab="hAEC Gene expression: log10-BHadj")
points(rAEC_correlatePlot[(rAEC_correlatePlot>1.3&hAEC_correlatePlot> 1.3)], hAEC_correlatePlot[(rAEC_correlatePlot>1.3&hAEC_correlatePlot> 1.3)],col="red", pch=19, cex=0.5)
points(rAEC_correlatePlot[(rAEC_correlatePlot< -1.3&hAEC_correlatePlot < -1.3)], hAEC_correlatePlot[(rAEC_correlatePlot< -1.3&hAEC_correlatePlot< -1.3)],col="forestgreen", pch=19, cex=0.5)
abline(v=-1.3, lty=2, col="gray29")
abline(v=1.3, lty=2, col="gray29")
abline(h=-1.3, lty=2, col="gray29")
abline(h=1.3, lty=2, col="gray29")
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############ Chi Squared Tests on rAEC-hAEC overlap #######################
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#Total Overlap
x=c(1514, 2148, 2459, 7052)
x=matrix(x, ncol=2)
chisq.test(x)

#Uprgulated overlap
x=c(778, 765, 1005, 1952)
x=matrix(x, ncol=2)
chisq.test(x)

#Downregulated Overlap
x=c(465, 707, 486, 2199)
x=matrix(x, ncol=2)
chisq.test(x)