Page 1 of 11 
Supplementary  
 
Supplementary Figure 1 TLC screening of leaf tissue of Nicotiana tabacum T0 events at vegetative 
stage as described in materials and methods. Lanes 42‐44 are wildtype controls which have relatively 
low TAG compared with the T0 transgenic event in lane 3 (described in this study). Page 2 of 11 
 
 
Supplementary Figure 2 Southern blot of transgenic Nicotiana tabacum leaf DNA with NPTII probe 
demonstrating  that  the T0  line  displaying  maximum TAG  levels was  a  single‐copy  event.  This was 
corroborated by the segregation pattern of subsequent generations. 
  Page 3 of 11 
 
Supplementary Figure 3 Expression analysis of fad3 and fad7 fatty acid desaturase genes in wildtype 
and transgenic T1 Nicotiana tabacum leaf tissue as quantified by qRT‐PCR. Error bars denote 
standard deviations (n=3). 
 
  Page 4 of 11 
 
Supplementary Figure 4 LC‐MS analysis of different phosphatidylcholine (a), diacylglycerol (b) and 
triacylglycerol (c) molecular species in wildtype and transgenic T1 Nicotiana tabacum leaf tissue. 
Error bars denote standard deviations (n=3). Page 5 of 11 
 
Supplementary Figure 5 GC analysis of cuticular wax composition on wildtype and T1 transgenic 
leaves. Alk, alkanes; Br Alk, branched alkanes; WE, wax esters; FA, fatty acids; Alc, fatty alcohols. 
Error bars denote standard deviations (n=3). 
  Page 6 of 11 
Supplementary Table 1 Representative triacylglycerol (TAG) and total fatty acid (TFA) levels (% dry weight) and fatty acid profiles in leaves of Nicotiana 
tabacum primary transformant #3 at the onset of senescence. A TLC chromatogram of this line is depicted in lane 3 of Supplementary Fig. 1. 
  C14:0 C16:0 IsoC16:1  C16:13  C16:9  C16:3 C18:0 C18:1 C18:111  C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C20:2 C20:3 C22:0 C24:0  %  
TAG  0.1  28.6 0.4  0.0  1.6 0.2 4.1 25.8 1.0 24.3  9.8 2.0 0.0 0.1 0.0 1.1 1.0 17.3 
TFA  0.1  26.6 0.0  0.6  1.6 0.3 3.8 25.6 1.1 25.2  11.0 1.8 0.3 0.1 0.0 1.0 0.8 23.4 
  Page 7 of 11 
Supplementary Table 2 Triacylglycerol content (% seed weight) and fatty acid profile in wildtype (WT) and pooled seed from a representative T1 transgenic 
Nicotiana tabacum event. 
  C14:0 C16:0  C16:9  C18:0 C18:1 C18:111  C18:2 C18:3  C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 %  
WT  0.0  9.8  0.1  3.3  11.1  0.7  74.2  0.4  0.2  0.1  0.0  0.1  0.0  35.5 
Transgenic  0.0  9.9  0.1  3.5  16.4  0.7  68.2  0.4  0.4  0.1  0.0  0.2  0.1  37.2 
  Page 8 of 11 
Supplementary Table 3 Total fatty acid levels (% dry weight) and fatty acid profile in wildtype (WT) and T1 transgenic Nicotiana tabacum senescing leaf 
tissue at the onset of senescence. Error bars represent standard deviations (n ≥ 3). 
  C14:0 C16:0  C16:9  C16:3  C18:0  C18:1 C18:111  C18:2  C18:3 C20:0 C20:1  C22:0  C24:0  % 
WT  0.8 ± 0.2 18.2 ± 0.7  3.6 ± 0.5 1.8 ± 0.2 6.1 ± 0.5 3.3 ± 0.5 0.6 ± 0.1 14.8 ± 1.0  46.4 ± 3.8 1.2 ± 0.3 1.5 ± 0.4 1.1 ± 0.2 0.5 ± 0.1 0.8 ± 0.0 
Transgenic  0.1 ± 0.0 25.3 ± 1.4  2.3 ± 0.1 0.2 ± 0.0 3.8 ± 0.2 29.6 ± 3.8 1.3 ± 0.1 25.4 ± 1.7  8.1 ± 1.0 1.7 ± 0.1 0.3 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.8 ± 0.1 17.7 ± 0.7 
 
  Page 9 of 11 
Supplementary Table 4 MS/MS (Q‐TOF) identification of major triacylglycerols (TAG) and diacylglycerol (DAG) molecular species in wildtype and T1 
transgenic Nicotiana tabacum leaf tissue. 
Molecular species  Wildtype  Transgenic 
  Major component  Major component  Minor component 
TAG  
50:1 C16:0/C16:0/C18:1  
50:2 C16:0/C16:0/C18:2  C16:0/C16:1/C18:1 
50:3 C16:0/C16:0/C18:3  C16:0/C16:1/C18:2 
52:1 C16:0/C18:0/C18:1
52:2  C16:0/C18:1/C18:1  C16:0/C18:1/C18:1  
52:3  C16:0/C18:1/C18:2
52:4 C16:0/C18:2/C18:2  C16:0/C18:1/C18:3 
52:5 C16:0/C18:2/C18:3
52:7  C16:3/C18:1/C18:3  C16:3/C18:1/C18:3  C16:1/C18:3/C18:3 
54:2 C18:0/C18:1/C18:1  
54:3 C18:0/C18:1/C18:2  C18:1/C18:1/C18:1 
54:4  C18:1/C18:1/C18:2  C18:0/C18:1/C18:3 
C18:0/C18:2/C18:2 
54:5 C18:1/C18:1/C18:3 
C18:1/C18:2/C18:2 
C18:0/C18:2/C18:3 
54:6 C18:2/C18:2/C18:2  C18:1/C18:2/C18:3 
54:7 C18:2/C18:2/C18:3  C18:1/C18:3/C18:3 
DAG  
34:1 C16:0/C18:1  
34:2 C16:0/C18:2
36:2 C18:1/C18:1
36:3 C18:1/C18:2
36:4  C18:2/C18:2  C18:2/C18:2 
C18:1/C18:3 
 
36:5  C18:2/C18:3  C18:2/C18:3  
36:6  C18:3/C18:3Page 10 of 11 
Supplementary Table 5 Triacylglycerol (TAG) levels (% dry weight) and TAG fatty acid profile in stem and root tissues of wildtype (WT) and T1 transgenic 
Nicotiana tabacum line. Error bars represent standard deviations (n=2, wildtype; N=3, transgenic). 
Plant  Tissue  C14:0  C16:0  C16:1  C18:0  C18:1  C18:111  C18:2  C18:3  C20:0  C20:1  C20:2  C22:1  C24:0  C24:1  % 
WT  Young 
stem 
0.0  15.8 ± 3.6  0.4 ± 0.6  5.0 ± 0.3  11.3 ± 9.2  0.4 ± 0.5  34.8 ± 4.7  31.3 ± 
10.4 
0.6 ± 0.9  0.0  0.0  0.0  0.4 ± 0.6  0.0  0.0 
Transgenic  Young 
stem 
0.2 ± 0.0  26.5 ± 1.2  1.7 ± 0.2  3.7 ± 0.1  19.6 ± 1.1  1.5 ± 0.0  36.1 ± 0.5  5.8 ± 0.1  1.7 ± 0.0  0.3 ± 0.0  0.4 ± 0.0  1.1 ± 0.0  0.0  1.3 ± 0.1  0.8 ± 0.1 
WT  Mature 
stem 
0.0  8.0 ± 0.7  0.0  3.2 ± 0.1  2.3 ± 0.3  0.0  44.0 ± 1.0  42.4 ± 2.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.1 ± 0.0 
Transgenic  Mature 
stem 
0.1 ± 0.0  28.7 ± 0.2  2.4 ± 0.0  3.4 ± 0.0  21.1 ± 0.8  1.7 ± 0.0  33.9 ± 0.4  4.6 ± 0.1  1.5 ± 0.0  0.3 ± 0.0  0.3 ± 0.0  1.0 ± 0.0  0.0  1.1 ± 0.0  1.1 ± 0.1 
WT  Root  0.3 ± 0.3  8.2 ± 0.7  1.4 ± 0.2  2.3 ± 0.5  3.8 ± 0.5  0.3 ± 0.3  62.2 ± 1.5  21.3 ± 0.9  0.0  0.2 ± 0.4  0.0  0.0  0.0  0.0  0.2 ± 0.1 
Transgenic  Root  0.1 ± 0.0  21.5 ± 1.0  0.5 ± 0.0  4.4 ± 0.0  13.9 ± 0.8  0.5 ± 0.0  47.3 ± 1.1  5.3 ± 0.4  2.2 ± 0.1  0.3 ± 0.0  0.7 ± 0.1  1.8 ± 0.1  0.0  1.5 ± 0.1  1.4 ± 0.2 
  Page 11 of 11 
Supplementary Table 6 Cuticular wax content (g/cm2) and composition (% each molecular class) on the surface of wildtype (WT) and T1 transgenic 
Nicotiana tabacum leaves. Error bars represent standard deviations (n=3). 
  Alkanes  Branched alkanes  Fatty acids  Fatty alcohols  Wax esters  Wax content 
WT  35.3  38.2  25.2  1.1  0.3  12.3 ± 2.3 
Transgenic  43.0  30.7  25.1  0.9  0.3  8.1 ± 0.7