CCR3基因在呼吸道过敏性疾病中对相关炎性细胞的作用研究

呼吸道过敏性疾病主要包括变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)和哮喘(allergic asthma，AA)，AA主要特征为气道炎症、可逆性气道阻塞和气道高反应性，AR的特征是气道高反应性、鼻黏膜肿胀、血管通透性增强、有大量清水样分泌物，上下气道的同一性使AR与AA的发病密切相关。据资料统计，全球儿童AR的发病率为2%~25%，成人为10%~40%^[1]。过敏性炎症由环境和基因共同作用导致，CC趋化因子受体3(CC chemokine receptor 3，CCR3)在肥大细胞(mast cell，MC)、嗜酸粒细胞(eosinophils，Eos)、嗜碱粒细胞(basophils，Bas)、2型T辅助细胞(T helper 2 cell，Th2细胞)等相关炎性细胞均有表达^[2-3]，并产生作用，为过敏反应提供炎性递质，上述炎性细胞在气道浸润并脱颗粒，释放相关细胞因子及炎性递质从而诱发过敏反应^[4]。然而，CCR3与这些相关呼吸道过敏的炎性细胞的作用机制及相关作用过程，目前仍未完全明确。因此，本文在查阅文献的基础上，对此做一综述，以期更好地了解靶基因CCR3在呼吸道过敏性疾病中的作用。

1. CCR3基因结构与功能

CCR3基因的cDNA长为1.6 kb，位于3P21，最早称为CC CKR3，主要在Eos、Bas、MC、Th2细胞、调节性T细胞及气道上皮细胞均有表达，是一种七次跨膜转运的G蛋白偶联受体，由胞外N-末端、7个跨膜α螺旋(TM核心)、胞内C-末端、3个胞内环和胞外环组成。以往研究认为CCR3表达局限于Eos的细胞表面及MC内的颗粒中，近年的实验研究发现CCR3主要位于细胞质中，可能是因为CCR3无信号肽的牵引作用，所以很难存在于细胞膜上，于是大量堆积在内质网等细胞的内膜系统中，但是表达在细胞质的CCR3仍然具有结合其特异性配体的生物活性^[5-7]。

CCR3可与多种趋化因子结合，如Eotaxin-1(CCL11)、Eotaxin-2(CCL24)、Eotaxin-3(CCL26)等，竞争性结合结果显示CCR3对CCL11亲和力最大，解离常数Kd仅为0.1 nM^[6]。当趋化因子与细胞膜表面CCR3的N端以及胞外环结合后(可能涉及氢键、离子对)，诱发CCR3变构及磷酸化，活化磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷脂酶A2、蛋白激酶C，通过升高细胞内钙离子浓度从而活化相应离子通道并激活转录激活蛋白，将胞外信号递至胞内，完成信号传递，而后诱导相关炎性细胞向受累器官迁移，且骨髓中相应炎性细胞祖细胞持续增殖分化，导致相关炎性细胞向炎症部位聚集、脱颗粒并产生炎性蛋白，此过程是AA、AR等呼吸道过敏性疾病发病的重要环节。

研究发现，敲除CCR3基因可减少小鼠鼻黏膜炎性细胞浸润、Eos脱颗粒和IgE的表达，并增加Th1细胞分泌的IL-10和IFN-γ等抗炎因子的表达^[8]。除此之外，CCR3拮抗剂可通过阻断Eotaxin对M2毒蕈碱受体的作用从而逆转气道高反应性，体内应用CCR3抑制剂AXP1275也可明显减少由Eotaxin-1诱导的钙离子动员，并降低Eos向效应器官的趋化^[9-10]。

2. CCR3与相关炎性细胞在呼吸道过敏性疾病中的作用

2.1. CCR3与Eos

Eos是呼吸道过敏性疾病中主要的效应细胞，一般认为IL-5对Eos起主要活化作用。骨髓中Eos离开骨髓后不再增殖，在局部微环境的生长因子及活化因子的作用下分化成熟，通过滚动、黏附、渗出、与内皮细胞相互作用及在整合素、黏附分子及趋化因子浓度梯度的选择作用下迁移到局部炎症组织。Eos通过脱颗粒释放Eos主要碱性蛋白可破坏细胞膜磷脂双分子层的完整性从而损伤气道上皮，导致气道高反应性；Eos过氧化物酶可通过产生氧自由基而损害正常细胞；Eos阳离子蛋白则通过调节细胞内渗透压破坏细胞完整性^[11-12]。另外，Eos可通过合成白三烯诱发剧烈的气道收缩。在小鼠体内实验中，缺乏LTC4合成酶导致气道Eos浸润减少并降低气道高反应性，说明由Eos合成分泌的炎性递质有助于气道过敏反应的发生^[13]。

研究表明，减少Eos脱颗粒可降低AA小鼠的气道高反应性并减少气道炎症；IL-5可通过聚集Eos，并延缓Eos的凋亡，使得Eos迁移并浸润至肺部；Eos参与组织修复和重塑，也可诱导组织损伤，此时Eos既是组织学改变，也是炎性病理变化的主要效应细胞^[14]。

CCR3最早在Eos发现，随后在MC、Bas和Th2细胞上也发现CCR3的表达^[15]，Eos和MC是AR和AA的发生发展中关键的效应细胞。Eos在炎症部位浸润并通过脱颗粒释放细胞因子，使气道上皮细胞屏障受到破坏，促进杯状细胞分泌黏液并增加血管通透性及气道高反应性。CCR3主要通过与自分泌的Eotaxin结合介导特异性抗原刺激诱发Eos原位造血，并诱导CD34⁺CD38⁺IL-3Rα⁺CD45RA^-IL5Rα⁺祖细胞向Eos分化并向炎症部位迁移浸润，导致气道Eos聚集活化。相关研究推测Eotaxin对Eos表面受体CCR3的激活是通过两步经典的步骤发生，即Eotaxin核心氨基酸残基被CCR3的N末端修饰后传递给Eos的细胞外环引起CCR3构象改变，导致细胞内G蛋白募集并激活细胞内信号传导，突变的CCR3胞外区与Eotaxin的亲和力下降，引起细胞脱颗粒。Eos通过4种途径将储存在胞内颗粒中细胞因子分泌至胞外：①经典的胞吐作用：细胞内颗粒与质膜融合，引起单个颗粒内容物的批量释放；②复合胞吐作用：多个细胞内颗粒在与细胞膜融合之前彼此聚集融合，同时释放多个颗粒内容物；③零碎脱颗粒(PMD)：通过囊泡逐渐分泌颗粒中预先储存的细胞因子；④细胞溶解：Eos通过一种独特的细胞死亡模式将完整的颗粒直接沉积到组织中，人体内主要以后两种为主^[16]。CCR3/Eotaxin途径可快速调动预先存储在Eos中的细胞因子(如IL-4)，从而促进机体Th2免疫反应，使Eos发生脱颗粒，引起相关临床症状。在Eos性肠胃炎中，抗CCR3抗体可通过减少外周血和肠黏膜中的Eos数量，降低Eos性炎症，减少肠黏膜损伤及腹泻^[17]。

2.2. CCR3与MC

MC以其祖细胞在血液中循环，Eotaxin-1、SCF与IL-3协同加速MC祖细胞分化成熟、存活和趋化，进入不同的组织后在局部生长因子的刺激下发育成熟。MC主要分布于皮肤、黏膜及内脏器官，利于其发挥作为“哨兵”的作用^[18]，其胞质内含高电子密度的溶酶体分泌颗粒，这些颗粒内布满大量的预制细胞因子，如组胺、类胰蛋白酶、β己糖胺酶及前列腺素D2，脱颗粒时，这些化合物释放到外环境中影响电生理活动，引起过敏反应^[19]。

MC脱颗粒起因于钙内流调节和钙信号通路的激活，通过PMD或过敏机制发生。此外，MC还通过组成型和调节性胞吐作用释放花生四烯酸衍生物LTC4和PGD2并释放从头合成的磷脂酶A2。接触过敏原后，MC与Fc受体(免疫球蛋白Fc部分c末端受体，FcRs)特异性结合，使上皮细胞分泌IL-33、IL-25和胸腺基质淋巴细胞生成素，进而增强2型固有淋巴细胞(ILC2)、Bas和MC的功能导致呼吸道过敏性疾病发生。其中，IL-33通过增加预先存储的炎性递质的量、诱导细胞因子的产生并增加由抗原或IgE刺激诱导的脱颗粒促进MC成熟。MC脱颗粒时，在类胰蛋白酶的作用下，激肽原产生缓激肽增加血管通透性，降解细胞外基质促进细胞迁移、诱导细胞募集和活化。此外类胰蛋白酶对晚期过敏反应中性粒细胞和Eos还具有特殊的趋化作用，并促使单核细胞和巨噬细胞活化，刺激成纤维细胞增殖和胶原合成，促进组织修复和复原^[20]。

一般认为MC介导早期过敏反应，但也通过与局部浸润的Eos的相互作用参与过敏反应晚期和持续期阶段。接触过敏原后，MC表达功能性FcεRI，并同时释放预先形成的组胺和Th2细胞因子，增强IgE介导的脱颗粒并增加Eotaxin-1的表达。成熟的Eotaxin包含23个残基组成的信号肽分子，其N端有2个并列的丝氨酸残基，使得它可与CCR3受体特异性定向结合，且人MC祖细胞表达的趋化因子受体中只有CCR3在肥大细胞成熟时仍保留。

CCR3与Eotaxin-1特异性结合后激活CCR3，活化的鸟苷三磷酸结合Gαi和Gβγ二聚体后从CCR3解离，然后激活FcεRI，而FcεRI的四聚体(αβγ2)在速发相过敏反应中起关键作用，其中它的α亚单位与IgE结合激活Lyn激酶，磷酸化位于β链和γ链上的免疫受体酪氨酸基激活基序，促进结合并激活脾酪氨酸激酶，引起所传递的信号增强；β亚单位调节受体表达和信号传导，γ亚单位则通过二硫键形成同二聚体，且游离的FcεRI也可结合血清中的IgE。此外，在脾酪氨酸激酶结合后，有丝分裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C和磷脂酶Cγ的活化会使环磷酸腺苷升高，从而介导MC颗粒膜蛋白的磷酸化并改变其通透性使颗粒和质膜融合，然后释放颗粒内容物。在CCR3作用下，激活的FcεRI与IgE的高亲和力结合及缓慢解离的特点是MC持续致敏和对过敏原易感的基础，且CCR3激活的这些信号通路是过敏反应关键调控通路的一部分。因此，阻断这些相互作用可能是阻止MC激活的最有效方法^[21]。有研究发现，通过构建CCR3短发夹RNA慢病毒载体对小鼠MC的CCR3进行基因干扰，发现小鼠MC的CCR3基因在mRNA和蛋白水平下降，证明沉默CCR3基因可影响MC中CCR3基因表达，并对卵清蛋白构建AR小鼠模型的MC功能产生抑制作用^[22]。

2.3. CCR3与Th2细胞

Th1/Th2免疫反应失衡(Th1免疫反应减弱、Th2免疫反应加剧、Th2细胞分泌IL-4抑制Th1细胞分化)是过敏性疾病发病的理论基础。Th2细胞起源于T淋巴细胞，其分泌的细胞因子(如IL-4，IL-5、IL-9和IL-13)刺激B细胞产生特异性IgE，并诱导MC和Eos的迁移、活化，这3种细胞是过敏性疾病发病机制中的重要效应细胞。转录因子T-bet是Th1特异性的转录因子，能阻断或抑制Th2细胞的分化；而转录因子GATA-3(GATA-binding protein-3)通过诱导Th2细胞因子基因表达，促进Th2细胞的分化成熟。CCR3在Th2细胞亦有表达^[23]，IL-5通过促进Eos生长、分化、趋化从而激活Eos，IL-4和IL-13通过上调血管内皮细胞中的细胞黏附分子的表达影响Eos的迁移。亦有研究表明：Th2细胞通过介导肺中CCR3相关活性趋化因子的产生从而导致哮喘中Eos性炎症的发病^[24]。

2.4. CCR3与Bas

Bas在人体和小鼠中含量不到1%，是过敏反应的原发效应细胞，主动参与宿主的过敏反应^[25]。过敏性炎症的病理生理学过程一般分为两个阶段：①致敏阶段，当机体第一次接触变应原时，Th0细胞接触到树突状细胞提呈的变应原后分化为Th2细胞，通过产生IL-4和IL-13诱导B细胞分化产生抗原特异性IgE，IgE及其特异性高亲和力受体FcεRI在MC、Bas表面结合，形成致敏的MC和Bas，此时易感人群一般无临床症状，而健康人则处于免疫耐受状态；②效应阶段，当机体再次接触同种变应原时，过敏原直接与致敏的MC和Bas细胞膜上的受体FcεRI结合、交联两个相邻的IgE，激活下游信号通路，诱发瀑布式级联反应，MC和Bas开始脱颗粒，释放细胞溶质颗粒内预先形成的血管活性递质类胰蛋白酶、组胺、LTC4、PGD2等，从而引起过敏性炎症的临床表现^[26]。

Bas与组织驻留的MC有共同特征，如细胞质中含有嗜碱性颗粒且细胞表面表达FcεRI，故以往一直认为Bas与MC功能相似。IL-3是Bas生存的关键细胞因子，通过与嗜碱粒细胞因子受体共同γ-链(fcr-γ)的相互作用，诱导Bas产生IL-4，从而导致Eos浸润。在小鼠刺激性接触性皮炎模型中证实Bas与成纤维细胞合作诱导Eos向皮肤募集，其过程包括Bas分泌IL-4和TNF-α，然后刺激成纤维细胞分泌Eotaxin-1和RANTES(CCL5)，最后引起Eos向效应器官皮肤的迁移^[27]。在IgE依赖性皮肤炎症模型中，Bas通过生成IL-4，增加血管细胞黏附分子-1的表达，从而促进Eos迁移；在木瓜蛋白酶诱导的哮喘模型中，Bas生成的IL-4刺激肺中ILC2s分泌IL-5，IL-13和Eotaxin-1，导致Eos的迁移；特异性敲除Bas IL-4基因的小鼠也减少了内皮细胞VCAM-1和ILC2分泌的细胞因子的表达，且减少了相应效应器官(如皮肤、肺)中Eos的聚集^[28-29]。CCR3在静息的Bas中高表达，但在Bas活化后CCR3含量显著下降，其可能原因是任何结合CCR3的CC趋化因子的制备都可能导致Bas对表面的CCR3进行内化^[25]，活化的Bas是否发生过脱颗粒未可知，但经历过脱颗粒的Bas肯定是被激活的^[26]。因此，对CCR3在呼吸道过敏性疾病中与Bas的相互作用可能是未来引导治疗呼吸道过敏性疾病的又一新方向。

3. 结语

本文通过综合分析近年来CCR3基因在呼吸道过敏性疾病中对相应效应细胞的作用研究文献，发现目前CCR3基因对Eos、MC和Th2细胞在呼吸道过敏性疾病中的作用已取得进一步的研究进展；CCR3基因作为起始环节直接或间接调控Eos和MC的分化、成熟、活化和脱颗粒过程，Th2细胞在其中间环节产生作用，它通过分泌相应炎性递质和细胞因子，介导下一步级联反应的发生。此外，Bas与MC结构和功能相似，在呼吸道过敏性疾病中也具有重要作用。因此，对CCR3在呼吸道过敏性疾病中与相关炎性细胞的相互作用做进一步深入细致的研究，可更好地了解CCR3作为靶基因在呼吸道过敏性疾病中的作用机制，从而为拓展其在呼吸道过敏性疾病中的临床应用打下更深厚的理论基础。

Funding Statement

国家自然科学基金项目(No：81860184)；江西省优势科技创新团队专项计划(No：S2016RCTDB0016)；江西省卫生厅项目计划(No：20155338)