31例新生儿筛查阴性的先天性甲状腺功能减退症患儿临床特点及转归

Abstract

目的：

探讨新生儿筛查阴性的先天性甲状腺功能减退症（CH）患儿的临床特点及转归。

方法：

回顾性分析2015年2月至2022年2月广州市妇女儿童医疗中心确诊的31例筛查阴性CH患儿的临床、实验室资料，其中17例进行了全外显子组高通量测序基因分析。

结果：

31例CH患儿中，早产儿19例（61.3%），足月儿12例（38.7%），胎龄36（26~40）周，出生体重2.35（0.75~3.70）kg，诊断年龄20 d（7 d~4岁），初筛干血斑促甲状腺素4.18（0.34~8.97）mU/L。同性别双胎儿9例（29.0%），有甲状腺功能减退家族史4例（12.9%）。首发症状为体重增长缓慢11例（35.5%），黄疸消退延迟7例（22.6%），矮小症、腹胀伴脐疝、胎儿水肿、甲状腺肿各1例（3.2%）。17例患儿全外显子组测序结果显示，10例检出 DUOX2基因突变（携带双位点突变6例，携带单位点突变4例），其中3例伴甲状腺功能减退家族史。22例进行了诊断再评估，其中17例（77.3%）为暂时性CH，5例（22.7%）为永久性CH。10例 DUOX2基因突变患儿中，6例为暂时性CH，1例为永久性CH，3例（均为3岁以下）仍在治疗中。

结论：

CH筛查假阴性多见于早产、低出生体重、同性别双胎、有甲状腺功能减退家族史患儿， DUOX2基因突变是常见的分子生物学发病基础，多数患儿为暂时性CH。对不明原因生长缓慢、黄疸消退延迟患儿应及时进行甲状腺功能评估，以便早期诊断。

先天性甲状腺功能减退症（congenital hypothyroidism，CH）;血清促甲状腺素（serum thyrotropin，sTSH）;游离甲状腺素（free thyroxine，FT）;干血斑促甲状腺素（dry blood spot thyrotropin，bsTSH）;双氧化酶（dual oxidase，DUOX）;DUOX成熟因子（DUOX maturation factor，DUOXA）;甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）;甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）;促甲状腺激素受体（thyrotropin receptor，TSHR）;

CH是由于甲状腺分化、迁移、发育异常或参与甲状腺素合成的基因缺陷而导致的甲状腺素合成不足，是导致儿童智力及体格发育落后最常见的儿童内分泌疾病，早期诊断、及时治疗可避免永久性神经系统损伤。新生儿筛查是早期发现CH患儿的重要措施，但由于个体差异，少数CH患儿在新生儿筛查时呈现为假阴性，未能早期诊断 ^[1] 。本研究对广州市妇女儿童医疗中心发现的31例新生儿筛查阴性的CH患儿进行回顾性分析，总结其临床特点、转归及遗传学特点，以期提高临床医生的认识，避免诊断延误。

对象与方法

对　象

2015年2月至2022年2月广州市妇女儿童医疗中心共发现31例新生儿筛查阴性（均在广州市新生儿筛查中心进行CH筛查）的CH患儿，其中男性16例，女性15例，诊断年龄为20 d（7 d~4岁）。CH的诊断满足下列三项中的两项：①sTSH不低于15 mU/L（正常值：小于30 d新生儿为0.47~10.00 mU/L，1月龄及以上为0.36~7.00 mU/L；②FT ₄低于15 pmol/L（正常值：小于30 d新生儿为12.00~29.34 pmol/L，1月龄及以上为13.17~22.33 pmol/L；③甲状腺超声异常 ^{[ 2- 3]} 。本研究通过广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会审查（穗妇儿2022第048A01号），患儿父母均知情同意，并签署知情同意书。

仪器及试剂

全自动时间分辨荧光免疫分析仪Wallac AutoDELFIA1235 Automatic Immunoassay System、全自动打孔仪Panthera-Puncher 9及促甲状腺素检测试剂盒均为美国PerkinElmer公司产品。

CH筛查及诊断再评估

按照《先天性甲状腺功能减低症诊疗共识》 ^[4] 实施新生儿筛查、诊断和治疗。采集出生后3~7 d新生儿足跟血，制成干血斑送至广州市新生儿筛查中心集中检测。采用时间分辨荧光免疫分析法测定bsTSH水平，bsTSH不低于9 mU/L为筛查阳性，由筛查中心负责召回、诊断及治疗。关注同性别双胎、早产儿CH筛查阴性新生儿的甲状腺功能情况，对同性别双胎之一为筛查阳性者，同时召回筛查阴性同胞。CH确诊患儿接受左甲状腺素替代治疗，2~3岁时试停药1个月后进行诊断再评估，复查sTSH、FT ₄水平正常者判定为暂时性CH，sTSH不低于7 mU/L或FT ₄低于15 pmol/L为永久性CH，并继续给予左甲状腺素替代治疗 ^{[ 2- 3]} 。

高通量测序检测基因突变

干血斑进行全外显子组测序，重点关注CH相关基因，如 DUOX2、 DUOXA2、 TPO、 TG、 TSHR等，参考美国医学遗传学与基因组学学会联合分子病理协会在2015年提出的“序列变异解读标准和指南” ^[5] 以及PubMed数据库、人类基因突变数据库、千人基因组（1000 Genomes）数据库及ClinVar数据库明确突变位点的致病性，对携带已知致病和可能致病突变基因的患儿，采用Sanger测序法进行位点验证及父母验证。

统计学方法

应用SPSS 26.0软件进行数据处理，正态分布的计量资料以均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，非正态分布的计量资料采用中位数（范围）[ M（min~max）]表示；计数资料采用例数（百分率）[ n（%）]表示。采用Mann-Whiteney  U检验进行非正态分布计量资料的组间比较，采用Fisher确切概率法进行计数资料的组间比较， P<0.05为差异有统计学意义。

结　果

患儿临床表现

31例新生儿筛查阴性的CH患儿中，早产儿19例（61.3%），足月儿12例（38.7%），胎龄为36（26~40）周，体重为2.35（0.75~3.70）kg，bsTSH为4.18（0.34~8.97）mU/L，确诊时sTSH为41.8（9.6~>150.0）mU/L，FT ₄为11.0（4.3~18.9）pmol/L，左甲状腺素维持剂量为12.5（6.3~37.5）μg。19例患儿进行血TG检测，中位数为73.2 μg/L（正常值：3.5~77.0 μg/L）；27例（83.9%）进行了甲状腺超声检查，其中12例甲状腺增大，15例未见异常。见 表1。

表 1 31例新生儿筛查阴性的CH患儿临床特征及外显子测序结果

Table 1 Clinical features and whole exome sequencing results of 31 children with CH missed by neonatal screening

例序	性别	胎龄 （周）	出生体重（kg）	bsTSH （mU/L）	诊断年龄	sTSH （mU/L）	FT 4 （pmol/L）	TG （μg/L）	甲状腺超声检查	药物维持剂量（μg/d）	转归	DUOX2基因
1	男	28	0.75	2.70	27 d	>150.0	5.5	—	正常	12.5	6月龄夭折	—
2	男	28	0.65	1.60	29 d	15.1	14.8	—	正常	12.5	暂时性CH	—
3	男	34	2.35	2.90	10 d	75.0	7.5	59.0	增大	12.5	暂时性CH	p.Ser199TrpfsX122/p.Arg683Leu
4	男	34	2.40	1.67	13 d	85.0	6.8	73.2	增大	12.5	暂时性CH	p.Ser199TrpfsX122/p.Arg683Leu
5	男	28	1.31	0.34	12 d	89.4	5.4	101.3	—	10.0	暂时性CH	—
6	女	34	1.35	5.90	20 d	28.0	8.7	—	增大	12.5	暂时性CH	—
7	女	36	2.15	5.27	43 d	10.1	14.9	82.0	增大	12.5	永久性CH	p.Ile1130Phe #
8	女	36	2.25	6.82	18 d	51.6	11.2	369.3	增大	25.0	暂时性CH	—
9	女	38	3.10	4.31	19 d	36.4	14.9	118.0	增大	12.5	暂时性CH	—
10	女	26	0.80	2.69	31 d	61.8	6.9	—	正常	12.5	2月龄夭折	—
11	男	26	1.01	2.65	21 d	18.8	13.3	—	正常	6.3	暂时性CH	—
12	女	27	1.18	3.12	15 d	127.3	4.3	—	—	12.5	治疗中	—
13	男	30	1.40	2.91	24 d	31.3	12.4	81.7	正常	12.5	暂时性CH	p.Tyr1450His/ p.Gly702del
14	女	32	2.12	4.05	14 d	>150.0	5.7	—	—	25.0	治疗中	—
15	女	32	1.85	3.29	33 d	90.9	18.9	135.0	增大	10.0	暂时性CH	未见异常
16	男	34	2.58	5.05	7 d	16.5	14.5	—	正常	25.0	暂时性CH	未见异常
17	男	34	3.38	3.65	18 d	>150.0	6.3	—	—	37.5	50 d夭折	—
18	男	35	2.48	3.46	27 d	56.5	10.6	66.1	正常	12.5	暂时性CH	未见异常
19	女	36	2.30	7.50	60 d	34.2	11.9	107.0	正常	25.0	永久性CH	—
20 *	男	36	2.70	6.83	15 d	>150.0	8.5	67.0	增大	17.0	暂时性CH	p.Lys530X/p.Ala649Glu
21	女	38	2.07	7.05	9 d	37.0	15.9	62.7	增大	25.0	暂时性CH	未见异常
22 *	女	38	2.24	8.97	9 d	33.6	14.9	24.5	正常	12.5	治疗中	p.Arg434X
23	男	38	3.25	8.72	15 d	86.0	7.0	9.3	正常	12.5	治疗中	未见异常
24	男	39	3.20	4.07	22 d	23.0	13.1	67.7	正常	12.5	治疗中	p.Lys530X/p.Arg885Leu
25	男	39	3.70	5.54	27 d	51.8	10.3	—	增大	12.5	治疗中	p.Ser1349Cys
26	男	39	2.48	5.25	15 d	41.8	13.7	639.0	正常	37.5	永久性CH	未见异常
27	女	39	2.90	4.18	2岁半	37.0	8.8	—	增大	37.5	永久性CH	—
28	男	40	3.29	8.27	13 d	31.6	14.4	34.2	正常	12.5	暂时性CH	—
29	女	40	2.85	4.02	21 d	89.3	9.4	999.4	正常	17.0	暂时性CH	p.Glu879Lys
30 *	女	40	3.18	8.79	60 d	9.7	11.1	—	增大	25.0	暂时性CH	p.Arg683Leu/p.Lys530X
31 *	女	39	3.20	8.86	4岁	15.4	17.3	17.0	正常	37.5	永久性CH	未见异常

—：未检测. ^*有CH家族史； ^#新突变.例1~9为同性别双胎，例1/例2、例3/例4为两对双胎. CH：先天性甲状腺功能减退症；bsTSH：干血斑促甲状腺素；sTSH：血清促甲状腺素；FT ₄：游离甲状腺素；TG：甲状腺球蛋白；DUOX：双氧化酶.

双胎9例（例1~9，29.0%）分别来自7个家庭，均为同性别双胎，除例9为足月双胎外，其余均为早产双胎。例1/例2、例3/例4为两对双胎，例5同胞筛查真阴性，例6~9同胞筛查真阳性。根据患儿出生体重及胎龄分析，小于胎龄儿9例（其中双胎早产儿5例，单胎早产儿1例，足月小于胎龄儿3例），大于胎龄儿1例，适于胎龄儿21例。4例（3例为足月儿）患儿有甲状腺功能减退家族史，其中母亲孕期甲状腺功能减退症2例（例22、例30），同胞CH病史2例（例20、例31）。31例患儿中，主要首发症状为体重增长缓慢11例（35.5%）、黄疸消退延迟7例（22.6%）、腹胀伴脐疝1例（3.2%，例19）、胎儿水肿1例（3.2%，例17）、矮小症1例（3.2%，例31）、幼儿期甲状腺肿1例（3.2%，例27），另外9例无明显临床表现患儿因同胞筛查阳性或有家族史或早产而于出生后1个月内诊断。

上述结果提示，CH筛查假阴性多见于早产、低出生体重、同性别双胎、有甲状腺功能减退家族史患儿。

基因突变检测结果

17例患儿进行了全外显子组测序，10例检出 DUOX2基因突变，包括双位点突变6例（例3、例4、例13、例20、例24、例30），单位点突变4例（例7、例22、例25、例29）；共检出11种 DUOX2基因突变位点，其中p.Ile1130Phe为新发可能致病突变，见 表1。 DUOX2突变组与无 DUOX2突变组以及 DUOX2双位点突变患儿与单位点突变患儿的bsTSH、sTSH、FT ₄水平差异均无统计学意义（均 P>0.05），见表 2。17例患儿均未见 DUOXA2、 TPO、 TG、 TSHR等CH相关基因异常，提示 DUOX2基因缺陷是本组CH患儿患病的主要遗传学基础。

表 2 有无携带 DUOX2突变的先天性甲状腺功能减退症患儿生化指标检测结果比较

Table 2 Biochemical features of congenital hypothyroidism patients with or without DUOX2 mutations

组　 别	n	bsTSH（mU/L）	sTSH（mU/L）	FT 4（pmol/L）
DUOX2突变组	10	4.67（1.67~8.97）	42.7（9.6~150.0）	10.7（6.8~14.9）
双位点突变	6	3.49（1.67~8.79）	53.2（9.6~150.0）	9.8（6.8~13.1）
单位点突变	4	5.41（4.02~8.97）	42.7（10.1~89.3）	12.6（9.4~14.9）
无 DUOX2突变组	7	5.25（3.29~8.86）	41.8（15.4~90.9）	14.5（7.0~18.9）

DUOX：双氧化酶；bsTSH：干血斑促甲状腺素；sTSH：血清促甲状腺素；FT ₄：游离甲状腺素.

患儿转归

31例患儿中，3例因超早产儿或原发病（先天性淋巴管畸形）于婴儿早期夭折，其余患儿随访时间中位数为4年（5个月~7年），生长发育正常，无腹胀、矮小、甲状腺肿等临床表现。除6例因年龄小于2岁仍在治疗中，其余22例进行了诊断再评估，其中暂时性CH 17例（77.3%），永久性CH 5例（22.7%）。永久性CH在早产儿组占14.3%（2/14），足月儿组占37.5%（3/8），但两组差异无统计学意义（ P>0.05）。因同胞筛查阳性召回确诊的4例患儿（例6~9）临床转归与同胞一致（3例暂时性CH，1例永久性CH）。

10例 DUOX2基因突变患儿中，1例为永久性CH；6例为暂时性CH；3例（小于3岁）仍在治疗中，左甲状腺素维持剂量为12.5 μg/d，暂时性CH可能性大。两对（例3/例4、例7）同性别双胎进行了 DUOX2基因分析，其基因型及临床转归均与同胞一致。在4例伴有家族史的患儿中，3例（例20、例22、例30）检出 DUOX2突变，其中例20为复合杂合突变，其姐姐由新生儿筛查确诊，具有相同基因型及临床转归（暂时性CH），例22（杂合突变）及例30（复合杂合突变）的母亲孕期均出现一过性甲状腺功能减退症，母亲均为携带者。

上述结果提示，除3例因超早产儿或原发病于婴儿早期夭折外，其余28例新生儿筛查阴性CH患儿经治疗预后良好，临床转归以暂时性CH为主， DUOX2基因缺陷患儿转归多数为暂时性CH。

讨　论

全国新生儿疾病筛查的普及使得绝大多数原发性CH患儿得到早期诊断和早期治疗，从而保证患儿体格和智力的正常发育，在预防残疾、改善出生人口素质中发挥重要作用。近年来研究提示，CH的患病率呈上升趋势 ^{[ 2， 6- 8]} ，越来越多CH患儿通过新生儿筛查检出并得到规范治疗，但仍有少数患儿因新生儿筛查假阴性未能早期诊断 ^[1] 。Caiulo等 ^[9] 对2007—2014年意大利伦巴第大区767 157名新生儿CH筛查结果进行回顾性分析提示，CH高危因素包括早产、出生体重低于2 kg、双胎、新生儿重症监护室患儿、合并畸形或母亲有甲状腺疾病，以及足月儿初筛临界值（bsTSH 6.5~9.9 mU/L）合并碘暴露、巨大儿（出生体重超过4.5 kg）或胎龄大于40周儿；对初筛阴性但合并高危因素的患儿于出生后15~30 d进行二次筛查（二次筛查bsTSH阳性切值为5 mU/L），额外检出32.3%（272/842）CH患儿，并对其中23例有CH家族史的疑似甲状腺激素合成障碍患儿进行全外显子测序，发现8例患儿存在 DUOX2基因的单位点或双位点突变。本研究回顾性分析了近7年广州市新生儿筛查中心发现的31例新生儿筛查阴性CH患儿的临床、生化、转归及遗传学特征，发现CH筛查假阴性多见于早产、低出生体重、同性别双胎、有甲状腺功能减退家族史患儿， DUOX2基因突变是常见的分子生物学发病基础，多数患儿临床转归为暂时性CH，经早期诊断和早期治疗预后良好。

早产儿、低体重儿主要因下丘脑-垂体-甲状腺轴功能不成熟，TSH延迟升高从而导致新生儿筛查假阴性 ^[10] 。Larson等 ^[11] 对1989年1月至2002年6月新英格兰新生儿CH筛查结果进行回顾性分析，结果提示极低体重儿（<1500 g）CH的发生率（1/250）是非极低体重儿（1/3500）的14倍，且2/3极低体重儿初次筛查呈阴性，极低体重儿TSH延迟升高的风险显著高于新生儿总风险（分别为1∶400和1∶24 260）。因此笔者建议对极低体重儿出院前进行甲状腺功能检测。Mcgrath等 ^[12] 对爱尔兰586例早产CH患儿出生后促甲状腺素进行动态观察发现，仅在出生后2周重复筛查将会漏诊大量TSH迟发性升高和失代偿性永久性CH婴儿，仅在出生后4周重复筛查将导致部分失代偿CH患儿延迟诊断，建议早产儿于出生后3~5 d、2周、4周及纠正胎龄足月时进行bsTSH检测。本文资料显示，在31例CH筛查假阴性患儿中，早产儿占61.3%，多数在新生儿科住院期间静脉采血确诊，临床转归为永久性CH的患儿占14.3%，与文献报道基本一致。因此，建议对早产儿及低体重儿于出生后2~4周重新采血进行CH筛查。

双胎或多胎，尤其是同性别双胎是CH筛查假阴性的高危人群，约70%同卵双胎儿胎盘存在血管连接引起胎血混合，导致CH初次筛查呈假阴性 ^{[ 13- 15]} 。笔者前期对2015—2017年广州地区724 791名新生儿的筛查结果进行回顾性分析结果提示，同性别双胎CH发病率（1/593）远高于单胎（1/1323）和异性别双胎（1/3060），且暂时性CH的风险相对较高 ^[16] 。本文资料中，同性别双胎占29.0%，其中4对双胎初筛结果不一致，2对双胎初筛均呈假阴性。4例患儿为同胞CH或母亲孕期合并甲状腺功能减退。因此，同性别双胎及有甲状腺功能减退家族史患儿不论初筛结果是否异常，均建议于出生后2~4周重新采血进行CH二次筛查或sTSH和FT ₄检测，以达到早期诊断、早期治疗的目的 ^{[ 4， 17- 18]} 。

笔者前期研究显示， DUOX2基因缺陷是广州地区疑似甲状腺激素合成障碍患者最常见的遗传学病因 ^{[ 2- 3]} ，新近文献报道该基因的遗传方式可呈常染色体显性、常染色体隐性遗传 ^[17] ，临床表型特征为新生儿筛查时bsTSH常轻中度升高，确诊时sTSH显著升高，转归以暂时性CH为主， DUOX2双等位基因突变或单等位基因突变均可导致暂时性CH或永久性CH ^{[ 2- 3]} 。因新生儿期、婴儿早期以及妊娠期机体对碘和甲状腺激素需求增高，尤其在碘营养供应不足状态下，更容易导致 DUOX2基因突变者产生过氧化氢减少，甲状腺激素合成减少，从而出现一过性甲状腺功能减退。随着年龄增长，机体对甲状腺激素的依赖性降低以及 DUOX1基因具有一定的生成过氧化氢代偿机制，绝大多数CH患儿在婴儿后期可维持甲状腺功能正常，但在妊娠期可能表现为一过性甲状腺功能减退。本文资料中，17例患儿进行了全外显子组测序分析，10例检出 DUOX2基因突变，其中7例经试停药再评估，结果为暂时性CH 6例、永久性CH 1例，基因型与表型无明显关系，与前期研究结果基本一致 ^{[ 2- 3]} 。

提高新生儿科及儿童保健科医生对CH的临床识别能力，有助早期发现CH筛查假阴性患儿。本文资料31例患儿中，部分患儿表现为体重增长缓慢、黄疸消退延迟、腹胀、便秘、矮小，甚至甲状腺肿等，约22.7%的患儿临床转归为永久性CH。因此，儿科医生，尤其是社区保健医生在遇到患儿生长缓慢、黄疸、腹胀、便秘等临床表现时，即使新生儿CH筛查阴性仍需警惕CH可能，需及时完善甲状腺功能评估，避免延迟诊断而导致不可逆中枢神经系统损伤。同时，儿童保健医生要加强碘营养平衡宣教，预防碘缺乏或过多碘暴露。

综上所述，CH筛查假阴性多见于早产、低出生体重、同性别双胎、有甲状腺功能减退家族史患儿， DUOX2基因突变是常见的分子生物学发病基础，建议对筛查阴性的高危新生儿于出生后2~4周重新采血进行CH二次筛查。对不明原因的生长缓慢、黄疸消退延迟、腹胀、便秘等患儿应及时进行甲状腺功能评估，以便早期诊断。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

广州市科技计划项目（201510010010）