新型携氧纳米粒人工灌注液用于猪心死亡后供肝常温灌注保存

Abstract

目的

：探讨以全氟萘烷白蛋白纳米粒作为携氧物的人工灌注液用于猪心死亡后供肝常温机器灌注（NMP）保存的效果。

方法

：制备全氟萘烷白蛋白纳米粒，按照5%白蛋白（w/v）配成人工灌注液并测试其载氧能力。16只长白猪的肝脏在热缺血 1 h后取出，随后均分为四组，用不同的保存方法连续保存2 4 h：UW液冷 保存（静态冷保存组）及动物自体血（全血NMP组）、含5%白蛋白（w/v）的平衡盐液（非携氧纳米粒NMP组）和全氟萘烷白蛋白纳米粒灌注液（携氧纳米粒NMP组）保存。灌注开始后每 4 h监测血流动力学、代谢、灌注液和胆汁的生化指标。在保存前、保存12和 24 h后分别收集肝组织标本行苏木精-伊红染色和TUNEL检测观察。

结果

：每 100 mL人工灌注液中全氟萘烷白蛋白纳米粒的载氧能力为6.94 μL/mmHg （1 mmHg= 0.133 kPa）。灌注过程中携氧纳米粒NMP组和全血NMP组肝动脉和门静脉循环阻力保持稳定，且携氧纳米粒NMP组循环阻力低于全血NMP组；两组灌注液乳酸浓度均在 8 h内降至正常范围；灌注开始后各监测时间点携氧纳米粒NMP组和全血NMP组灌注液丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平和累计胆汁产量差异均无统计学意义（均 P>0.05）。灌注 24 h后全血NMP组和携氧纳米粒NMP组的肝组织Suzuki评分均低于静态冷保存组和非携氧纳米粒NMP组（均 P<0.05），灌注 12、24 h后全血NMP组和非携氧纳米粒NMP组TUNEL染色阳性细胞数明显高于携氧纳米粒NMP组和静态冷保存组（均 P<0.05）。

结论

：含全氟萘烷白蛋白纳米粒的人工灌注液可以满足NMP保存时猪心死亡后供肝的氧耗需求，其保存效果与血液相当，在改善组织微循环和减轻缺血再灌注损伤方面可能更具优势。

常温机器灌注（normothermic machine perfusion，NMP）;血氧饱和度（saturation of blood oxygen，SO ） ;血氧分压（partial pressure of oxygen，PO ） ;血氧含量（oxygen content in blood，CO ） ;丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）;天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）;乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）;苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）;

NMP是在体外模拟体内生理灌注状态的器官保存技术，近年来开始用于肝移植供体器官特别是心死亡后捐献供肝的保存，其在避免能量耗竭导致的细胞结构及功能损害方面相比静态冷保存有较大优势，并可有效减少移植受者的短期并发症和改善其远期预后 ^{[ 1- 3]} 。NMP所用灌注液一般以血液为基础配制，虽能满足组织灌注需求，但存在使用不便、溶血、残留白细胞可能参与或加重缺血再灌注损伤等弊端 ^{[ 4- 5]} ，因此开发新的灌注液对于NMP技术的改良有重要意义。

选用合适的携氧物质是开发人工灌注液的关键。氟碳化合物全氟萘烷具有良好的氧和二氧化碳溶解度，因其不溶于水，导致其在人工灌注液中作为携氧物质的应用受限 ^{[ 6- 7]} 。利用制药技术将全氟萘烷包埋入白蛋白纳米粒中可解决其水溶性差的问题 ^[8] 。本研究探索全氟萘烷白蛋白纳米粒的携氧能力，并观察以此配制的灌注液用于猪心死亡后供肝NMP保存的实际效果及对肝组织细胞炎症损伤的影响，为使用人工灌注液改良NMP技术提供参考。

材料与方法

实验动物、材料及仪器

长白猪（雌性，15~20 kg）由邳州市东方养殖有限公司提供[检疫合格证号SCXK（苏）2017-0002]。全氟萘烷为赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；人血白蛋白为瑞士CSL Behring AG公司产品。高速剪切分散仪为美国PhD Technology LLC公司产品；MiniDeBEE均质机为美国BEE International产品；血气分析仪为美国Nova Biomedical产品；BIC 90plus粒度仪为美国布鲁克海文仪器公司产品。

制备全氟萘烷白蛋白纳米粒

500 mL含10%全氟萘烷（v/v）、20%人血白蛋白（w/v）的混合液以高速剪切分散仪22 000转/min乳化 5 min。以水为变性剂，将制备好的乳液用MiniDeBEE均质机在30 000 psi（1 psi=6.895 kPa）压力下均质10个循环。最终使白蛋白解折叠，暴露疏水区域，在与全氟萘烷分子对撞的过程中把全氟萘烷包入白蛋白中，形成包埋全氟萘烷的白蛋白纳米粒。过程中控温 55~75 ℃， 维持溶液酸碱度值5.5~8.5 ^[9] 。

配制全氟萘烷白蛋白纳米粒灌注液并监测其稳定性和载氧能力

以平衡盐离子浓度为依据配制含全氟萘烷白蛋白纳米粒灌注液，最终灌注液中人血白蛋白浓度为5%（w/v），以血气分析仪监测其酸碱度和离子渗透压。分别在 25 ℃和 37 ℃环境中放置 36 h， 并使用BIC 90plus粒度仪监测纳米粒的粒径变化。将 1 mL实验动物耳缘静脉血与 1 mL充分氧合的含全氟萘烷白蛋白纳米粒的灌注液混合，混合前后进行血气分析测量血红蛋白、SO ₂和PO ₂。计算CO ₂：CO ₂=1.34×SO ₂×血红蛋白含量+0.003×PO ₂，进一步计算随着氧分压变化 1 mL灌注液中全氟萘烷白蛋白纳米粒释放的氧气体积 ^[10] 。以上测量三次取平均值。

建立猪心死亡后供肝模型

16只实验动物给予麻醉后取仰卧位，开腹，分离暴露肝动脉、胃左动脉和门静脉后，给予 300 U/kg肝素静脉注射，然后阻断肝动脉和门静脉血流并记录时间，之后经胃左动脉插管至腹主动脉，取血 500 mL后处死动物。取血的同时游离肝门，分别在膈肌、肾静脉上方水平切断下腔静脉，脾静脉水平切断门静脉，将原先插入腹主动脉中的置管转移插入肝动脉并缝扎固定。在肝门静脉中插入灌注管，结扎胆囊管和胆囊动脉，胆总管插管引流胆汁。将肝脏保持在腹腔原位至肝血流阻断 1 h以模拟心死亡后供体肝脏的热缺血过程，之后立即取出，以 4 ℃等渗氯化钠溶液500 mL和 1000 mL分别经肝动脉和门静脉进行灌注并称重。本研究方案通过南京医科大学 鼓楼临床医学院实验动物福利与伦理审查（2018050007）。

构建NMP系统

体外肝脏的常温灌注系统以体外膜氧合技术为基础搭建 ^[11] 。完成造模的肝脏置于无菌软袋中，灌注液使用蠕动泵以固定流速泵入肝动脉和门静脉进行灌注后，从下腔静脉的开口流出并被无菌软袋收集，而后由蠕动泵1驱动泵入水浴温控装置加温并经过膜氧合器进行氧合后分别灌注肝动脉和门静脉，灌注液在进入肝动脉前经蠕动泵2驱动以模拟搏动性血流并精确控制流量。在蠕动泵1的上游加入需持续补充的药物、营养底物和灌注系统因蒸发丢失的水分。见 图1。

图1 .

肝脏常温灌注系统示意图和实物图

实验分组及供肝保存措施

实验猪心死亡后供肝模型建立后分为四组，即静态冷保存组、全血NMP组、非携氧纳米粒NMP组和携氧纳米粒NMP组，每组4只。静态冷保存组使用UW液在 4 ℃环境中进行静态冷保存24 h；全血NMP组、非携氧纳米粒NMP组和携氧纳米粒NMP组分别采用动物自体血 500 mL、含5%白蛋白（w/v）的平衡盐液和全氟萘烷白蛋白纳米粒灌注液以 图1所示的系统保存 24 h。灌注流量设置：肝动脉每 100 g肝组织 25 mL/min，门静脉每 100 g肝组织 75 mL/min。水浴加温维持灌注液温度在39 ℃。以 3 L/min的速率持续对膜氧合器输送95%氧气和5%二氧化碳混合气体进行氧合。灌注开始时，灌注系统中加入氢化可的松 50 mg、万古霉素 20 mg、哌拉西林/他唑巴坦 0.9 g，5%碳酸氢钠注射液 10 mL和水溶性维生素（水乐维他） 10 mg ^[11] 。根据预实验结果，全血NMP组加入普通中性胰岛素负荷量40 U，非携氧纳米粒NMP组和携氧纳米粒NMP组胰岛素负荷剂量为80 U。在灌注开始后向灌注系统每小时持续泵入18AA氨基酸 0.5 g、前列腺素E 1 mg、中性胰岛素1~2 U、5%葡萄糖 15~30 mL、5%碳酸氢钠 2~6 mL以维持灌注液血糖4~10 mmol/L、酸碱度值7.3~7.5。全血NMP组在灌注开始后向灌注系统中持续泵入普通肝素500 U/h抗凝，非携氧纳米粒NMP组和携氧纳米粒NMP组不追加肝素。

监测指标

NMP开始后按时监测以下指标。①血流动力学指标：灌注开始后0.5、4、8、12、16、 20、24 h监测肝动脉和门静脉灌注压，计算肝动脉和门静脉系统阻力。②氧代谢指标：上述每个时间点抽取 图1 中采样点1和2的灌注液 1 mL进行血气分析，监测灌注液酸碱度值、乳酸浓度，并计算每 100 g肝组织每分钟氧消耗，全血NMP组和非携氧纳米粒NMP组氧消耗=1.34×（SO _2灌注前–SO _2灌注后）×血红蛋白含量+0.003×（PO _2灌注前–PO _2灌注后），携氧纳米粒NMP组氧消耗=每 1 mmHg氧分压变化时100 mL灌注液中携氧纳米粒释放氧体积×（PO _2灌注前–PO _2灌注后）+0.003×（PO _2灌注前–PO _2灌注后） （1 mmHg= 0.133 kPa）。③肝细胞损伤指标：上述每个时间点抽取 1.5 mL灌注液检测ALT、AST、LDH，灌注开始后每 4 h统计生成的胆汁量。

HE染色观察病理组织学变化

在热缺血造模后、冷保存或灌注保存12 h和 24 h后取右肝叶边缘约0.5 cm×0.5 cm ×1.0 cm大小的肝脏组织浸泡4%的甲醛溶液固定，取肝组织处用4号丝线给予“8”字缝合。标本石蜡包埋切片行HE染色后进行肝组织Suzuki评分 ^[12] 。肝窦淤血：无为0分，少量为1分，轻度为2分，中度为 3分，重度为4分；肝细胞胞质空泡样改变：无为 0分，少量为1分，轻度为2分，中度为3分，重度为4分；肝细胞坏死：无为0分，单个细胞为1分，肝细胞坏死在30%及以下为2分，肝细胞坏死超过30%且低于60%为3分，肝细胞坏死在60%及以上为 4分。三项评分之和即为Suzuki评分得分。由于本研究中非携氧纳米粒NMP组和携氧纳米粒NMP组使用无血细胞灌注液，因此仅使用后两项评分之和。每组每个肝脏标本切片由一名病理科医师采用盲法随机观察五个高倍镜视野，最终将五个视野评分平均分纳入统计。

TUNEL染色观察肝细胞凋亡

将1.8中获得的石蜡切片经脱蜡、水化后滴加蛋白酶K， 37 ℃消化 15 min， 磷酸盐缓冲液洗涤 3次，3%过氧化氢溶液中室温孵育 3 min，滴加Streptavidin-HRP工作液室温孵育 30 min，二氨基联苯胺显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。使用ImageJ软件计每个高倍视野内染色为棕褐色的凋亡阳性细胞数，每个时间点的标本随机计数五个高倍视野并取平均值。

统计学方法

使用SPSS 21.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 9软件绘制统计图。正态分布的计量资料以均数±标准差（ $\overline{{\displaystyle x}}$ ± s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 t检验；非正态分布的计量资料以中位数（上下四分位数）[ M（ Q ₁， Q ₃）]表示，组间比较采用秩和检验。以 P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

全氟萘烷白蛋白纳米粒的表征及稳定性

全氟萘烷白蛋白纳米粒的粒径为50~200 nm，平均为（103.7± 6.5）nm，灌注液的平均酸碱度值为7.51±0.02，离子渗透压为（303.8±2.3）mOsm/kg。在 25 ℃和 37 ℃环境中静置 36 h后灌注液中纳米粒的平均粒径分别增加42.5%和69.7%，但均未超过 200 nm，符合纳米粒的粒径要求，且无沉淀产生。提示制成的纳米粒在生理温度下能保持相对稳定，且配制灌注液的酸碱度和离子渗透压也与生理状态下血浆接近。

全氟萘烷白蛋白纳米粒灌注液的携氧能力

血气分析结果显示， 1 mL静脉血和 1 mL充分氧合的灌注液混合后血液中的血红蛋白平均氧饱和度从75.5%升高至91.8%，吸收氧气 30.58 μL，人工灌注液中全氟萘烷白蛋白纳米粒的环境氧分压从 366.5 mmHg下降至 55.1 mmHg，物理溶解氧共减少 8.98 μL，则全氟萘烷白蛋白纳米粒释放的氧气为 21.60 μL。根据全氟化碳氧含量和氧分压的线性关系，可推算出环境氧分压每下降 1 mmHg，每 100 mL灌注液中全氟萘烷白蛋白纳米粒释放氧气 6.94 μL，而根据1.3中氧含量公式计算环境氧分压每下降 1 mmHg物理溶解氧的释放量仅为 3 μL，提示加入全氟萘烷白蛋白纳米粒的灌注液携氧能力明显提高。

四组供肝保存结果比较

造模后静态冷保存组、全血NMP组、非携氧纳米粒NMP组和携氧纳米粒NMP组肝脏平均质量分别为（349±30）、（342±21）、（327±34）和（331±29）g，差异无统计学意义（ P>0.05）；经静态冷保存或NMP后各组肝脏质量分别为（314±26）、（440±41）、（451±52）和（438±47）g，静态冷保存组肝脏质量显著小于其他三组（均 P<0.05）。全血NMP组和携氧纳米粒NMP组灌注液和收集的胆汁随保存时间的变化如 图2所示，随着保存时间延长，全血NMP组出现明显的溶血现象，胆汁中胆红素浓度也明显增加（ 图3）。提示使用全血进行灌注保存时存在明显的红细胞破坏。

图2 .

常温机器灌注（NMP）保存过程中收集的灌注液和胆汁

A：全血NMP组；B：携氧纳米粒NMP组.

图3 .

三组NMP保存过程中各时间点收集胆汁的总胆红素浓度变化

与非携氧纳米粒NMP组比较， * P<0.05；与携氧纳米粒NMP组比较， # P<0.05. NMP：常温机器灌注.

三组NMP保存供肝血流动力学指标比较

全血NMP组和携氧纳米粒NMP组肝动脉、门静脉灌注压和灌注阻力在整个NMP保存期间保持稳定，且携氧纳米粒NMP组上述指标均低于全血NMP组（均 P<0.05）；非携氧纳米粒NMP组在 12 h后肝动脉和门静脉的灌注压和灌注阻力开始逐渐升高，见 图4。说明非携氧纳米粒NMP组肝脏随着灌注进行出现明显的微循环障碍。

图4 .

三组NMP保存过程中血流动力学变化

与非携氧纳米粒NMP组比较， * P<0.05；与携氧纳米粒NMP组， # P<0.05. NMP：常温机器灌注. 1 mmHg= 0.133 kPa

三组NMP保存供肝组织代谢情况比较

全血NMP组和携氧纳米粒NMP组在NMP初期灌注液乳酸浓度均超过 2 mmol/L，随后可在 8 h内下降至正常；非携氧纳米粒NMP组灌注液的乳酸浓度一直维持在较高水平，且氧消耗明显低于另两组（均 P<0.05）。为维持灌注液的酸碱度值在目标范围，非携氧纳米粒NMP组需补充更多的碳酸氢钠，且非携氧纳米粒NMP组葡萄糖消耗量明显低于另两组，见 图5。结果提示，全血NMP组和携氧纳米粒NMP组灌注时氧供均充足，能够维持正常的氧和葡萄糖代谢，而非携氧纳米粒NMP组氧供不足，组织细胞缺氧并出现明显代谢障碍。

图5 .

三组NMP保存过程中肝组织代谢变化

与全血NMP组比较， * P<0.05. NMP：常温机器灌注.

三组NMP保存供肝细胞损伤和胆汁产量变化比较

全血NMP组和携氧纳米粒NMP组灌注液的ALT、AST和LDH浓度在灌注开始4 h后各监测时间点差异均无统计学意义（均 P>0.05）；而非携氧纳米粒NMP组灌注液ALT、AST和LDH浓度持续升高。全血NMP组和携氧纳米粒NMP组平均胆汁累计产量分别为（184±80）和（169±47）mL，高于非携氧纳米粒NMP组的（96±7）mL，但差异无统计学意义（均 P>0.05），见 图6。结果提示，非携氧纳米粒NMP组肝细胞损伤超过全血NMP组和携氧纳米粒NMP组，胆汁产量亦明显减少。

图6 .

三组NMP保存过程中肝细胞损伤和胆汁产量变化

与全血NMP组比较， * P<0.05. NMP：常温机器灌注；ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；LDH：乳酸脱氢酶.

四组供肝组织损伤评分比较

各组供肝造模后Suzuki评分均无显著差异（均 P>0.05），静态冷保存组保存 24 h、非携氧纳米粒NMP组灌注 12 h和 24 h均可见明显的细胞核固缩，细胞质内空泡和肝小叶结构紊乱等表现，Suzuki评分明显高于全血NMP组和携氧纳米粒NMP组（均 P<0.05），如 图7、 表1。结果提示，UW液低温长时间 （24 h）保存后肝细胞也会出现损害和坏死表现，而使用全血或携氧纳米粒灌注液常温灌注有延长肝脏体外保存时间的潜力。

图7 .

四组保存肝组织病理学表现（HE染色）

静态冷保存组保存 24 h后、非携氧纳米粒NMP组灌注 12 h和 24 h后均可见明显的细胞核固缩、细胞质内空泡和肝小叶结构紊乱等表现；全血NMP组、携氧纳米粒NMP组在整个保存过程中肝细胞形态和肝小叶结构均变化不大. NMP：常温机器灌注；HE染色：苏木精-伊红染色. 标 尺=100 μm.

表1 四组保存肝组织Suzuki评分比较

Table1 Hepatic histology Suzuki score in four groups

( $\overline{{\displaystyle x}}$ ± s, n=4)

组别	造模后	灌注12 h	灌注24 h
静态冷保存组	1.75±0.25	2.15±0.10	3.35±0.19
全血NMP组	1.80±0.28	2.45±0.50	2.55±0.41 *
非携氧纳米粒NMP组	1.75±0.44	3.10±0.20 *	4.20±0.16 *#
携氧纳米粒NMP组	1.65±0.44	2.30±0.62	2.50±0.42 *△

与静态冷保存组比较， ^* P<0.05；与全血NMP组比较， ^# P<0.05；与非携氧纳米粒NMP组比较， ^△ P<0.05. NMP：常温机器灌注.

四组保存供肝组织中肝细胞凋亡结果比较

各组供肝造模后TUNEL染色结果相似，灌注 12、24 h后全血NMP组和非携氧纳米粒NMP组TUNEL染色阳性细胞数多于携氧纳米粒NMP组和静态冷保存组（均 P<0.05），见 图8、 表2。结果提示，携氧纳米粒NMP组相比全血NMP组和非携氧纳米粒NMP组肝细胞凋亡明显减少。

图8 .

四组保存肝组织中肝细胞凋亡情况（TUNEL染色）

各组供肝造模后TUNEL染色结果相似，静态冷保存组在整个保存过程中TUNEL染色阳性数均较少，携氧纳米粒NMP组在灌注 12、24 h后TUNEL染色阳性细胞数仅轻度增加，而全血NMP组和非携氧纳米粒NMP组TUNEL染色阳性细胞数明显多于携氧纳米粒NMP组. NMP：常温机器灌注. 标尺 =100 μm.

表2 四组肝组织TUNEL染色阳性细胞数比较

Table2 Count of TUNEL staining positive cells of hepatic tissue in four groups

( $\overline{{\displaystyle x}}$ ± s, n=4)

组别	造模后	灌注12 h	灌注24 h
静态冷保存组	14.9±1.3	14.7±1.5	14.1±0.7
全血NMP组	13.7±1.1	39.5±2.7 *	58.0±2.5 *
非携氧纳米粒NMP组	15.1±1.9	37.3±2.4 *	65.3±7.5 *
携氧纳米粒NMP组	14.8±2.1	18.5±1.7 #△	23.4±2.4 *#△

与静态冷保存组比较， ^* P<0.05；与全血NMP组比较， ^# P<0.05；与非携氧纳米粒NMP组比较， ^△ P<0.05. NMP：常温机器灌注.

讨论

使用NMP进行保存是移植肝保存技术的革命性进步 ^[1] 。目前NMP使用的灌注液一般以血液为基础配制，而血制品具有稀缺和保存运输条件复杂且不易的属性 ^[13] ，因此开发便利的人工灌注液具有良好的应用前景。本文资料表明，在使用含全氟萘烷白蛋白纳米粒人工灌注液的情况下肝脏NMP保存可以正常进行，保存效果明显优于静态冷保存和灌注液中不含携氧材料的灌注组，与使用全血进行灌注保存一样有效，并且在避免溶血、提高灌注液乳酸下降速率以及减少肝细胞凋亡方面可能更优。

载氧能力是决定人工灌注液效能的核心要素。本文资料显示， 100 mL含全氟萘烷白蛋白纳米粒的灌注液在氧分压每下降 1 mmHg时释放氧气6.94  μL。在使用95%浓度氧时膜氧合器可以将灌注液的氧分压提高至 400 mmHg以上，而生理情况下经组织摄取后静 脉系统内血液的氧分压约为 40 mmHg，以氧分压从 400 mmHg降至 40 mmHg计算每 100 mL灌注液可释放2.497  mL氧气。以动脉血流经组织后血红蛋白氧饱和度从100%大约下降至75%计算， 100 mL血液中每 1 g血红蛋白释放0.355 mL氧气。此时灌注液中的全氟萘烷白蛋白纳米粒的供氧能力与70.34 g/L的血红蛋白相当，可以满足有肝动脉和门静脉双重供血肝脏的氧供。既往NMP研究中发现每 100 g肝脏组织的氧消耗速率约为 2 mL/min ^{[ 11， 14]} 。根据上述结果，含全氟萘烷白蛋白纳米粒的灌注液在 100 mL/min的灌注流速下完全可以满足肝组织的氧消耗需求。在本研究中携氧纳米粒NMP组良好的氧代谢状态也验证了人工灌注液的载氧能力。

本研究使用人工灌注液效果更优可能有以下几个原因：①本研究灌注液中所含的纳米粒平均粒径不足 200 nm，不到红细胞平均直径的1/30，因此该人工灌注液的黏滞度远小于全血NMP组。肝组织缺血再灌注后会导致血管内皮细胞激活和微循环障碍，而纳米粒比红细胞更容易通过淤塞的微循环，可能增加组织特别是微循环受损的组织供氧，在Patrono等 ^[14] 使用游离血红蛋白进行NMP的研究中也能观察到类似 现象。②全血NMP组灌注液离心后上清液颜色逐步加深，且分泌胆汁中胆红素浓度逐步增加，说明红细胞在灌注过程中发生溶血，而溶血产生的游离血红蛋白可能吸收组织间一氧化氮而导致血管阻力增加和微循环障碍加 剧 ^{[ 4， 15]} 。 ③人工灌注液不含白细胞，可能抑制了由中性粒细胞、单核细胞所介导的缺血再灌注-氧化应激-炎症损伤过程 ^[16] ，如避免灌注液中的中性粒细胞激活、黏附损害肝血窦内皮细胞功能，及减少中性粒细胞浸润导致的肝细胞炎性损伤 等 ^{[ 17- 19]} ， 从而减少肝细胞凋亡。

综上，利用含全氟萘烷白蛋白纳米粒配制的人工灌注液具备充足的携氧能力，可满足肝脏NMP保存的需求，其用于猪心死亡后供肝的体外灌注保存效果与全血相当，并在避免溶血、改善肝脏微循环和减轻肝细胞缺血再灌注损伤相关炎症损伤方面有相对优势。但本研究仅为体外器官灌注保存研究，而全氟萘烷白蛋白纳米粒体内代谢和毒性是供肝经其灌注后能否植入受体动物乃至推动今后应用于人体肝移植的关键。现有资料表明，全氟萘烷乳剂注射后首先被网状内皮系统的单核细胞或巨噬细胞吞噬从循环中清除，80%以上暂存于网状内皮系统器官中，主要是肝和脾，然后通过脂质载体从网状内皮系统器官转移至肺 泡腔，通过呼吸排出体外，在器官驻留半衰期为 7 d ^[20] 。全氟萘烷白蛋白纳米粒作为一种新型制剂其细胞毒性尚不得而知，但其氧离曲线为线形 ^[10] ，本研究为保障人工灌注液携氧能力将其氧分压提高至 400 mmHg以上，有可能增加临近血管周围细胞氧中毒 ^[21] 。如何避免上述不利影响或开发比全氟萘烷更高效的携氧物以降低灌注液氧分压需求，这些都是人工灌注液临床转化前亟待解决的问题，需要更多的实验研究来验证。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家重大科研仪器研制项目（81927808）; 江苏省重点研究计划（BE2108700）