马尾松松针提取物调节JNK3/caspase -3信号转导减轻大鼠脑缺血再灌注后氧化应激损伤

Abstract

目的

：探讨马尾松松针提取物（PNE）对大鼠脑缺血再灌注后氧化应激损伤的保护作用。

方法：

将SD雄性大鼠随机分为手术对照组、模型对照组、依达拉奉组、PNE小剂量组（200 mg/kg）、PNE中剂量组（400 mg/kg）、PNE大剂量组（800 mg/kg）， 于造模前连续7 d及造模后6 h分别灌胃给药。其中，手术对照组和模型对照组灌胃给予等渗氯化钠溶液，依达拉奉组灌胃给予等渗氯化钠溶液的同时腹腔注射依达拉奉3 mg/kg，PNE各组灌胃给予各剂量PNE。通过大脑中动脉阻塞法建立脑缺血再灌注损伤大鼠模型，于再灌注24 h后测定各组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑梗死体积。采用苏木素-伊红染色观察大脑皮层及海马组织结构病理变化并统计正常神经细胞数；TUNEL法检测大脑皮层神经细胞凋亡率；试剂盒检测缺血侧脑组织一氧化氮、丙二醛含量与超氧化物歧化酶（SOD）活性；蛋白质印迹法检测大脑皮层c-Jun氨基末端激酶（JNK）3、磷酸化JNK3、B淋巴细胞瘤蛋白（Bcl）-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、细胞色素C、胱天蛋白酶（caspase）-3的蛋白表达水平。

结果

：与模型对照组比较，PNE各剂量组行为学评分、脑组织含水量及脑梗死体积均显著降低（均 P<0.05），大脑皮层及海马CA1区组织病理性损伤显著减轻，缺血侧皮层及海马CA1区中正常神经细胞数增加（均 P<0.05），以PNE中剂量组效果最好。与模型对照组比较，PNE中剂量组皮层神经细胞凋亡率显著减小，大脑皮层组织中一氧化氮、丙二醛含量显著减少，SOD活性显著升高，磷酸化JNK3/JNK3比值、细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平均显著降低，Bcl-2/Bax比值显著升高（均 P<0.05）。

结论：

PNE对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，这种保护作用可能与清除一氧化氮和丙二醛，抑制氧化应激介导的JNK3/caspase-3信号转导来抑制神经细胞凋亡有关。

脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）;c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）;松针提取物（pine needle extracts，PNE）;胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）;2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）;苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）;B淋巴细胞瘤蛋白（B-cell lymphoma，Bcl）;Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）;相对标准差（relative sandard deviation，RSD）;大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）;改良的神经损伤严重程度评分（modified neurological severity score，mNSS）;

脑卒中中医名中风，具有高发病率、高病死率、高致残率的临床特征 ^[1] ，其中缺血性脑卒中约占总发病数的85% ^[2] 。目前，临床上缺血性脑卒中大多使用溶栓药等进行治疗 ^[3] ，往往会导致患者脑组织产生出血转化等副作用，即CIRI ^[4] 。中医学认为缺血性中风病为本虚标实之证，其病因不外乎风、火、痰、瘀、气、虚，风痰蒙窍、肝风内动、气血内乱等为中风发病之标，阴阳两虚、气血亏虚、脾肾两虚等为中风致病之本 ^[5] ，常以活血化瘀药、平肝息风药等治疗 ^[6] 。近年来，随着中医辨证论治优势的凸显及《中国脑梗死中西医结合诊治指南（2017）》 ^[7] 的发布，中医药救治已愈发成为我国临床针对缺血性脑卒中的重要干预方式，开发有效的治疗中药也成为我国中医药临床学者的重要研究方向。

马尾松（ Pinus massoniana Lamb.）为松属松科裸子植物，分布极广，其叶松针收载于《全国中草药汇编》，性温，味苦、涩，具有祛风活血、明目、安神的功效，可用于高血压病、神经衰弱等 ^[8] 。《本草纲目》 ^[9] 曾记载：“松叶捣汁，初服半升，渐加至一升，以头面出汗为度，可治中风口邪”，民间常用松针鲜品榨汁服用以预防和治疗脑卒中。据报道，松针多糖具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用 ^[10] 。自由基通过靶向多个细胞信号通路（如JNK信号通路）在CIRI发病机制中发挥着重要作用 ^{[ 11- 12]} 。当脑缺血再灌注发生时，一氧化氮可以通过亚硝酸化激活JNK3信号通路，引发缺血性神经细胞死亡 ^[13] 。鉴于民间松针在脑卒中的应用以及自由基在CIRI中的作用，同时松针多糖具有抗氧化作用，推测马尾松松针榨汁物可通过抑制氧化应激介导的JNK3信号通路对CIRI起到保护作用。

本研究旨在探讨PNE对大鼠CIRI的抑制作用及JNK3/caspase-3介导的细胞凋亡信号通路的影响，为PNE开发为抗脑缺血药物提供依据。

材料与方法

动物、试剂和仪器

无特定病原体级雄性SD大鼠，8周龄，体重200~220 g， 由浙江中医药大学实验动物中心提供[动物许可证号SCXK（沪）2018-0006]。饲养环境温度为22~25℃，相对湿度50%~70%，昼夜周期12 h/12 h， 自由饮食。适应性饲养1周后按照动物实验伦理规范进行实验。研究通过浙江中医药大学动物伦理委员会审查（IACUC-20180423-05）

葡萄糖对照品（批号S10S9I70825）为上海源叶生物科技有限公司产品；依达拉奉（批号02-1900312）为吉林博大制药有限公司产品；TTC（批号2191C072）为美国Amresco公司产品；HE染色试剂盒（批号191108）为福州飞净生物科技有限公司产品；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号T9001240）为上海翊圣生物科技有限公司产品；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（批号F1417-SA17）为美国SouthernBiotech公司产品；一氧化氮（批号20210121）、丙二醛（批号20210120）、SOD（批号20210113）测试盒为南京建成生物工程研究所产品；BCA蛋白定量检测试剂盒（批号16G11A37）为武汉博士德生物工程有限公司产品；JNK3（批号GRB87968-18）、磷酸化JNK3（GR3297551-6）、Bax（GR151406-18）、Bcl-2（批号GR25647-9）、细胞色素C（批号GR3256622-4）兔抗人单克隆抗体为美国Abcam公司产品；caspase-3兔抗人单克隆抗体（批号9662S-0017）、β-actin鼠抗单克隆抗体（批号AB8226）为美国CST公司产品；辣根酶标记山羊抗小鼠（批号ZB-2305）、山羊抗兔IgG（H+L）（批号ZB-2301）为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

UV-1800型紫外分光光度计为日本岛津（中国）有限公司产品；正置荧光显微镜Eclipse Ni-U为德国Zessi公司产品；PerkinElmer EnSpire酶标仪为美国PerkinElmer公司产品；Bio-Rad化学发光成像系统为美国Bio-Rad公司产品；VE180微型垂直电泳槽及EPS600电泳仪为上海天能科技有限公司产品。

马尾松PNE检测方法学确定及多糖含量测定

对照品溶液制备

取葡萄糖对照品4.9 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中加蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，即得终浓度为0.098 mg/mL对照品溶液。

供试品溶液制备

所用马尾松松针经浙江中医药大学张水利教授鉴别为松科松属裸子植物马尾松的针状叶。称取马尾松松针鲜品适量，置于榨汁杯中，以8 mL∶1 g的液料比加入蒸馏水，1250 W功率下榨汁提取65 s，200目纱布压榨取汁。粗汁提取后，4 ℃下242× g低温离心5 min，收集上清液，定容，即得供试品溶液。将制备所得提取液进行冷冻干燥，得马尾松PNE干燥粉末，4℃保存。

线性关系考察

精密吸取对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL刻度试管中，分别加入蒸馏水定容至1.0 mL，再分别加入5%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀后再放入沸水浴中20 min，静置至室温。取所配溶液进行200~800 nm波长范围内扫描，测得最大吸收波长。使用紫外分光光度计在最大吸收波长处测定各溶液的吸光度值，记录结果。以葡萄糖对照品溶液浓度为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算其回归方程。

精密度试验

精密吸取葡萄糖对照品溶液六份，按1.2.3中的操作方法于最大波长处测得吸光度值，计算吸光度值的RSD值。

重复性试验

精密称取马尾松松针六份，按1.2.2中的方法制备供试品溶液，按1.2.3中的方法于最大波长处测定吸光度值，计算马尾松松针的多糖提取率及其RSD值。

稳定性试验

精密吸取供试品溶液，分别在0、6、12、18、24 h后按1.2.3中的方法于最大波长处测定吸光度值，计算其RSD值。

加样回收率试验

精密称取已知含量的马尾松松针六份，分别精密加入葡萄糖标准品适量，按1.2.2中的方法制备成供试品溶液。按1.2.3中的方法于最大波长处测定吸光度值，计算加样回收率及其RSD。

多糖含量测定

取适量马尾松PNE粉末进行多糖含量测定。多糖含量=（V×c/W）×100%。式中，c为葡萄糖溶液浓度（mg/mL），V为松针多糖溶液总体积（mL），W为松针质量（mg）。

建立大鼠脑缺血再灌注模型及分组

将雄性SD大鼠随机分为手术对照组、模型对照组、依达拉奉组、PNE小剂量组（200 mg/kg）、PNE中剂量组（400 mg/kg）、PNE大剂量组（800 mg/kg）， 每组24只。手术对照组、模型对照组和依达拉奉组连续7 d灌胃给予等渗氯化钠溶液（其中依达拉奉组同步给予腹腔注射依达拉奉，3 mg/kg）， PNE各组连续7 d灌胃给予各剂量PNE。除手术对照组外，其他组于第7天灌胃1 h后参照Longa等 ^[14] 的方法建立MCAO模型。大鼠造模前12 h禁食不禁水，采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，钝性分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，同时避开迷走神经，结扎近心端颈总动脉及颈外动脉，用止血夹夹闭颈内动脉后，在颈总动脉靠近三岔位置5 mm处剪一微型创口，将栓线推至颈内动脉夹闭处，松开止血夹将栓线推进至距颈总动脉分岔19~21 mm，感受到微小阻力时停止，缺血1.5 h后轻轻拔出栓线，恢复大鼠脑部血流供应，缝合颈部创面。手术对照组在造模时仅将颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉钝性分离，分离后不插入栓线，立即将颈部伤口缝合。在MCAO造模过程中，采用医用加热毯维持大鼠体温，术后置于保温灯下直至苏醒。术后6 h依达拉奉组再次给予腹腔注射依达拉奉，PNE各组再次灌胃给予相应剂量的马尾松PNE，手术对照组及模型对照组再次给予等渗氯化钠溶液，于再灌注24 h测定各组大鼠生理指标。

mNSS评价神经功能缺损程度

大鼠脑缺血再灌注24 h后，参考mNSS ^{[ 15- 16]} 评价各组大鼠行为学指标，包括提尾试验、行走试验、感觉试验、平衡木试验、反射丧失和不正常运动试验，mNSS分值为0~18分，正常为0分。分值越高，大鼠神经功能缺损越严重。

干、湿比重法测定脑组织含水量

大鼠脑缺血再灌注24 h后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，处死后取脑，等渗氯化钠溶液冲洗脑表面血液，切除嗅球、小脑及低位脑干，滤纸吸干水分，精密称定样本湿重后，将脑组织置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，称得脑干重并计算脑组织含水量：脑组织含水量（%）=（脑湿重－脑干重）÷脑湿重×100% ^[17] 。

TTC染色法测定脑梗死体积

按1.5中的方法获取大鼠脑组织后，置于–20 ℃冷冻20~30 min， 沿冠状切面以2 mm间距冠状切成5片，迅速将脑片轻柔地置于5 mL含2% TTC的磷酸缓冲液中，于37 ℃条件下避光孵育10 min（每2 min均匀振荡一次） ^[18] 。染色后使用单反相机拍摄，Image Pro Plus 6.0系统分析脑缺血体积，并参照Swanson法计算脑梗死体积：脑梗死体积（%）=（正常侧大脑半球体积－梗死侧非梗死区的体积）÷正常侧大脑半球体积×100% ^[19] 。

HE染色观察大脑皮层及海马CA1区病理学形态

大鼠脑缺血再灌注24 h后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经主动脉用预冷的氯化钠溶液快速灌流后，4%多聚甲醛灌注固定，取脑，置于4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h后取出，流水冲洗2 h后逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作成约6 μm的切片。采用试剂盒进行HE染色，中性树胶封片，400倍光学显微镜下观察大脑皮层及海马CA1区病理学变化，每张切片随机选择五个视野，分析大脑皮层的正常神经细胞数 ^{[ 20- 21]} 。

TUNEL法检测大脑皮层神经细胞凋亡率

大鼠脑缺血再灌注24 h后，按1.7的方法制作手术对照组、模型对照组、依达拉奉组以及PNE各组的脑组织石蜡切片。采用试剂盒进行TUNEL染色，将玻片置于400倍荧光显微镜下观察，每张玻片随机选取五个不重叠的大脑皮层视野，细胞核呈蓝色荧光，凋亡细胞呈绿色荧光，以蓝色荧光与绿色荧光重合细胞记为凋亡细胞，并计算细胞凋亡率：细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数÷总细胞数×100% ^[22] 。

试剂盒测定脑组织中的氧化应激水平

大鼠脑缺血再灌注24 h后，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，冰上断头取脑，取其缺血侧脑组织于1.5 mL EP管中。电子分析天平精准称重，以9倍于重量的比例加入注射用氯化钠溶液，制成10%匀浆溶液，15 520× g离心处理。取上清液，按相应试剂盒要求进行一氧化氮、丙二醛含量及SOD活性测定。

蛋白质印迹法检测JNK3/caspase-3通路蛋白表达

提取大鼠大脑缺血侧皮层总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量。10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳胶分离蛋白后按照湿式转膜三明治法转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，随后加入一抗于4 ℃过夜，第2天加入各对应二抗室温孵育1 h，孵育结束后将聚偏二氟乙烯膜置于Bio-Rad化学发光成像系统中，滴加适量ClarityWestern ECLSubstrate化学发光液于膜上，选择最佳曝光时间进行化学发光检测。应用ImageJ软件对蛋白条带进行分析。

统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计分析，统计图使用GraphPad Prism 6.0绘制。正态分布的计量数据以均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用单因素方差分析，所有检测均为双侧检验， P<0.05为差异有统计学意义。

结果

马尾松PNE方法学考察及多糖含量测定结果

回归方程为Y=65.939X－0.0439， R ²=0.9994，在4.20~11.20 μg/mL范围内线性关系良好。精密度试验结果的RSD值为1.29%（ n=6），表明仪器精密度良好；重复性试验结果的RSD值为1.76%（ n=6），表明本方法重复性良好；稳定性试验结果RSD值为2.54%（ n=5），表明供试品溶液在24 h内基本稳定；加样回收率试验测得平均加样回收率为102.08%，RSD值为2.72%（ n=6），表明该方法回收率良好。上述结果提示，采用液料比8 mL∶1 g、提取时间65 s、提取功率1250 W的提取工艺制备马尾松PNE，所得PNE冻干粉末平均产率为10.61%（冻干粉/生药），其中多糖平均含量为55.54%（多糖/冻干粉）。

马尾松PNE对CIRI大鼠mNSS评分的影响

手术对照组无神经功能缺损；模型对照组反应迟缓，爬行时单向转圈，且存在偏瘫现象，进食饮水行为消失，mNSS评分为13.0±0.9，比手术对照组显著增加（ P<0.01），提示造模成功。依达拉奉组及PNE小、中、大剂量组的mNSS评分分别为7.7±0.8及11.5±1.4、10.0±0.9、11.2±1.2，均低于模型对照组（均 P<0.05）。其中，PNE中剂量组mNSS评分低于PNE小、大剂量组（均 P<0.05），但高于依达拉奉组（ P<0.01）。结果提示，马尾松PNE可以减轻CIRI大鼠神经功能受损程度，且中剂量效果最佳。

马尾松PNE对CIRI大鼠脑组织含水量的影响

手术对照组脑组织含水量为（75.9±0.5）%，模型对照组脑组织含水量为（80.3±0.8）%，显著增加（ P<0.01），说明脑缺血再灌注24 h时脑水肿症状严重。与模型对照组比较，依达拉奉组脑组织含水量显著减少[（76.2±1.5）%， P<0.05]。PNE小、中、大剂量组脑组织含水量分别为（79.4±1.1）%、（77.2±1.5）%、（79.0±0.9）%，较模型对照组减少，且PNE中剂量组脑组织含水量低于PNE小、大剂量组（均 P<0.01），与依达拉奉组差异无统计学意义（ P>0.05）。结果提示，马尾松PNE可以减轻CIRI大鼠脑水肿的症状，且中剂量效果最佳。

马尾松PNE对CIRI大鼠脑梗死体积的影响

手术对照组脑组织无梗死；模型对照组脑组织梗死体积为（48.3±6.7）%，较手术对照组显著增大（ P<0.01）；依达拉奉组和PNE小、中、大剂量组脑组织梗死体积分别为（24.3±3.1）%和（35.0±4.2）%、（26.8±3.5）%、（33.9±6.2）%，较模型对照组均明显减小（均 P<0.05），其中PNE中剂量组脑梗死体积显著小于PNE小、大剂量组（均 P<0.05），与依达拉奉组差异无统计学意义（ P>0.05）。各组梗死大体观见 图1。结果提示，马尾松PNE可以减小CIRI大鼠的脑梗死体积，且中剂量效果最佳。

图1 .

各组大鼠脑梗死大体观（TTC染色）

正常组织为红色，梗死组织为白色. 手术对照组脑组织无梗死；模型对照组脑组织梗死体积较手术对照组增大；依达拉奉组和PNE小、中、大剂量组脑组织梗死体积较模型对照组均减小. 标尺=1 cm. PNE：松针提取物.

马尾松PNE对CIRI大鼠大脑皮层及海马CA1区病理学改变的影响

手术对照组大脑缺血侧皮层及海马CA1区域神经细胞核大且细胞胞质充足，未见明显细胞皱缩及组织空洞样网状病理损伤；模型对照组大脑缺血侧皮层及海马CA1区域细胞核深染，细胞整体呈现不规则形状，脑组织水肿明显，存在大量空洞样网状结构；与模型对照组比较，依达拉奉组及PNE各剂量组大脑缺血侧皮层及海马CA1区域神经细胞结构相近，脑组织水肿及空洞样网状病理损伤均改善。见 图2。

图2 .

各组大脑皮层和海马CA1区组织病理学变化（HE染色）

手术对照组大脑皮层和海马CA1区神经细胞核大且胞质充足，未见明显细胞皱缩及组织空洞样网状病理损伤；模型对照组大脑缺血侧皮层和海马CA1区细胞核深染，细胞整体呈现不规则形状，脑组织水肿明显，存在大量空洞样网状结构；依达拉奉组及PNE小、中、大剂量组的大脑皮层和海马CA1区水肿及空洞样网状病理损伤较模型对照组均改善. 标尺=20 μm. PNE：松针提取物.

与手术对照组比较，模型对照组大脑皮层及海马CA1区的正常神经细胞数显著减少；而与模型对照组比较，依达拉奉组、PNE各剂量组皮层和海马CA1区的正常神经细胞数均更多。其中，大脑皮层及海马CA1区正常神经细胞数PNE中剂量组比小、大剂量组显著增加（均 P<0.01），皮层正常神经细胞数PNE中剂量组与依达拉奉组差异无统计学意义（ P>0.05）。见 表1。结果提示，马尾松PNE可减轻CIRI大鼠大脑缺血侧皮层及海马CA1区病理组织损伤，增加正常神经细胞数，且以中剂量效果最佳。因此后续实验选择PNE中剂量组进行机制研究。

表1 各组大脑皮层及海马CA1区正常神经细胞数

Table1 The number of normal nerve cells in cerebral cortex and hippocampal CA1 area in each group

( $\overline{x}\pm s$ , n=6)

组别	皮层	海马CA1区
手术对照组	79.1±8.3	82.3±4.4
模型对照组	11.7±4.0 **	14.5±4.9 **
依达拉奉组	36.9±6.5 **##	58.9±4.0 **##
PNE小剂量组	21.1±6.5 **##△△▲▲	26.7±2.8 **##△△▲▲
PNE中剂量组	33.0±6.2 **##	44.1±4.3 **##△△
PNE大剂量组	24.5±3.7 **##△△▲▲	27.6±6.4 **##△△▲▲

与手术对照组比较， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^## P<0.01；与依达拉奉组比较， ^△△ P<0.01；与PNE中剂量组比较， ^▲▲ P<0.01. PNE：松针提取物.

马尾松PNE对CIRI大鼠大脑皮层神经细胞凋亡率的影响

手术对照组大脑皮层几乎不存在绿色荧光，细胞凋亡率为（0.6±0.2）%，表明正常大脑皮层中较少细胞凋亡。模型对照组缺血侧大脑皮层内绿色荧光与蓝色荧光重叠显示的细胞数多，细胞凋亡率为（79.0±6.2）%，较手术对照组显著增加（ P<0.01）。与模型对照组比较，依达拉奉组和PNE中剂量组缺血侧大脑皮层内绿色荧光与蓝色荧光重叠显示的细胞数减少，凋亡率下降[分别为（34.0±6.7）%和（42.5±5.1）%，均 P<0.01]。见 图3。结果提示，400 mg/kg的马尾松PNE可抑制CIRI大鼠大脑皮层神经细胞凋亡。

图3 .

各组大脑皮层神经细胞凋亡水平

DAPI蓝色荧光为细胞核，Tunel绿色荧光为凋亡细胞，以蓝色荧光与绿色荧光重合细胞记为凋亡细胞. 手术对照组中大鼠大脑皮层几乎不存在绿色荧光，模型对照组中缺血侧大脑皮层内绿色与蓝色荧光重叠显示细胞数较多，依达拉奉组及PNE中剂量组缺血侧大脑皮层绿色荧光相比模型对照组减少. 标尺=20 μm. PNE：松针提取物.

马尾松PNE对CIRI大鼠脑组织氧化应激水平的影响

与手术对照组比较，模型对照组缺血侧脑组织中一氧化氮、丙二醛含量显著增加（均 P<0.01），SOD活性显著降低（ P<0.05）。与模型对照组比较，PNE中剂量组和依达拉奉组缺血侧脑组织中一氧化氮、丙二醛含量显著减少（均 P<0.01），SOD活性显著增加（ P<0.05）。见 表2。结果提示，400 mg/kg的马尾松PNE能减少CIRI大鼠缺血侧脑组织一氧化氮释放和丙二醛含量，提高SOD活性，其可能通过抗氧化发挥脑保护作用。

表2 各组缺血侧脑组织中氧化应激水平

Table2 Oxidative stress level in ischemic side brain tissue in each group

( $\overline{x}\pm s$ )

组别	n	一氧化氮(nmol/mg蛋白)	丙二醛(nmol/mg蛋白)	超氧化物歧化酶(U/mg蛋白)
手术对照组	6	20.8±3.8	13.1±0.8	160.8±17.7
模型对照组	6	45.9±4.0 **	23.1±0.4 **	109.3±8.5 *
依拉达奉组	6	26.6±3.8 ##	16.5±0.8 **##	142.2±15.2 #
PNE中剂量组	6	32.4±2.8 *##	18.0±0.5 **##△	127.8±8.3 *#

与手术对照组比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^# P<0.05， ^## P<0.01；与依达拉奉组比较， ^△ P<0.05. PNE：松针提取物.

马尾松PNE对CIRI大鼠大脑皮层JNK3/caspase-3通路蛋白表达的影响

与手术对照组比较，模型对照组大脑缺血侧皮层组织中caspase-3、细胞色素C蛋白表达显著增加，Bcl-2/Bax比值显著减小，磷酸化JNK3/JNK3比值显著增加；与模型对照组比较，PNE中剂量组和依达拉奉组大脑皮层组织caspase-3、细胞色素C蛋白表达显著减少，Bcl-2/Bax比值显著加大，磷酸化JNK3/JNK3比值显著减小。见 表3、 图4。上述结果提示，马尾松PNE可能通过降低JNK3磷酸化水平，阻碍细胞色素C从线粒体释放，并抑制caspase-3的激活，从而起到拮抗细胞凋亡的作用。

表3 各组缺血侧脑组织中JNK3/caspase-3通路相关蛋白表达比较

Table3 Expression of JNK3/caspase-3 pathway related proteins in each group

( $\overline{x}\pm s$ )

组别	n	caspase-3	细胞色素C	Bcl-2/Bax	磷酸化JNK3/JNK3
手术对照组	4	1.00±0.14	1.03±0.15	0.99±0.05	1.00±0.15
模型对照组	4	1.56±0.18 **	2.52±0.26 **	0.30±0.05 **	2.03±0.14 **
依拉达奉组	4	1.15±0.13 ##	1.29±0.34 ##	0.69±0.11 **##	1.21±0.09 ##
PNE中剂量组	4	1.28±0.11 *#	2.10±0.25 **#△△	0.45±0.06 **##△△	1.63±0.14 **##△△

与手术对照组比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^# P<0.05， ^## P<0.01；与依达拉奉组比较， ^△△ P<0.01. PNE：松针提取物；caspase：胱天蛋白酶；Bcl：B淋巴细胞瘤蛋白；Bax：Bcl-2相关X蛋白；JNK：c-Jun氨基末端激酶.

图4 .

各组JNK3/caspase-3通路相关蛋白表达电泳图

PNE：松针提取物；caspase：胱天蛋白酶；Bcl：B淋巴细胞瘤蛋白；Bax：Bcl-2相关X蛋白；JNK：c-Jun氨基末端激酶.

讨论

本研究选择加水榨汁的提取方式获得马尾松松针粗提物，其中亲水性成分较多，多糖含量超过了50%。本文资料显示，马尾松PNE能显著改善CIRI模型大鼠行为学评分，提示马尾松PNE能有效改善CIRI引发的行为功能损伤，恢复大鼠的行为能力；同时马尾松PNE能显著减少模型大鼠的脑组织含水量及脑梗死体积，减轻缺血侧皮层及海马CA1区病理组织损伤，增加正常神经细胞数，改善病理变化，提示马尾松PNE可能通过减轻脑水肿、减少脑梗死体积起到保护神经细胞的作用。本研究结果为传统医学治疗提供了现代药理学依据。然而目前针对松针治疗脑卒中的具体作用机制仍未明确，极大限制了其在临床中的应用。

本文资料显示，马尾松PNE能显著抑制缺血再灌注脑皮质缺血半影区JNK3的磷酸化，鉴于马尾松PNE对一氧化氮的清除作用和丙二醛释放的抑制作用以及对提高SOD活性的作用，推测马尾松PNE可能通过其抗氧化作用进而抑制JNK信号通路来保护神经细胞。JNK3信号通路包括c-jun和Fas-L等核底物的诱导、Bcl-2家族成员等非核底物的诱导和细胞色素C的释放 ^{[ 23- 24]} 。当发生脑缺血再灌注时，活化的JNK3诱导c-Jun磷酸化，增强Fas-L表达，Fas-L与Fas结合后进一步激活Bcl-2家族，打开调控线粒体膜通透性的转运孔，细胞色素C通过线粒体外膜释放到细胞质中，与细胞质中的凋亡蛋白酶活化因子结合引发caspase蛋白酶级联反应，激活下游caspase-3，诱发细胞凋亡 ^[25] 。因此通过蛋白质印迹法检测马尾松PNE对CIRI大鼠大脑皮层组织JNK3、磷酸化JNK3、Bax、Bcl-2、细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平的影响。与手术对照组比较，模型对照组磷酸化JNK3/JNK3比值、细胞色素C、caspase-3蛋白表达均显著增加，Bcl-2/Bax比值显著减少，可见CIRI导致促凋亡因子的释放，进一步激活了细胞凋亡程序。与模型对照组比较，PNE中剂量组的磷酸化JNK3/JNK3比值、细胞色素C、caspase-3蛋白表达均显著减少，Bcl-2/Bax比值显著增加，可见马尾松PNE通过降低模型鼠脑内JNK3的磷酸化水平，抑制caspase-3的激活，拮抗细胞凋亡的发生，起到保护神经细胞的作用。

综上所述，马尾松PNE对大鼠CIRI具有一定的保护作用，其机制可能与清除一氧化氮和丙二醛、抑制JNK3/caspase-3信号转导从而减少神经细胞的凋亡有关。但马尾松PNE包含多种有效成分，在预防和治疗CIRI时可能发挥多成分多靶点协同作用的药效机制。后续将进一步对马尾松PNE进行分离纯化，明确不同成分的药效，并深入验证其预防和治疗CIRI的机制，为马尾松PNE开发为预防和治疗中风药物提供更多理论依据。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（81573643）; 浙江省自然科学基金（LY20H280010，LY22H280010）; 浙江中医药大学校级科研项目（2021ZY14）