补阳还五汤激活PI3K -AKT通路促进氧糖剥夺再灌注损伤的脑微血管内皮细胞血管生成

Abstract

目的：

探讨补阳还五汤促进氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损伤的大鼠脑微血管内皮细胞（RBMEC）血管生成的机制。

方法：

RBMEC经补阳还五汤含药血清孵育24 h后，构建OGD/R细胞损伤模型。将细胞随机分为正常对照组、模型对照组、补阳还五汤组（给予补阳还五汤含药血清）和LY294002组[给予补阳还五汤含药血清前使用磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002预处理1 h]。采用CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell迁移实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移和形成管腔能力。蛋白质印迹法检测PI3K、蛋白激酶B（AKT）、低氧诱导因子（HIF）-1α及血管内皮生长因子（VEGF）等蛋白的表达。

结果：

与模型对照组比较，补阳还五汤组RBMEC存活率、迁移能力及管腔形成能力显著增强（均 P<0.01），磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达增加（均 P<0.05），而LY294002可阻断上述效应。

结论：

补阳还五汤含药血清可促进OGD/R损伤的RBMEC血管生成，其机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路上调HIF-1α和VEGF表达有关。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）;蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）;大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cell，RBMEC）;氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation reperfusion，OGD/R）;细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）;血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）;甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）;增强型化学发光剂（enhanced chemiluminescence，ECL）;低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）;

缺血性脑卒中是成年人致死、致残的主要原因之一。目前，溶栓治疗和血管内机械取栓是临床治疗急性缺血性脑卒中的有效方法，但治疗时间窗窄、受益率低，且溶栓治疗存在出血转化等副作用。临床研究发现，梗死周边区新生血管增加，缺血性脑卒中患者的生存时间延长 ^[1] 。促进脑缺血后血管生成有助于神经功能恢复 ^[2] 。因此，采用药物刺激缺血后血管生成是脑缺血治疗的一个有效策略。

补阳还五汤是中医治疗脑缺血及其后遗症的代表方剂。前期体内研究发现，补阳还五汤能促进脑缺血后神经发生、血管生成及神经功能恢复 ^{[ 3- 4]} ；体外研究发现，补阳还五汤可上调miRNA-210促进血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成 ^[5] 。但补阳还五汤促血管生成的具体机制尚未明确。PI3K-AKT是细胞内重要的信号转导通路，介导内皮细胞增殖、迁移和存活，在血管生成中发挥重要作用 ^{[ 6- 7]} 。本研究通过RBMEC的OGD/R模型观察补阳还五汤对OGD/R损伤RBMEC血管生成的作用及可能机制。

材料与方法

动物、试剂和仪器

无特定病原体级SD大鼠，雄性，3~4月龄，体重250~300 g， 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[许可证号SCXK（沪）2013-2016]。大鼠饲养于浙江中医药大学实验动物中心[使用许可证号SYXK（浙）2013-0184]，环境温度（22±2）℃，相对湿度40%~60%，12 h/12 h明暗循环，自由进食和饮水。本研究通过浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审查（IACUC-20190408-03）。

RBMEC购自青旗（上海）生物技术发展有限公司；DMEM高糖培养基、优级胎牛血清为美国Gibco公司产品；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙二酸、青霉素-链霉素溶液为杭州吉诺生物医药技术有限公司产品；CCK-8试剂盒为美国Glpbio公司产品；Matrigel基质胶为美国BD公司产品；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒、BCA试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；兔多抗VEGF及鼠单抗GAPDH抗体为美国Santa Cruz公司产品；兔多抗PI3K、磷酸化PI3K、AKT、磷酸化AKT及HIF-1α抗体为美国CST公司产品；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；ECL试剂盒为美国Millipore公司产品；LY294002为美国Selleck公司产品。

二氧化碳培养箱（3111）为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；超净工作台（SW-CJ -1FD）为苏州净化设备有限公司产品；倒置相差显微镜（DMIL）为德国Leica公司产品；全自动酶标仪（Infinite 200 pro）为瑞士Tecan公司产品；垂直电泳转膜系统（PowerPac ^TM Basic）和化学发光凝胶成像系统（FluorChem Q）为美国Bio-Rad公司产品；缺氧小室（27311）为美国STEMCELL Technologies公司产品。

补阳还五汤提取液的制备

补阳还五汤原方来源《医林改错》，由黄芪120 g、当归6 g、川芎4.5 g、赤芍4.5 g、地龙3 g、红花3 g、桃仁3 g组成。中药饮片购自浙江中医药大学中医门诊部，补阳还五汤制备方法参照文献 [4]。以上饮片加入10倍量蒸馏水，浸泡60 min， 回流提取60 min， 倒出药液，残渣再加入8倍量蒸馏水，回流提取60 min， 合并两次药液，用旋转蒸发仪浓缩，浓缩为含生药2 g/mL药液。

补阳还五汤含药血清的制备

30只SD大鼠随机分为两组，每组15只。其中一组按13 g/kg灌胃 ^[4] ，另一组给予等量等渗氯化钠溶液，每天2次，连续灌胃3 d， 末次灌胃2 h后腹主动脉取血；室温静置2 h，1690× g离心15 min后，收集上层血清，分别获得空白血清和补阳还五汤含药血清。血清经56℃水浴灭活30 min， 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，–20 ℃保存备用。

RBMEC培养

RBMEC采用含10%胎牛血清、100 U/mL青-链霉素的DMEM高糖培养液，置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养。每两天更换1次培养液，待细胞生长融合至90%左右时传代。

RBMEC分组及OGD/R模型建立

将细胞随机分为正常对照组、模型对照组、补阳还五汤组、LY294002组。待细胞生长融合至70%左右，正常对照组和模型对照组给予空白血清，补阳还五汤组给予补阳还五汤含药血清，LY294002组在给予补阳还五汤含药血清前使用PI3K抑制剂LY294002预处理1 h。各组孵育24 h后，磷酸盐缓冲液洗涤2次。除正常对照组外，更换为DMEM无糖培养基进行OGD/R处理。具体方法参照文献 [8]：将细胞置于缺氧小室中，通入二元混合气（95%氮气+5%二氧化碳）通气15 min充分置换空气后，夹闭缺氧小室并将其置于培养箱内；氧糖剥夺6 h后更换为DMEM完全培养基，复氧复糖培养24 h后即建立OGD/R损伤模型。正常对照组用DMEM完全培养基于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养相同时间。

CCK-8法检测细胞存活率

将RBMEC以1×10 ⁴个/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL。经OGD/R处理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱内培养约2 h后，于450 nm波长处检测吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（各组吸光度值－空白孔吸光度值）/（正常对照组吸光度值－空白孔吸光度值）×100%。实验重复三次，每组设置五个复孔。

细胞划痕实验检测组织愈合能力

将RBMEC以5×10 ⁵个/mL密度接种于六孔板，每孔2 mL。经OGD/R处理后，用200 μL无菌枪头于每个孔内垂直划三条直线，用磷酸盐缓冲液洗去划下的细胞碎片，更换为不含血清DMEM培养液，孵育24 h后，固定检测点取样拍照。用ImageJ图像软件测量划痕面积，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（初始划痕面积－残存划痕面积）/初始划痕面积×100%。实验重复三次，每组设置三个复孔。

Transwell迁移实验检测细胞迁移能力

消化收集各组细胞，用不含血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度，取150 μL细胞悬液（4×10 ⁵个/mL）接种于小室，下室加入600 μL含10%胎牛血清DMEM完全培养基。培养箱内孵育24 h后，4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1%结晶紫室温染色20 min， 用湿润的棉签轻轻拭去小室内侧未迁移的细胞，晾干。倒置显微镜下拍照并计迁移细胞数。实验重复三次，每组设置三个复孔。

管腔形成实验检测血管生成能力

消化收集各组细胞，用不含血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度，将细胞悬液按3×10 ⁴个/孔接种至预先铺有Matrigel基质胶的96孔板中。培养箱内孵育6 h后，倒置显微镜下观察细胞成管情况，每孔随机选取5个视野拍照。用ImageJ图像软件分析管腔数。实验重复三次，每组设置三个复孔。

蛋白质印迹法检测相关蛋白表达

消化收集各组细胞，加入RIPA裂解液，离心取上清液，按照BCA试剂盒测定总蛋白含量。各组蛋白样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加入兔抗磷酸化PI3K/PI3K抗体（1∶1000）、兔抗磷酸化AKT/AKT抗体（1∶1000）、兔抗HIF-1α抗体（1∶800）、兔抗VEGF抗体（1∶1000），鼠抗GAPDH抗体（1∶1000）4℃孵育过夜。TBST洗膜三次后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1∶2000），羊抗鼠二抗（1∶2000），室温孵育2 h。经ECL显色后于Bio-Rad成像分析系统显影。采用ImageJ软件分析条带灰度值。

统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。正态分布的计量数据以均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。

结果

补阳还五汤提高OGD/R损伤RBMEC存活率

当补阳还五汤含药血清浓度为1.0%、2.5%、5.0%时，细胞存活率较模型对照组显著提高，其中含药血清浓度为2.5%时效果最佳，见 图1。因此，本研究后续实验均采用2.5%的补阳还五汤含药血清浓度。与模型对照组比较，补阳还五汤组细胞存活率显著提高；与补阳还五汤组比较，LY294002组细胞存活率显著下降。见 表1。结果提示，补阳还五汤可以保护OGD/R造成的细胞损伤，此效果可被LY294002阻断。

图1 .

不同浓度补阳还五汤含药血清处理后各组RBMEC存活率比较( n=5)

与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与2.5%含药血清浓度比较， #P<0.05. RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞.

表1 各组RBMEC存活率、划痕愈合率、迁移细胞数及管腔形成数比较

Table1 RBMECs survival rate, scratch healing rate, number of migrated cells and number of tube formation in each group

( $\overline{x}\pm s$ )

组别	n	细胞存活率(%)	划痕愈合率(%)	迁移细胞数	管腔形成数
正常对照组	5	100.00±2.85	84.42±5.17	255.06±14.96	40.67±5.97
模型对照组	5	63.20±1.93 **	52.64±3.06 **	103.00±19.52 **	7.73±3.56 **
补阳还五汤组	5	83.58±3.54 **##	73.13±5.22 **##	158.38±13.84 **##	25.33±6.26 **##
LY294002组	5	61.01±0.42 **△△	50.99±6.75 **△△	107.44±23.96 **△△	10.93±4.04 **△△

与正常对照组比较， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^## P<0.01；与补阳还五汤组比较， ^△△ P<0.01. RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞.

补阳还五汤促进OGD/R损伤RBMEC划痕愈合

孵育24h后，模型对照组划痕面积比正常对照组增大；补阳还五汤组划痕面积比模型对照组减小；而LY294002组RBMEC划痕面积比补阳还五汤组增大。见 图2和 表1。结果提示，补阳还五汤可以促进OGD/R损伤RBMEC划痕愈合，此作用可被LY294002阻断。

图2 .

各组RBMEC划痕愈合比较

24 h时，与正常对照组比较，其他各组划痕面积均增大；与模型对照组比较，补阳还五汤组划痕面积减小；而LY294002组划痕面积比补阳还五汤组增大. 标尺=200 μm. RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞.

补阳还五汤促进OGD/R损伤RBMEC迁移

与正常对照组比较，模型对照组RBMEC迁移数减少；与模型对照组比较，补阳还五汤组RBMEC迁移数增多；而LY294002组RBMEC迁移数比补阳还五汤组减少。见 图3和 表1。结果提示，补阳还五汤可以促进OGD/R损伤的RBMEC迁移，此作用可被LY294002阻断。

图3 .

各组RBMEC迁移细胞数比较

与正常对照组比较，其他各组RBMEC均减少；与模型对照组比较，补阳还五汤组RBMEC增加；与补阳还五汤组比较，LY294002组RBMEC减少. 标尺=100 μm. RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞.

补阳还五汤促进OGD/R损伤RBMEC形成管腔

与正常对照组比较，模型对照组RBMEC形成管腔数显著减少；与模型对照组比较，补阳还五汤组RBMEC形成管腔数增加；与补阳还五汤组比较，LY294002组RBMEC形成管腔数减少。见 图4和 表1。结果提示，补阳还五汤可以促进OGD/R损伤的RBMEC形成管腔，此作用可被LY294002阻断。

图4 .

各组RBMEC形成管腔比较

正常情况下，单个分散的RBMEC在适合的基底上互相趋近，最终形成环状结构. 与正常对照组比较，模型对照组趋近细胞数及环状结构减少；与模型对照组比较，补阳还五汤组趋近细胞数及环状结构增加；而LY294002组趋近细胞数及环状结构比补阳还五汤组减少. 标尺=100 μm. RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞.

补阳还五汤促进OGD/R损伤RBMEC磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达

与正常对照组比较，模型对照组PI3K和AKT磷酸化水平降低，HIF-1α表达量增加，VEGF表达量减少（均 P<0.05）；与模型对照组比较，补阳还五汤组PI3K和AKT磷酸化水平升高，HIF-1α和VEGF蛋白表达量增加（均 P<0.05）；与补阳还五汤组比较，LY294002组PI3K和AKT磷酸化水平降低，HIF-1α和VEGF蛋白表达量减少（均 P<0.05）。见 图5和 表2。结果提示，补阳还五汤可激活OGD/R损伤RBMEC中PI3K-AKT信号通路，促进HIF-1α和VEGF蛋白表达，从而促进血管生成，此作用可被LY294002阻断。

图5 .

各组RBMEC中磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α、VEGF蛋白表达电泳图

RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞；PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；AKT：蛋白激酶B；HIF：低氧诱导因子；VEGF：血管内皮生长因子；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

表2 各组RBMEC磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较

Table2 Protein expression levels of p-PI3K, p-AKT, HIF-1α and VEGF in RBMECs in each group

( $\overline{x}\pm s$ )

组别	n	磷酸化PI3K/PI3K	磷酸化AKT/AKT	HIF-1α	VEGF
正常对照组	3	1.00±0.17	1.00±0.17	1.00±0.37	1.00±0.18
模型对照组	3	0.48±0.05 **	0.56±0.13 **	1.72±0.18 *	0.70±0.12 *
补阳还五汤组	3	0.80±0.11 #	0.85±0.09 #	2.45±0.21 #	0.98±0.13 #
LY294002组	3	0.57±0.08 △	0.43±0.19 △△	1.07±0.43 △△	0.63±0.14 △

与正常对照组比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^# P<0.05；与补阳还五汤组比较， ^△ P<0.05， ^△△ P<0.01. RBMEC：大鼠脑微血管内皮细胞；PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；AKT：蛋白激酶B；HIF：低氧诱导因子；VEGF：血管内皮生长因子.

讨论

补阳还五汤是中医治疗缺血性脑卒中的代表方剂。前期体内研究发现，补阳还五汤促进脑缺血后血管生成，改善缺损的神经功能 ^{[ 3- 4]} ；体外研究发现，补阳还五汤可以促进正常培养的人脑微血管内皮细胞血管生成 ^[5] 。本文资料显示，补阳还五汤含药血清促进OGD/R损伤的RBMEC增殖、迁移和管腔形成，进一步通过体外实验证实补阳还五汤可以促进缺血再灌注损伤血管生成。本研究采用LY294002抑制PI3K-AKT信号通路后，补阳还五汤促进RBMEC增殖、迁移和管腔形成的作用被抑制，同时HIF-1α和VEGF蛋白表达下降。

血管生成在缺血性脑卒中后脑组织修复中发挥至关重要的作用，可使受损脑组织重新获得氧气与血供，恢复细胞代谢和功能 ^{[ 2， 9]} 。本研究考察了不同浓度补阳还五汤含药血清（10.0%、5.0%、2.5%、1.0%）对OGD/R损伤RBMEC存活率的影响，结果表明2.5%补阳还五汤含药血清促进OGD/R损伤RBMEC血管生成的效果最佳，这与前期报道10%补阳还五汤含药血清促进正常培养的人脑微血管内皮细胞血管生成效果最佳不一致 ^[5] ，可能是由于不同状态下不同细胞对药物的敏感性存在差异。此外，中药含药血清浓度与药效强弱的关系复杂，并非呈平行关系 ^[10] 。血管生成是一个涉及多细胞、多步骤的复杂过程，主要包括内皮细胞的激活、增殖、迁移、管腔形成和成熟等步骤，受多种促血管生成因子的调节，其中VEGF发挥了最重要的作用 ^[11] 。VEGF与VEGF受体2结合可促进内皮细胞增殖和迁移并形成新的血管。大量文献报道，VEGF可促进缺血性脑卒中后神经发生、血管生成和神经功能恢复 ^{[ 12- 13]} 。HIF-1α是细胞和机体应对低氧环境的关键转录因子，可以上调VEGF表达并促进血管生成。大量研究也已证实，上调OGD/R损伤的脑微血管内皮细胞中HIF-1α和VEGF表达可促进血管生成 ^{[ 14- 16]} 。前期研究发现，补阳还五汤含药血清可上调VEGF和VEGF受体2蛋白表达，促进人脑微血管内皮细胞血管生成 ^[5] 。本研究结果进一步发现补阳还五汤含药血清可以上调OGD/R损伤RBMEC中HIF-1α和VEGF蛋白表达，促进血管生成。

PI3K-AKT信号通路参与细胞增殖、凋亡、迁移和代谢等多种生理和病理生理过程。体内外研究证实，PI3K-AKT信号通路在脑缺血损伤保护中发挥重要作用 ^{[ 17- 18]} 。有文献报道补阳还五汤可通过激活PI3K-AKT信号通路减轻脑缺血后神经细胞凋亡，改善神经功能 ^{[ 19- 20]} 。此外，激活PI3K-AKT信号通路可促进内皮细胞生长，增加血管通透性和内皮细胞迁移，促进血管生成 ^{[ 6- 7]} 。研究发现，补阳还五汤通过激活PI3K-AKT信号通路促进小鼠心肌梗死和后肢缺血后血管生成 ^{[ 21- 22]} ，以及脑出血模型小鼠的血管生成 ^[23] 。然而，补阳还五汤是否可通过激活PI3K-AKT信号通路促进脑缺血后血管生成尚不清楚。本文资料显示，补阳还五汤含药血清显著上调PI3K和AKT磷酸化水平，促进OGD/R损伤的RBMEC增殖、迁移和管腔形成。低氧条件下，PI3K-AKT通路可激活HIF-1α，从而上调VEGF等血管生成相关蛋白表达，促进血管生成 ^[6] 。Gu等 ^[24] 发现整合素-1可激活PI3K-AKT信号通路并上调HIF-1α表达，从而促进OGD/R损伤内皮细胞血管生成，而阻断PI3K-AKT通路可抑制血管生成 ^[25] 。进一步研究发现，PI3K抑制剂LY294002可以抑制磷酸化PI3K、磷酸化AKT表达，同时抑制HIF-1α、VEGF表达和RBMEC血管生成。上述结果表明，补阳还五汤可能通过激活PI3K-AKT通路上调HIF-1α和VEGF表达，从而发挥促血管生成作用。

综上所述，本文资料证实补阳还五汤可以促进OGD/R损伤RBMEC血管生成，机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路促进HIF-1α和VEGF表达有关。该研究结果为临床应用补阳还五汤治疗脑缺血提供了实验依据。但补阳还五汤激活PI3K-AKT信号通路促进HIF-1α和VEGF表达的药效物质基础和作用机制还有待进一步研究。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（81073075）; 浙江省自然科学基金（LY22H280009）; 浙江中医药大学校级科研基金项目（2019ZY20，2021JKZC01）