T淋巴细胞体外发育方法的研究进展

Abstract

T淋巴细胞（简称T细胞）在细胞过继免疫治疗（ACT）中发挥重要作用，利用T细胞体外发育方法可获得来源稳定且获取简便的T细胞，相比从自体或同种异体组织分离得到T细胞的传统方法更有优势。目前T细胞体外发育方法有胎儿胸腺器官培养、重组胸腺器官培养和Notch信号驱动的二维培养三种。其中胎儿胸腺器官培养操作简便，离体胸腺在体外培养即可支持T细胞分化发育至成熟，但完整的胸腺导致培养物维持时间有限、细胞收获困难；重组胸腺器官培养将各类胸腺基质细胞分散再重组构建三维培养环境，在体内外实验中均可支持T细胞成熟，但生物材料和三维环境导致培养物维持时间和细胞产量均受限；Notch信号驱动的二维培养采用人工呈递Notch信号通路配体来驱动T细胞分化发育，培养体系结构简单且稳定，但仅能支持T细胞发育至早期未成熟阶段。本文综述了上述培养方法的研究进展和不足之处，并讨论了T细胞体外发育未来发展的要求和方向，以助力ACT的推广和应用。

细胞过继免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy, ACT）;嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）;T细胞受体（T cell receptor, TCR）;移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD）;胸腺上皮细胞（thymic epithelial cell, TEC）;主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）;自身免疫调节因子（autoimmune regulator, Aire）;Fez家族锌指蛋白（Fez family zinc finger, Fezf）;组织特异性抗原（tissue specific antigen, TSA）;δ样经典Notch配体（delta like canonical Notch ligand, DLL）;诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）;

T淋巴细胞（以下简称T细胞）是机体适应性免疫的重要组成部分，在对抗肿瘤细胞时发挥着重要作用，基于T细胞的ACT疗法也在肿瘤治疗中取得了巨大进展。目前该疗法主要包括肿瘤浸润淋巴细胞疗法、CAR-T细胞疗法和TCR工程T细胞疗法 ^{[ 1- 2]} 。肿瘤浸润淋巴细胞疗法中使用的T细胞来源于肿瘤组织，这种T细胞通常数量较少，且只有对肿瘤抗原具有高度亲和力的T细胞才具有治疗潜力。随着T细胞工程的发展，出现了CAR-T细胞疗法和TCR工程T细胞疗法。这两种疗法首先需要收集患者或健康供体外周血中的淋巴细胞，然后对T细胞进行基因工程改造以增加其特异性抗肿瘤能力，改造成功的T细胞在体外进一步扩增，才能输入患者体内进行治疗。

近年来基于T细胞的ACT疗法在临床上的应用日渐成熟，治疗范围包括实体瘤 ^{[ 3- 5]} 和非实体 瘤 ^{[ 6- 7]} ， 如B细胞淋巴瘤和急、慢性白血病等。虽然选择自体T细胞进行基因工程改造是过继移植最安全的策略，但由于肿瘤患者经过化疗后体内淋巴细胞数大量减少，且接受ACT的肿瘤患者大多处于肿瘤晚期，肿瘤细胞在患者体内会发生免疫逃避 ^[8] ，T细胞可能对肿瘤抗原产生免疫耐受，因此获得有价值自体T细胞的难度大大增加。使用同种异体T细胞代替自体T细胞是一种有效规避上述风险的解决手段 ^[9] ，既能保证T细胞数充足，又能避免对肿瘤细胞表面抗原免疫耐受T细胞的干扰，但异体T细胞移植有发生GVHD的风险 ^[10] 。因此，利用T细胞体外培养方法生产通用型T细胞产品成为临床上推广ACT的关键驱动力。本文综述了目前常见T细胞体外培养方法的发展背景、最新进展以及当前的局限性，并结合ACT应用情况讨论了T细胞体外培养进一步发展的要求和方向。

T细胞的体内发育

在T细胞的自然发育过程中，胸腺发挥了支持T细胞分化、增殖、发育和驯化等作用，T细胞的完整发育可概括为三个阶段，即 TCR基因重组、阳性选择和阴性选择。骨髓来源的前T细胞进入胸腺后，首先进行 TCR基因重组，这个过程伴随着 T细胞的迅速扩增，产生大量拥有不同TCR结构的双阳性T细胞，之后主要由胸腺基质细胞中的皮质TEC和髓质TEC对T细胞进行阳性选择和阴性选择。

皮质TEC位于胸腺浅层的皮质区，主要参与对双阳性T细胞的阳性选择，目的是让T细胞获得MHC限制性，即保证TCR的功能完整。在此选择过程中，双阳性T细胞首先利用TCR识别并结合皮质TEC表面呈递了抗原肽的MHC复合物，之后进一步分化为CD8单阳性T细胞和CD4单阳性T细胞，而无法识别的T细胞则发生凋亡。此外，皮质TEC还能够合成并分泌促进前T细胞向胸腺趋化定植以及促进T细胞发育所必需的细胞因子和生长因子 ^[11] 。

髓质TEC位于胸腺深层髓质区，主要参与对单阳性T细胞的阴性选择，这也是形成中枢免疫耐受的关键 ^[12] 。髓质TEC中表达一些特殊的转录调控因子 ^{[ 13- 14]} ，包括Aire和Fezf2，可以调控 TSA基因在髓质TEC内异位表达，之后TSA会被酶解成小分子抗原肽并与MHC分子结合，最终以抗原肽-MHC复合物的形式呈递在髓质TEC表面或胸腺树突细胞表面。若单阳性T细胞表面的TCR以高亲和力识别并结合这些抗原肽-MHC复合物，T细胞就会被诱导发生凋亡；以低亲和力结合的T细胞则分化成为调节性T细胞 ^[15] ；只有不识别这些复合物的T细胞才能通过选择并发育为成熟T细胞。这一过程最终目的是驯化T细胞，并保证输送至机体外周的成熟T细胞不会攻击自身正常组织细胞，因此被称作阴性选择。

T细胞的体外发育方法

胎儿胸腺器官培养

胎儿胸腺器官培养是最早被开发用于体外支持T细胞培养的方法。Robinson等 ^[16] 认为维持胸腺本身的三维结构有利于TEC的培养和T细胞发育，研究者从孕 14~15 d母鼠体内剥离获取胎鼠胸腺并将其置于核孔滤膜上，再将胸腺与滤膜转移至培养基中，让滤膜漂浮在液面上进行离体器官体外培养，这就是胎儿胸腺器官培养物的基本结构组成。此时的胸腺已经具备支持T细胞发育的功能，且胸腺中已经充盈淋巴前体细胞，同时其体积也适宜体外培养；最终实验结果也证实了T细胞可以在其中发育成熟。基于此，胎儿胸腺器官培养成为研究T细胞发育的主要体外培养方法，并不断发展。由于化合物脱氧鸟苷对T细胞有特异性细胞毒性 ^[17] ，研究者在常规培养基成分中添加脱氧鸟苷，成功获得了淋巴细胞耗竭且胸腺功能保留的“空载”胸腺 ^[18] 。该“空载”胸腺可以被来源于其他鼠种供体的造血干细胞重新定植，成为体外研究T细胞耐受性和MHC限制的绝佳平台。

胎儿胸腺器官培养中完整的胸腺器官培养物仅需要少量的培养基和试剂，且操作简易，因此被广泛应用于研究T细胞的体外发育和分化，如研究细胞因子对T细胞发育或胸腺发育的影响 ^{[ 19- 21]} 。但其劣势也比较明显：由于使用了相对完整的器官结构，器官离体后会逐渐丧失功能，导致胎儿胸腺器官培养物维持时间短暂；完整的器官结构加大了从中收获T细胞的难度，导致T细胞的分化发育潜能难以量化；胸腺的获取过程会造成严重的侵入性伤害。因此，这种依赖于完整胸腺结构的方法几乎不可能实现临床转化。

重组胸腺器官培养

生物工程技术的快速发展推动了T细胞体外发育方法进一步发展。胎儿胸腺器官培养中的完整胸腺结构通过酶解分散至单细胞水平，采用磁分选、流式分选等手段分离其中的不同基质成分（包括上皮细胞、淋巴祖细胞以及间充质细胞），得到的基质成分按不同比例自由组合并离心，获得的细胞聚集体在悬挂的液滴或胎儿胸腺器官培养物的基本结构中培养，这些培养物同样拥有支持T细胞发育的能力 ^{[ 22- 24]} 。这种方法称为重组胸腺器官培养，可用于研究各个基质成分在维持胸腺功能或支持胸腺发育中的作用。如Anderson等 ^[25] 通过重组胸腺器官培养研究胸腺间充质细胞和上皮细胞在T细胞发育过程的作用，结果表明胸腺间充质细胞主要在T细胞发育早期发挥作用，且这种作用可以被其他细胞（如3T3成纤维细胞系）代替，而TEC主要在T细胞发育的后期阶段发挥作用，包括阳性选择和阴性选择。

因此，要在体外完整模拟胸腺的功能，胸腺间充质细胞和TEC都是不可或缺的。但TEC在体外二维平面培养的过程中会丢失Aire、Fezf2等重要功能分子的表达 ^{[ 26- 27]} ，因此找到适合TEC培养的三维环境是这一方法的关键。Poznansky等 ^[28] 尝试利用钽涂层碳基质作为人工支架进行体外胸腺培养，先将小鼠胸腺碎片植入其中，再加入人单核细胞，结果显示人工支架不仅可以保留小鼠胸腺碎片中TEC的细胞功能，还可以支持单核细胞进一步分化。实际上，钽是一种生物相容性极佳的金属 ^[29] ，有研究报道了利用钽制成的生物相容性材料在体内修复骨损伤的临床治疗案例 ^[30] 。此外，用水凝胶 ^{[ 31- 32]} 和胶原蛋白 ^[33] 构建的体外三维TEC聚集体可以维持TEC的功能分子特征。

虽然人工支架为细胞培养构建了三维环境，但忽略了原器官细胞外基质中复杂的有机物构成。胸腺组织的细胞外基质由大量天然蛋白质组成，在确定TEC形态、功能和支持T细胞发育等方面都起到关键作用 ^{[ 33- 35]} 。这种源自哺乳动物的天然材料，具有生物降解性、生物相容性、生物吸收性和低免疫原性等优点，容易获取，且与内源性组织非常相似 ^[36] ，应用于体外培养能更有利于维持TEC的功能和支持T细胞发育。在此基础上发展而来的脱细胞胸腺支架可以更大程度地重现胸腺功能 ^[37] ，可以在保留胸腺天然结构和细胞外基质的前提下清除原本的细胞成分 ^{[ 38- 40]} ，再按需向支架内填充基质细胞成分（包括TEC、淋巴祖细胞和间充质细胞）。脱细胞胸腺支架不仅可以在体外维持细胞活性超过3周，可支持T细胞生成，还能够在移植至无胸腺裸鼠体内后有效诱导依赖于 T细胞的体液免疫和细胞免疫。此外，脱细胞胸腺支架还可以通过填充受体和供体的TEC混合物，将其移植至受体内，以诱导受体对供体来源同种异体移植物的耐受性。但在获得脱细胞胸腺支架的过程中，其有效物质会出现不可避免的损耗，且这种损耗无法精确量化，导致无法估算支架功能的保留程度。

重组胸腺器官培养物中能够加入不同的胸腺基质成分，因此该方法既可用于研究各类基质成分在维持胸腺功能中的具体作用，也可通过简单地添加抗体、细胞因子等成分来研究该成分在T细胞发育中的作用。此外，重组胸腺器官培养物还可移植入裸鼠体内，使其恢复部分基于T细胞的免疫功能，应用范围更加广泛。但由于拆解胸腺会破坏其天然结构，重建也只是将不同的细胞进行简单的随机重组，无法完全模拟原始器官结构，很可能会影响其支持T细胞发育的功能。另外，重组胸腺器官培养中还存在与胎儿胸腺器官培养相同的缺陷，包括培养物依赖于原代胸腺组织成分，以及收获T细胞时会破坏培养物结构，导致其无法长时间维持。另外，培养物模拟了体内T细胞发育的三维结构，由于要保证其中所有细胞都能够与外界进行物质交换，所以培养物的体积也受到限制，导致T细胞产量受限，临床转化依旧很难实现。

Notch信号驱动的二维培养

胎儿胸腺器官培养和重组胸腺器官培养中都强调利用原代胸腺组织成分和三维环境来保证 T细胞的完整发育，由于原代生物材料难以获取，三维环境不利于T细胞收获，这两种方法都难以实现临床转化。因此T细胞体外发育方法的进一步发展必须摆脱对胸腺成分和三维环境的依赖。与T细胞不同的是，B淋巴细胞（简称B细胞）可以在骨髓基质细胞系的支持下，通过简单的二维培养实现分化发育，而且多种骨髓基质细胞系都具有这种支持功能 ^[41] 。其中OP9骨髓基质细胞系存在巨噬细胞集落刺激因子（促进造血干细胞向髓系干细胞分化）的分泌缺陷 ^[42] ，因此可以促进造血干细胞向淋巴系干细胞的分化发育，且仅支持向B细胞分化发育。基于此，结合T细胞发育过程中Notch信号通路作用机制的研究 ^{[ 43- 45]} ，Schmitt等 ^[46] 在OP9骨髓基质细胞系中转导表达Notch信号通路配体DLL1，获得稳定的OP9-DL1细胞系，并与小鼠胎肝来源的造血干细胞共培养，发现OP9-DL1细胞系可以在体外二维环境下支持造血干细胞向T细胞分化发育。造血干细胞经历了 TCR基因重组和阳性选择，最终发育为双阳性T细胞、部分功能成熟的CD8 ⁺ T细胞以及少量CD4 ⁺ T细胞。另外，OP9-DL1共培养方法也成功应用于人类T细胞的体外分化发育中 ^{[ 47- 48]} ，这打破了一直以来的固有观念，即T细胞的分化发育依赖于胸腺三维环境中的细胞相互作用 ^{[ 49- 50]} 。

进一步研究发现，在二维培养中TEC逐渐丢失的关键功能分子包括DLL1和DLL4，这些配体参与的Notch信号通路在T细胞命运抉择中发挥了关键作用 ^{[ 26， 51]} ，这也是二维培养环境下TEC无法支持T细胞发育的主要原因。将DLL1或DLL4转导至除OP9骨髓基质细胞系以外的其他骨髓衍生基质细胞系中，或转导至部分成纤维细胞中 ^[52] ，转导后的细胞同样可以支持T细胞体外分化发育 ^{[ 53- 56]} 。但需要注意的是，Notch配体仅在被固定时才能发挥激活Notch信号通路的作用 ^[44] ，溶液中可溶性Notch配体甚至会对T细胞的分化发育产生抑制作用 ^[57] 。因此，选择适当的方式人工呈递Notch配体，如使用链霉亲和素-生物素结合和抗体-抗原偶联的方法将Notch配体DLL4与磁性微珠结合，获得的DLL4功能化微珠与造血干细胞共培养 ^[58] ，或将DLL1作为铺板试剂固定于细胞培养板底 部 ^{[ 59- 60]} ， 均可有效支持T细胞的分化发育。由于缺乏表达MHC的支持细胞，造血干细胞仅能分化至早期双阳性T细胞阶段。

通过基质细胞转导或人工呈递的方式将Notch配体与前T细胞共培养，可以有效支持T细胞的体外分化发育，兼具重复性好和支持多种干细胞来源分化等优点。但其也存在一定局限性。首先，无论是基质细胞转导或人工呈递Notch配体，培养物都无法同时表达两类MHC的基质细胞，因此这种方法仅能支持前T细胞分化发育至CD8 ⁺ T细胞 ^[61] 或双阳性T细胞阶段。虽然有研究观察到少量CD4 ⁺ T细胞产生，但这可能是未成熟T细胞之间的相互作用介导了一定程度的阳性选 择 ^[62] 。 其次，DLL1和DLL4都需要人工重组合成，生产成本较高。最后，培养物无法对T细胞进行阴性选择，主要原因在于其缺少髓质TEC成分。

上述三种T细胞体外发育方法的特征、优势以及局限性总结见 表1。

表1 细胞体外发育方法的特征、优势及局限性

Table1 Features, advantages and limitations of in vitro T cell development methods

培养方法及体系构成	发育阶段	优 势	局限性	技术特点
胎儿胸腺器官培养：胎儿胸腺器官培养物 [ 16， 18]	TCR基因重组-阳性选择-阴性选择	胸腺结构完整, 支持T细胞 的完整发育；操作简便	对完整胸腺器官高度依赖； 维持时间短暂；培养规模 有限；T细胞产量低	人体器官体外培养
重组胸腺器官培养：细胞聚集体 [ 22- 25] 、人工支架 [ 28， 31- 33] 、脱细胞胸腺 支架 [37]	TCR基因重组-阳性选择-阴性选	三维结构可提供更好的细胞交互；研究用途广泛；适合体内移植	对生物组织成分依赖；维持时间短暂；培养规模有限	利用无机或有机材料重现胸腺三维环境
Notch信号驱动的二维培养：基质细胞转导Notch 配体 [ 46， 52- 56] 、人工呈递 Notch配体 [ 58- 60]	TCR基因重组-阳性选择	结构简单, 可重复性好；诱 导多种干细胞分化发育； 获取具有扩展潜力的未 成熟T细胞	无法同时表达两类MHC；无 法进行阴性选择；实验成 本较高；T细胞扩增和功 能受限	二维环境下简单培养

TCR：T细胞受体；MHC：主要组织相容性复合体.

T细胞体外发育方法的未来发展

迄今成功应用ACT的案例都是在自体来源T细胞的基础上实现的，这样虽然保证了治疗方案的个体化，但也导致了治疗成本高、实施难度大等问题，且改造后的T细胞回输同样存在发生GVHD的风险 ^[63] 。针对这种风险，目前有学者采用基因改造的前T细胞代替成熟T细胞的移植方法，将尚未具备抗原识别能力但对肿瘤细胞有特异性杀伤力的前T细胞输入患者体内，利用患者的胸腺对前T细胞进行驯化，以建立宿主耐受性 ^{[ 64- 65]} 。但肿瘤患者胸腺内很可能出现含肿瘤抗原的树突状细胞，导致成熟T细胞对肿瘤表面抗原免疫耐受，无法有效攻击肿瘤细胞。因而，T细胞体外发育方法的发展面临着更严格的要求。

首先，利用T细胞体外发育方法获得的成熟T细胞不会攻击患者正常组织细胞，即该方法能够对不同来源的T细胞进行驯化，这依赖于髓质TEC对T细胞的阴性选择。但胸腺紧靠心脏，获取原代胸腺基质成分需要打开胸腔，对人体损伤较大，且晚期癌症患者多接受过长期放化疗，胸腺功能受损，同时患者胸腺也存在被肿瘤抗原污染的风险。因此如何在不对人体造成较大损伤的前提下，获得功能完整的髓质TEC，是实现该方法的最大难题。目前已有文献描述了将iPSC诱导分化为TEC的方法 ^{[ 66- 67]} ，结合体细胞重编程为iPSC的技术，有望开发出一种从体细胞到iPSC再到个体化TEC的体外重编程和再分化的方案。选取患者体内容易获取且未被肿瘤微环境影响的细胞进行重编程（如人成纤维细胞 ^{[ 68- 69]} 、角质形成细胞 ^[70] 或外周血单核细胞 ^{[ 71- 72]} ），再对重编程得到的iPSC进行诱导分化以获得iPSC-TEC。这些iPSC-TEC保留了患者的遗传信息，可表达患者个性化抗原库，其中髓质iPSC-TEC可以用于体外T细胞培养，以达到驯化T细胞的目的。除此之外，iPSC还可以作为前T细胞，直接投入培养体系进行分化发育，从而确保培养获得的T细胞与患者MHC配型一致，患者不会产生免疫排斥。另外，iPSC还具有来源稳定而一致的优点，同时避免了医学伦理问题。不仅如此，已有研究显示，iPSC会保留重编程前初始细胞的某些遗传信息 ^[73] 。若选择患者体内对肿瘤抗原高度亲和的初始T细胞进行重编程，将获得的iPSC投入培养再分化，最终得到的iPSC-T细胞可以保留其对肿瘤抗原的特异性杀伤能力，且继承初始T细胞的 TCR基因重组模式 ^{[ 74- 75]} ，从而实现对肿瘤细胞进行精准攻击。除了患者来源的iPSC外，还可以选择配型成功的健康供体来源的iPSC：对这类iPSC先行基因改造，使其获得特异性杀伤肿瘤细胞的能力，再投入培养诱导分化 ^{[ 76- 77]} ，最终得到的T细胞可在保证免疫相容性的前提下精准攻击肿瘤细胞，且配型一致的供体可以为多位患者提供iPSC，治疗成本大大降低。

其次，利用该方法构建的培养体系需要在体外长时间维持功能。目前能够在体外支持T细胞发育的培养体系维持时间都非常有限，主要原因在于大部分培养采用了原代生物材料。事实上，体外培养的生物材料无论是离体器官或原代细胞，在体外的培养时间都是有限的，从而导致培养体系无法长期维持，需要重复构建，这不仅会影响培养效能的一致性，还会影响所获T细胞产品的一致性。此外，不同个体或同一个体不同批次来源的生物材料之间会存在较大的差异，加剧了培养体系的不稳定性。因此，只有进一步减小对原代生物材料的依赖程度，T细胞体外发育方法才能实现临床转化。但目前髓质TEC对T细胞阴性选择是不可或缺的，只有结合上述iPSC-TEC ^{[ 66- 67]} 的分化方法和个体化iPSC的重编程技术 ^{[ 68- 72]} ，获得表达患者个性化抗原库的髓质TEC并将其用于培养中，才能保证体外培养T细胞的稳定性。

结语

基于T细胞的ACT发展成为治疗肿瘤的特效疗法以来，已多次成功应用于临床治疗中 ^{[ 3- 7]} 。目前该疗法使用的T细胞主要来源于自体或同种异体的组织，导致T细胞不仅来源不够稳定，还有较大的获取难度。因此利用T细胞体外发育方法获得T细胞，再进一步开发成稳定的通用型T细胞产品，并代替传统来源的T细胞参与ACT，将大大减少治疗成本，推动ACT快速发展和推广。

三种T细胞体外发育方法均可在体外支持T细胞发育，其中胎儿胸腺器官培养使用了完整的胸腺结构，而人体胸腺组织极难获取，因此该方法无法应用于临床；重组胸腺器官培养虽然依赖于髓质TEC的阴性选择，但只需结合体细胞重编程获得iPSC ^{[ 68- 72]} 以及iPSC诱导分化为TEC ^{[ 66- 67]} 的技术，就能获得与患者遗传信息一致的个体化髓质TEC并应用于培养体系中，获得与患者免疫相容性良好且来源稳定的成熟T细胞；Notch信号驱动的二维培养能够支持多种干细胞向T细胞分化 ^{[ 46- 48]} ，因此可将特殊的iPSC加入培养物中，包括患者体内高度亲和肿瘤抗原的初始T细胞重编程获得的iPSC ^{[ 74- 75]} ，或健康供体来源且通过基因改造增加肿瘤杀伤力的iPSC ^{[ 76- 77]} ，以此获得的未成熟T细胞具备肿瘤特异性杀伤力，可用于后续进一步开发T细胞产品。

综上所述，在T细胞体外发育方法的基础上结合个体化iPSC的重编程技术以及个体化iPSC-TEC诱导分化技术，可以快速稳定地生成大量免疫相容性良好的T细胞，并可进一步开发成通用型T细胞产品，以支持ACT的推广和应用，促进肿瘤个性化疗法的发展，为肿瘤晚期患者带来生存的希望。但目前该方法仍有诸多待解决的难题，其中如何在降低对原代生物材料依赖的前提下获得长时间稳定维持功能的T细胞体外发育，是实现其临床转化的关键，也是T细胞体外培养进一步发展的方向。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（81830073）