RITA体外选择性抑制BAP1缺失的皮肤黑色素瘤细胞的生长

Abstract

目的

构建抑癌基因BAP1敲除的皮肤黑色素瘤细胞模型，筛选对BAP1缺失的皮肤黑色素瘤细胞具有选择性抑制活性的小分子化合物。

方法

选择表达野生型BAP1的皮肤黑色素瘤细胞利用CRISPR-Cas9系统敲除BAP1基因，获得与亲代细胞同基因型的BAP1敲除克隆，通过MTT法筛选化合物库中对BAP1敲除细胞具有选择性抑制活性的小分子化合物。通过挽救实验，明确BAP1敲除细胞对化合物的敏感性是否与BAP1蛋白缺失直接相关。流式细胞术检测化合物对细胞周期和凋亡的影响。Western blotting检测化合物对蛋白表达的影响。

结果

化合物库中的p53激活剂RITA选择性抑制BAP1敲除细胞的细胞活力。过表达野生型BAP1能够逆转BAP1敲除细胞对RITA的敏感性，而过表达去泛素化酶失活的突变型BAP1（C91S）没有挽救作用。与BAP1野生型对照细胞相比，BAP1敲除细胞对RITA引起的细胞周期阻滞和凋亡更为敏感（P＜0.0001）。BAP1敲除增加了细胞p53蛋白的基础水平，而RITA处理后进一步增加p53蛋白表达（P＜0.0001）。

结论

BAP1缺失导致皮肤黑色素瘤细胞对p53激活剂RITA敏感。BAP1的去泛素化酶活性与细胞对RITA的敏感性直接相关。BAP1敲除导致p53蛋白增加可能是细胞对RITA敏感的一个关键原因。

皮肤黑色素瘤（CM）是一种复杂的疾病，其特征是具有高度的异质性，这也使它成为最具有侵袭性的癌症类型之一^[1]。尽管皮肤黑色素瘤在所有类型的皮肤癌中只占少数，但它在全世界造成的皮肤癌相关死亡人数最多^[2]。皮肤黑色素瘤的患者群体是45%的女性（n= 83）和55%的男性（n=102）。整个年龄分布范围是21~92岁，平均年龄为56岁（中位数60）^[3]。通过对331例原发性和/或转移性皮肤黑色素瘤的DNA、RNA和蛋白质进行分析，描述了皮肤黑色素瘤的基因组改变情况。同时建立了一个基因组分类框架，将基因组分为四个突变亚型：突变的BRAF、突变的RAS、突变的NF1和Triple-WT（野生型）^[4]。BRAF突变导致皮肤黑色素瘤的发生占比达到35%~50%^[5]。此外，携带BAP1突变的皮肤黑色素瘤患者总体生存时间显著减少。因此，开发或发现新的相关抑制剂从而改善皮肤黑色素瘤患者的生存率依然是研究的重点。

BAP1是一个抑癌基因，它是泛素羧基末端水解酶家族的一个成员^{[6, 7]}。BAP1蛋白存在多个结构域，每个结构域与特定的蛋白或者细胞因子结合参与相关过程，例如染色质重塑、DNA损伤、细胞周期等等^[8]。许多疾病的发生与BAP1突变相关，其中包括葡萄膜黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肾细胞癌、恶性间皮瘤等^[9]。BAP1的突变主要表现为失活突变，即蛋白表达缺失或失去功能。在皮肤黑色素瘤中，BAP1发生突变之后往往使得患者的预后更差^[10]。

肿瘤凋亡和p53再生化合物（RITA）是新近发展起来的一种潜在的抑癌小分子药物，在肿瘤生长抑制、诱导凋亡中表现出高效性^{[11, 12]}。研究表明，在机体内，RITA与p53靶向结合，使得p53不能被Mdm2泛素化，促进p53的累积，恢复肿瘤细胞里p53的凋亡诱导功能^{[13, 14]}。先前关于小分子抑制剂RITA的研究主要包括RITA在结直肠癌和头颈癌中一方面通过激活p53，使p53的表达水平升高，从而导致细胞生长受到抑制以及细胞死亡，另一方面RITA还引起细胞发生凋亡从而起到抗肿瘤作用^[15-17]。除此之外还有部分研究表明RITA通过独立于p53的其他通路起到抗肿瘤作用，例如在间皮瘤研究中发现它通过JNK通路起抗肿瘤作用^[18]。

本研究通过CRISPR-Cas9系统敲除BAP1基因后得到的皮肤黑色素瘤细胞M14 BAP1 KO#1克隆及其亲代M14细胞组成同基因型细胞模型，利用该细胞模型筛选化合物库中对BAP1敲除细胞具有选择性抑制活性的小分子化合物。筛选结果表明RITA在皮肤黑色素瘤细胞中对BAP1基因野生型以及缺失型存在敏感性差异，该表型目前还没有相关文章发现。因此我们针对该表型进行更全面的研究，旨在于为存在BAP1失活突变的皮肤黑色素瘤患者探索个体化治疗药物。

1. 材料和方法

1.1. 材料

M14、A375、B16-F10三株皮肤黑色素瘤细胞和HEK-293T细胞由加州大学圣地亚哥分校药理系管坤良教授实验室馈赠。M14、B16-F10培养基为RPMI 1640（Gibico），A375、HEK-293T培养基为DMEM（Gibico）。胎牛血清（ExCell Bio）。将single guide RNA（sgRNA）序列克隆到质粒px459 v2（Addgene#62988）或lentCRISPR v2（Addgene#52961）中。BAP1敲除Guide RNA序列（5' to 3'）分别为gRNA2：ACCCACCCTGAGTCGCATGA，gRNA3：TGAAGT CCTTCATGCGACTC。化合物库分别有L1200-Epigenetics Compound Library，L1000-Approved Drug Library和L4000-Bioactive Compound Library（TargetMol）。BAP1（C91S和K116K）点突变构建物是使用Q5热启动高保真DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）和以下引物通过定点突变产生的：C91S-BAP1-正向，5'-ACCACACTCTAGCAACTCATGC-3'；C91S-BAP1-反向，5'-ATCAGCTGGTGGCAAAG-3'；K116K-BAP1正向，5'-GTCGAATGACTTCACCAAGGTTTTAG-3'，K116K-BAP1反向，5'-TCAGGTGTCCAGGT-3'；细胞转染试剂PolyJet^TM Transfection Reagent（SignaGen）。嘌呤霉素（Invitrogen）、潮霉素（Sigma）。MTT噻唑蓝（Amresco）。细胞周期检测试剂盒（DOJINDO）。Annexin V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物）。GAPDH抗体（sc-25778R，Santa Cruz）、BAP1抗体（sc-28383，Santa Cruz）和鼠源BAP1抗体（ab199396，Abcam），H2AK119ub1抗体（XP-R 8240s，Cell Signaling Technology），p53抗体（sc-126，Santa Cruz），二抗羊抗鼠、二抗羊抗兔（弗德生物）。ECL化学发光底物（捷倍斯）。

1.2. 方法

1.2.1. 构建CRISPR/Cas9载体

通过网站（http://chopchop.cbu.uib.no）设计CRISPR Guide RNA（gRNA）序列，每种基因选择评分最高的前三条gRNA。通过常规限制性内切酶方法，将gRNAs克隆至CRISPR/Cas9非病毒载体px459以及慢病毒载体lentiCRISPR v2上面，测序显示连接成功后，扩增提取构建成功的质粒，置-20 ℃冰箱保存。之所以优先选择非病毒载体是因为它能够筛选到靶基因敲除的单克隆细胞，并且这些细胞的基因组整合上Cas9和gRNA序列的概率比较低，对于嘌呤霉素依然存在敏感性。在脂质体转染效率极低的情况下，我们选择慢病毒系统。本课题中B16-F10 BAP1敲除的细胞是采用转染非病毒载体px459挑单克隆的方法得到的，M14 BAP1敲除是以慢病毒载体lentiCRISPR v2进行单克隆挑选，而A375 BAP1敲除的细胞则是通过慢病毒载体lentiCRISPR v2进行感染后直接进行后续实验。

1.2.2. 筛选BAP1敲除的CM细胞株/细胞群

1.2.2.1. 非病毒载体px459单克隆挑选

将1 µg的px459-BAP1gRNA重组质粒通过polyJet转染试剂转入B16-F10细胞，转染后细胞培养于含1 µg/mL嘌呤霉素的培养基。对经过嘌呤霉素筛选后的存活的细胞进行Western blot验证BAP1蛋白下调后，通过流式细胞仪将细胞分选至96孔板培养（每孔1个细胞），待单个细胞长成细胞群后将其分成两部分，分别转移到24孔板培养。24孔板的细胞长至80% 左右提蛋白进行Western blot验证BAP1蛋白及其下游蛋白H2A K119位的泛素化情况。

1.2.2.2. 慢病毒载体lentiCRISPR

v2进行BAP1敲除取对数生长的HEK-293T细胞，将包装质粒PsPAX和PMD2.G以及pLentiCRISPR v2（vector和BAP1 g2/g3）以1∶1∶2的比例进行转染。转染24 h后换2 mL新鲜培养基继续培养24 h，收集上清以0.45 µm的微孔滤膜过滤，收集慢病毒液。将M14，A375细胞分别以1×10⁵/孔接种于6孔板中，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。24 h后，在收集的慢病毒滤液中加入促感染试剂Polybrene（1∶2000），混匀后，去除六孔板中靶细胞上清液，每孔加入2 mL相应的慢病毒感染靶细胞，阴性对照孔不做处理。6~8 h后，更换新鲜的培养基，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒温培养箱中培养过夜。感染24 h后，将6孔板的细胞转移至10 cm大皿，待细胞贴壁后更换含1 µg/mL嘌呤霉素的培养基培养细胞。当对照组细胞被嘌呤霉素全部杀死后，更换为正常全培培养细胞。Western blot验证BAP1蛋白下调后以及其相对应的组蛋白H2A第119位泛素化增加，进行后续实验（A375细胞是直接用该细胞群进行MTT实验；M14细胞则是通过流式分选成单个细胞，之后的方法与非病毒载体px459单克隆挑选的后续步骤一致）。

1.2.3. 小分子化合物筛选

筛选的化合物库分别有L1000、L1200和L4000，L1000化合物库是上市化合物库，包含的化合物具有已知的和良好表征的生物活性、安全性和生物利用度；L1200化合物库是表观遗传库，收集表观遗传相关的活性小分子，适用于表观遗传学研究，可用于高通量、高内涵筛选；L4000是经典已知活性化合物库，它是具有生物活性，能引起细胞、组织甚至个体生物学反应的化合物的集合。将处于对数生长期，且生长状态良好的M14和M14 BAP1 KO#1两组细胞接种于96孔板，每组3个复孔，2000/孔。接种细胞24 h开始药物处理，设置实验组（1∶1000稀释化合物）和对照组（0.1% DMSO）。药物处理6 d后，MTT检测并计算两组细胞的存活率（存活率=化合物作用下的吸光度值/对照组的吸光度值），用Fold change表示化合物对M14细胞的选择性，计算公式为：Fold change=存活率（M14 BAP1 KO）/存活率（M14），Fold Change越大，药物对M14细胞的选择性抑制作用越强。将筛选得到的FC≥2的小分子化合物RITA设置10、3、1、0.3 µmol/L的浓度梯度作为实验组，对照组仅含有0.1% DMSO的培养基，配制后分别加入孔板中。药物处理6 d后，MTT检测并计算各组细胞的存活率，通过细胞存活曲线，检验药物的选择性是否有浓度依赖性。

1.2.4. 构建过表达载体

我们自Transomic公司购买pOTB7-BAP1质粒，通过PCR扩增BAP1全长，通过常规性限制性内切酶的方法，将扩增产物克隆至逆转录病毒载体pQCXIH，得到pQCXIH-BAP1质粒。需要说明的是，通过慢病毒CRISPR/Cas9系统得到的BAP1 KO单克隆会持续表达Cas9蛋白和gRNA，所以在表达外源性BAP1时很可能也会被CRISPR/Cas9系统编辑，造成外源性表达的失败。因此，对于M14 BAP1 KO单克隆，我们通过密码子的简并性，在不影响编码的氨基酸的前提下，引入同义突变，破坏gRNA对应的PAM序列，从而达到成功表达外源性BAP1的目的。对于BAP1 PAM序列点突变，我们是将BAP1第348位碱基由G突变成A，而该位点（第116位）氨基酸未改变，仍为赖氨酸（K），得到BAP1 K116K。将BAP1第91位氨基酸由C突变为S，得到突变体BAP1 C91S。通过NEB在线软件（http://nebasechanger.neb.com/）设计导入点突变的引物，根据Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit（NEB）说明书，以pQCXIH-BAP1wt为模板，通过PCR反应引入点突变，最后将质粒测序以确认引入了正确的点突变。

1.2.5. 挽救实验验证BAP1 KO细胞对RITA的选择性

取对数生长期的HEK-293T细胞，胰酶消化，1200 r/min离心2 min，去除上清，重悬细胞计数，以5×10⁵/孔的细胞密度接种于6孔板中，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。24 h后进行转染（转染：取3支1.5 mL无菌EP管，各加入50 μL不含血清和双抗的DMEM培养基，按照下表配制质粒混合物。另取1支无菌EP管，加入150 μL不含血清和培养基的DMEM培养基，再加入16.2 μL的PolyJet转染试剂，轻轻混匀后分别取50 μL至3管质粒混合物中，混匀，瞬离，室温静置15 min，按照100 μL/孔逆时针方向逐滴加入六孔板中的HEK-293T中进行转染，轻轻晃匀后置于37 ℃含5% CO₂的恒温培养箱中培养24 h。24 h后，吸去上清，每孔加入1.5 mL新鲜DMEM培养基（10%FBS，1%PS），继续培养，再分别收集24 h、48 h、72 h的上清于15 mL离心管中。将病毒上清以0.45 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于-80 ℃冰箱备用。在上述收集第48 h病毒上清时，取对数生长期M14 BAP1 KO细胞，消化离心后，去除离心，重悬细胞计数，以0.5×10⁵/孔接种于12孔板中。24 h后，收集完72 h病毒即可感染。取逆转录病毒与新鲜RPMI 1640全培以1∶1比例混匀，加入促感染试剂Polybrene（1∶2000），充分混匀，取1 mL加入相应的12孔板与靶细胞共孵育，6~8 h后更换新鲜全培。感染24 h后，将12孔板的细胞消化，转移至6孔板，待细胞贴壁后加入含有500 μg/mL hygromycin的全培培养细胞，当对照组细胞被hygromycin全部杀死后，进行Western blot验证BAP1以及BAP1 C91S的过表达情况。

1.2.6. 流式检测RITA对细胞的周期阻滞

取对数生长的M14 WT和M14 BAP1 KO的细胞，以1×10⁵/孔细胞密度接种于6孔板中，两种细胞各铺9个孔。24 h后，以RPMI 1640全培稀释RITA母液，配置浓度为1 μmol/L和3 μmol/L的RITA药物浓度（现配现用），每个浓度设置3个复孔。取出6孔板，去上清，将药物加入对应的孔中，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒温培养箱中培养48 h。按照周期试剂盒（DOJINDO）操作流程处理后，流式细胞仪（BD FACSCanto Ⅱ）检测细胞周期阻滞情况。

1.2.7. Annexin Ⅴ -FITC染色检测细胞凋亡

取对数生长细胞M14，M14 BAP1 KO#1细胞，以1×10⁵/孔接种于6孔板中，两种细胞各铺9个孔。24 h后，以RPMI-1640全培稀释RITA母液，配制浓度为1 μmol/L和10 μmol/L的RITA药物溶液（现配现用），每种细胞设置3个浓度（0、1、10 μmol/L），每个浓度3个复孔。取出6孔板，去除上清液后，加入配制好的药液。药物处理96 h后，按照Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒（Beyotime）操作流程处理，流式细胞仪（BD FACSCanto Ⅱ）检测细胞凋亡情况。

1.2.8. Western blotting

取一定数量的细胞悬液至1.5 mL EP管中离心，加入一定量的1×Simple Buffer进行裂解，金属水浴锅105 ℃煮10 min，冷却至室温后进行Western blot验证。在电泳的过程中，调整浓缩胶和分离胶的电压分别为80 V和120 V；PVDF膜转印时电压为100 V；封闭时为5%的脱脂奶粉1 h；孵育一抗（4 ℃过夜），然后二抗孵育1 h，每次孵育后均用TBST洗涤3次，10 min/次，最后进行显影。

1.2.9. 统计学处理

运用GraphPad Prism软件对MTT实验数据进行分析，细胞周期、细胞凋亡用Flowjo软件进行处理。用Excel进行统计学分析，采用t检验对两样本进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。本文中MTT实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验重复次数为3次（n=3），Western blot实验重复次数为2次（n=2）。

2. 结果

2.1. 化合物库筛选结果

用M14 BAP1 KO#1和亲代M14细胞组成BAP1缺失突变和野生型的同基因型细胞，通过MTT法从已知活性化合物库（L1000/L1200/L4000）（图 1A）中筛选对野生型细胞和BAP1缺失突变细胞具有敏感性差异的化合物，筛选浓度为10 µmol/L，处理M14和M14 BAP1 KO#1两组细胞6 d后比较细胞活力。结果显示化合物库L4000中存在15个化合物在M14和M14 BAP1 KO#1细胞中具有敏感性差异（Fold change≥2），其中p53激活剂RITA对M14 BAP1缺失细胞的选择性抑制作用最明显（图 1B）。

图 1.

已知活性化合物库的组成及筛选结果

Screening of compounds (A) that selectively inhibit M14 cells compared to M14 BAP1 KO #1 clone (B).

2.2. RITA可选择性杀伤BAP1缺失突变的皮肤黑色素瘤细胞

通过化合物库筛选发现RITA对M14 BAP1 KO#1细胞存在选择性杀伤作用后，进一步对另外两株皮肤黑色素瘤细胞B16-F10和A375及其对应的BAP1敲除的细胞也同样加药处理，发现都存在BAP1敲除后细胞相对于BAP1野生型的细胞对RITA更敏感的情况（图 2）。

图 2.

M14/B16-F10/A375中BAP1敲低效果以及RITA对BAP1野生型和敲除后的敏感性差异

Expression of BAP1 and ubiquitination of its downstream histone H2A in M14, B16-F10 and A375 cells with BAP1 knockout (A) and RITA sensitivity to BAP1 wild-type and knockout cells detected using MTT assay (B).

2.3. 在M14 BAP1敲除单克隆细胞上过表达BAP1起到挽救的作用

在M14 BAP1 KO#1/#2细胞上面过表达野生型BAP1以及去泛素化酶失活的突变型BAP1（C91S）（图 3A、C），进行MTT实验发现，过表达BAP1野生型的细胞其敏感性恢复到和M14细胞差不多，而过表达BAP1 C91S突变型的细胞敏感性几乎没有改变（图 3B、D）。

图 3.

过表达BAP1野生型及BAP1 C91S突变型敏感性变化

Rescue effect of BAP1 overexpression on RITA sensitivity in BAP1 knockout M14 cells. A: BAP1 expression in the cells. B: Rescue effect of BAP1 overexpression on RITA sensitivity of the cells.

2.4. RITA引起细胞发生G2/M期周期阻滞

RITA发挥其抗肿瘤作用与其能够引起细胞发生周期阻滞密切相关。对M14及M14 BAP1敲除的细胞加RITA处理48 h后，通过流式检测发现，BAP1敲除的细胞G2/M阻滞现象较野生型明显（P＜0.0001，图 4）。

图 4.

流式检测RITA对M14 WT以及M14 BAP1 KO#1周期阻滞

Flow cytometry showing cell cycle arrest in G2/M phase in RITA-treated wild-type and BAP1 knockout M14 cells (M14 BAP1 KO#1). ^*P < 0.05, ^***P < 0.0001 vs wild-type M14 cells (M14 WT).

2.5. RITA引起细胞发生凋亡

RITA发挥其抗肿瘤作用除了与细胞周期阻滞相关之外，还与其引起细胞发生凋亡相关。在M14及M14 BAP1敲除的细胞上加RITA处理96 h后，流式检测发现，BAP1敲除的细胞凋亡现象明显，而野生型细胞几乎没有凋亡的发生（P＜0.0001，图 5）。

图 5.

流式检测RITA引起M14 WT以及M14 BAP1 KO#1凋亡

Flow cytometric analysis of apoptosis of RITA-treated wild-type and BAP1 knockout M14 cells (M14 BAP1 KO#1). ^***P < 0.0001 vs M14 WT group.

2.6. BAP1敲除后p53蛋白水平升高，RITA增加p53的表达

在对BAP1野生型的细胞进行BAP1敲除后发现肿瘤抑制因子p53的表达增加。对M14 WT/BAP1 KO#1加RITA处理48 h后，p53的蛋白水平进一步升高。BAP1敲除的细胞相对于野生型细胞加药处理后，其p53表达水平更高（图 6），

图 6.

敲除BAP1基因后，p53的蛋白表达情况以及加RITA处理后p53在蛋白水平上的变化情况

Expression of p53 in melanoma cells with BAP1 knockout and RITA treatment. A: Expression of p53 increases after BAP1 knockout in M14, B16-F10 and A375 cells. B: RITA treatment for 48 h increases p53 expression in M14 WT and BAP1 KO#1 cells. C, D: Quantitative analysis of p53 expression in different groups.

3. 讨论

在大多数情况下，黑色素瘤发生是一个线性多阶段的肿瘤发生过程，从痣和/或中间性病变开始，进而发展为发育不良性肿瘤，然后发展为浸润性肿瘤和转移^[19]。皮肤黑色素瘤的属性是高水平的突变负担和结构重排与突变特征的紫外线（紫外线）暴露^[20]。尽管多数患者在诊断时就已患有局部疾病，并且通过手术切除原发肿瘤而治愈，但许多患者发展为转移瘤，这些患者中的大多数将死于与黑色素瘤相关的原因^[21]。皮肤黑色素瘤中BAP1突变频率比较高，我们通过构建BAP1敲除的细胞与其BAP1野生型的同基因型细胞模型进行化合物库筛选，最终选择在BAP1野生型及BAP1敲除细胞中敏感性差异最大的小分子抑制剂RITA。进一步探究RITA引起的敏感性差异是否与基因BAP1相关，于是我们在BAP1敲除的单克隆细胞上面过表达BAP1野生型及其去泛素化酶失活的突变型BAP1（C91S），发现过表达BAP1野生型能够逆转BAP1敲除细胞对RITA的敏感性，而过表达去泛素化酶失活的突变型BAP1（C91S）则没有逆转效果，这说明该敏感性差异的发生与BAP1去泛素化酶活性直接相关。

小分子抑制剂RITA发挥其抗肿瘤活性主要是通过激活抑癌基因p53以及诱导细胞发生周期阻滞、凋亡等来起到抑制肿瘤细胞生长^{[13, 22]}。p53在细胞应激反应中诱导细胞周期阻滞和凋亡，该蛋白的修饰对其稳定性以及下游靶基因的转录激活非常重要^[23]。在本研究中我们通过流式检测M14 WT及其BAP1 KO#1细胞加RITA处理48h后，发现RITA引起G2/M期阻滞^[24]。细胞周期是控制组织内稳态的主要生理过程，发生周期阻滞会影响并激活一些复杂的通路引起细胞死亡^{[25, 26]}。与此同时，我们发现，BAP1敲除的细胞加药处理后，其G2/M期阻滞情况相对于野生型细胞更加明显。该结果在一定程度上说明，RITA对M14 BAP1敲除的细胞更具有杀伤力的原因可能与它引起的周期阻滞有关。在肿瘤细胞中，与RITA起到抑制肿瘤生长密切相关的还有细胞凋亡^[27]。我们通过流式检测M14 WT以及BAP1 KO#1细胞加RITA处理96 h后，发现BAP1 KO#1细胞有明显的凋亡发生，而野生型细胞几乎没有。根据凋亡检测的结果可以初步认为M14 BAP1敲除的细胞对RITA更敏感与RITA引起细胞发生凋亡存在一定关系。从以上对细胞周期以及凋亡的检测结果来看，RITA发挥其抗肿瘤活性与BAP1是否缺失以及细胞周期、细胞凋亡存在一定关系。最后，由于RITA是抑癌基因p53的激活剂，我们通过Western blot检测p53蛋白的表达情况。最终发现，敲除BAP1后，p53的表达增加，在此基础上进行加药处理，发现BAP1敲除细胞p53增加情况较BAP1野生型细胞更明显。我们目前认为，RITA对BAP1敲除的肿瘤细胞更具有杀伤力有可能是因为BAP1敲除之后p53的表达量增加了，在这个时候对BAP1野生型以及BAP1敲除的细胞加p53的激活剂处理，会使原本p53表达量高的细胞p53增加得更多，抑制肿瘤生长的作用更加明显。但是，这个作用机制是否真的与我们的猜测相符合还需要后续深入研究进一步证明。

综上所述，本研究是利用CRISPR-Cas9系统构建BAP1敲除的单克隆细胞，筛选出对BAP1突变型的皮肤黑色素瘤细胞更敏感的小分子抑制剂RITA。小分子抑制剂RITA对BAP1突变皮肤黑色素瘤细胞更具有杀伤力表型的发现，为临床上BAP1突变皮肤黑色素瘤患者提供一个潜在的治疗药物。除了发现上述表型外，本研究也初步证明了RITA对BAP1敲除肿瘤细胞更敏感的相关因素，为后续进行探究的机制提供思路。本文最主要的研究目的在于为携带BAP1突变的皮肤黑色素瘤患者提供个体化治疗药物，改善临床上BAP1突变皮肤黑色素瘤患者的预后。

Biography

石文惠，硕士研究生，E-mail: 1193853733@qq.com

Funding Statement

国家自然科学基金（81973357）；眼科学国家重点实验室开放研究基金（2022KF06）；广东省自然科学基金（2022A1515011824）；广东省药学会研究基金（2022ZX02，2022ZX05）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81973357)