用于生物型人工肝脏支持系统的肝细胞状态检测及应用进展

Abstract

生物型人工肝脏支持系统（BALSS）具有肝脏的解毒、提供营养及改善内环境等功能，为治疗肝功能衰竭提供了新方法，也为患者等待肝移植争取了时间。生物反应器和具有良好生物活性的肝细胞是 BALSS 的核心，决定着治疗效果。在长时间的治疗过程中，肝细胞的功能活性会产生较大变化，因此为保证 BALSS 的治疗效果，检测肝细胞状态十分重要。本文介绍了表征细胞损伤程度、解毒功能以及合成功能这三方面的指标及其常用检测方法，总结了细胞状态检测技术在 BALSS 中的应用并讨论了其发展趋势。

引言

生物型人工肝脏支持系统（bioartificial liver support system，BALSS）是使肝细胞与患者血浆通过半透膜或直接接触的方法进行双向物质交换的体外支持系统，具有肝脏的解毒、提供营养及改善内环境等功能，其发展为肝功能衰竭的治疗提供了新方法，并为患者等待肝移植争取了时间^[1]。

BALSS 的核心部件是生物反应器，生物反应器为肝细胞与患者血浆提供了物质交换场所^[2]。生物反应器内装有具备解毒、代谢、合成等功能的高活性肝细胞，这是 BALSS 区别于其他非生物人工肝支持系统的关键。这些肝细胞在治疗过程中可以代替受损肝脏实现大部分功能^[3-4]，其生物活性决定着治疗效果^[5-6]。为保证 BALSS 具有良好的体外支持功能，其装载的肝细胞必须始终保持良好的功能和活性，在长时间的治疗过程中，这些肝细胞的生物活性将发生很大变化，因此，医护人员必须经常检测肝细胞状态，及时掌握细胞状态信息^[7-8]，以便作出及时有效的应对措施。

1. 现有肝细胞状态检测方法和应用

1.1. 现有肝细胞状态检测指标及方法

为掌握细胞状态，首先需要选择合适的评价指标。在现有的研究和临床应用中，对肝细胞状态的评估，主要集中在损伤程度、解毒功能和合成功能等方面。目前常用指标有：丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转肽酶、总胆红素（total bilirubin，TBil）、直接胆红素（direct bilirubin，DBil）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）、免疫球蛋白、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、尿素等^[9-12]。

ALT 是肝细胞内血清酶的一种，主要存在于细胞质中，是反映肝细胞受损最敏感的指标，也是目前评价肝细胞功能损伤程度使用最多的指标^[13]。检测 ALT 浓度常用的方法有：速率法和赖氏检测法^[14-15]。速率法方便、精确但是重复性差，多需使用紫外分光光度计，成本高昂^[16]；赖氏比色法工作量较大，加样和加试剂都不可避免地引入误差，影响了检测的准确度和精密度^[17]。

肝细胞解毒功能的主要检测指标是尿素合成量。氨是机体正常代谢产物，具有毒性，体内的氨主要在肝内合成尿素而解毒，因此，通过检测尿素合成量可以评价肝细胞的解毒功能。检测尿素合成量的常用方法有：脲酶-波氏比色法^[18]和酶偶联速率法^[19]。脲酶-波氏比色法能有效缩短反应时间，其灵敏度高、线性良好、精密度好，且操作简便不需要避光处理^[20]；速率法特异性高、检测快、结果准确精密，但是该法所用的试剂价格昂贵，且溶解后很不稳定，检测需要紫外分光光度计，成本较高^[21]。

肝细胞合成功能的主要检测指标是白蛋白合成量^[22-23]。白蛋白（又称清蛋白）由肝实质细胞合成，在血浆中的半衰期为 15～19 d，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的 40%～60%，可迅速地从外周血中检测到其在肝内合成量的减少，是反映肝脏蛋白质合成的敏感指标。检测白蛋白通常选用溴甲酚绿法^[24]，该方法操作简便快捷，但是对时间和反应液 pH 值的控制要求较高。

1.2. 肝细胞状态检测在 BALSS 中的应用

肝细胞能否符合临床需求是决定 BALSS 能否成功应用的关键^[25]。在 BALSS 的研究进程中，研究人员基于人类原代肝细胞、猪肝细胞和人肝癌细胞系^[26]等多种细胞来源，开展了大量的实验研究，但都因为种种原因限制了它们在 BALSS 中的应用，因此，筛选出满足需求的细胞来源仍旧是亟待研究者们解决的问题。在细胞筛选过程中，检测细胞状态至关重要。2013 年，荷兰科学家以尿素和乳酸合成量等作为评价指标，证实 HepaRG 细胞具有良好的功能性并强调了其在 BALSS 中的应用潜力^[27]。2016 年，中国科学院上海生命科学研究院惠利健团队^[28]开展 hiHep 生物人工肝临床治疗，选择总胆红素、ALT、AST 作为指标，证明 hiHep 细胞能整合到小鼠肝脏中，并且能在小鼠体内发挥肝实质细胞的功能，为细胞来源的选择提供了新方向。

在 BALSS 的发展历程中，研究者们研制出的反应器类型多样，依赖细胞状态的检测能帮助选择出更合适的反应器。2016 年，郭欢等^[29]通过检测肝细胞内尿素和白蛋白合成量，评估其研制的海藻酸钠/壳聚糖微囊的安全性，同时论证了该微囊作为替代囊膜用于生物人工肝的应用前景。2017 年，Damania 等^[30]用葡萄糖浓度、尿素和白蛋白合成量作为评价指标，验证得出细胞在其研发的集成冷凝混合反应器内生长状态良好的结论，进一步证明该反应器能够有效抑制急性肝衰竭的细胞毒性，从而可以更好地应用于临床治疗。

2. BALSS 细胞状态检测发展新方向

BALSS 细胞状态检测对 BALSS 的发展有着重要意义并且具有广阔的研究前景，但是现有的检测方法还存在以下问题：① 多为离线检测，耗时长，检测结果反馈不及时，这将影响对反应器内技术参数的控制，降低营养物质添加的有效性，从而影响 BALSS 的治疗效果；② 需要定时将反应器内的培养液取样后送至生化检测室检测，容易造成样品损耗，影响患者血液动力学平衡，也容易导致污染；③ 检测到的细胞状态不够全面，目前常用的指标能在一定程度上反映细胞的损伤度和功能性，但是获取信息仍不全面。综合上述现存检测方法的不足，目前 BALSS 细胞检测技术的研究有以下几点新方向。

2.1. 检测在线化

近年来，细胞状态在线检测已经成为了一种研究趋势，越来越多的研究者借助数学和计算机系统对生化反应过程建模并进行优化^[31]。2010 年，Hollmann 等^[32]对甲基铋物种进行平行在线检测，并将检测结果作为人类肝细胞铋甲基化的证据；山东大学林建强团队^[33]在 2012 年成功使用电容法在线检测细胞密度，实现了在微生物发酵过程中的细胞密度在线检测，并成功地对底物浓度进行实时控制；2017 年，Murray 等^[34]将 3 个在线数据与原发性循环前列腺细胞的检测结果进行比较，实现在初始活检时对前列腺癌的预测。

中国科学院电工研究所近年来对生物人工肝细胞状态的在线检测进行了大量的研究，并且取得一定成果，首次使用超亮发光二极管作为测量光源，采用长程液芯波导吸收池作为样品池，设计出一套光机结构，发光二极管发出的光透过比色池中的反应溶液，由集成光电传感器接收并将其转化为检测指标的浓度信号，传输给控制电路和数据采集系统。控制电路和数据采集系统采用单片机作为核心处理单元，将吸光度的检测结果直接发送给单片机^[35]。该检测系统能够方便地集成在 BALSS 系统中，实现在线定性检测的功能。该系统结果原理图如图 1 所示。

图 1.

The structure schematic of the on-line rapid cell detection system of biological artificial liver

生物人工肝在线快速细胞检测系统结构原理图

2.2. 取样微量化

为了减少取样损耗，研究者们在检测方法上不断探索如何在样品和试剂的混合过程中减少采样量，同时保证检测结果精确。近年来，在少量样品和试剂的高效混合方面取得了一定进展。

2010 年新加坡的 Tan 等^[36]在 Sequist 等^[37]设计用于分离循环肿瘤细胞的微流体芯片的基础上，采用微流控技术，成功地从癌症患者的外周血中对循环肿瘤细胞进行微量检测。中国科学院电工研究所近年来也在 BALSS 细胞状态微检测方面取得一定进展，开发出一套微量实时检测系统^[38-40]。该系统采用由多个微通道构成的微流控芯片进行取样，通过微沟道混合芯片实现试剂与样品之间的高效混合，实现了 ALT 和尿素等指标的微量检测。该方法可以应用于在线检测，为 BALSS 的在线微量检测奠定了基础。

2.3. 检测指标多样化

虽然上述生化指标能在一定程度上反映细胞的损伤度和功能性状态，但是这些检测方法仍不能完全表征细胞的所有特性。例如，无法获取细胞数量以及细胞膜完整性和通透性的状态信息，而这些状态信息与细胞的功能以及活性息息相关。因此在当前的研究中，研究者们正在探索新的指标以及方法，使检测到的细胞状态更加全面。

2013 年，方云等^[41]研究了人肝癌细胞的电阻抗特性，通过测量肝癌细胞电阻抗，获得人肝癌 SMMC-7721 细胞电阻抗频谱。研究中还将正常细胞和人肝癌细胞的电阻抗特性进行了比较，并对细胞电阻抗和细胞膜之间的关系建立模型，成功利用细胞电阻抗表征细胞的特性，为细胞质量监测和用于细胞培养的病毒疫苗生产过程的在线检测提供了基础^[42]。然而这一技术目前尚未应用到 BALSS 的细胞检测中。

3. 总结与展望

肝细胞状态检测对 BALSS 的研究和应用起着重要作用，现有的肝细胞状态检测技术无法满足 BALSS 治疗对肝细胞状态检测的实时性、微量化等需求，存在自动取样困难、防污染问题突出等不足，但是目前研究者们对应用到 BALSS 中的在线微量检测方法做出了积极的尝试，以期实时监测细胞状态，改善 BALSS 的治疗效果。因此，在今后的研究中还需要进一步拓展思路，深入肝细胞检测的实时、在线、微量化方面的研究，解决自动取样困难和控制系统复杂、小型化等难点；选择的检测方法也必须适应在线系统快速检测的要求，同时需要综合考虑多种指标检测方法的兼容性。在减少检测样品损耗方面，需要进一步选择混合芯片并需考虑如何将这些检测系统集成至 BALSS 中。此外，检测指标的选取应该更加多样化，除了传统的生化指标，还应联合其他物理量，多方位地展示反应器中细胞的状态，以帮助操作者更好地进行调控。随着 BALSS 研究的日益推进，作为 BALSS 研究中不可或缺的一部分，细胞状态检测的研究意义重大并且有待进一步深入和完善。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（61671428）；广东省自然科学基金研究团队项目（2014A030312013）；广东省应用型科技研发专项资金项目（2015B020229002）；广东省省级科技计划项目（2014B020227002）