Abstract
为了减小低温保护剂去除过程对卵母细胞造成的渗透损伤和毒性损伤，本文利用微流控芯片对猪二次减数分裂中期（MⅡ-stage）卵母细胞低温保护剂的去除方案进行了优化研究。首先分析了微流控去除方法中去除时间、去除液成分及浓度对卵母细胞存活率及体外发育情况的影响，然后将微流控去除方法与传统的一步法、两步法进行了比较。研究结果表明，微流控法中去除总时间为 8 min 时，卵母细胞存活率（95.99% ± 4.64%）及桑椹胚率（74.17% ± 1.18%）与新鲜细胞（98.53% ± 2.94%；78.22% ± 1.34%）相比，差异无统计学意义；1 mol/L 蔗糖去除液最有利于卵母细胞低温保护剂去除后的存活及体外发育；微流控法去除低温保护剂后，卵母细胞的存活率、体外发育情况等，均好于传统去除方法。本文研究结果提示，以微流控法去除低温保护剂可减小对卵母细胞的损伤，从而可能进一步提高卵母细胞的低温保存效果。
Keywords: 低温保护剂, 微流控芯片, 卵母细胞, 去除方案
Abstract
In order to reduce osmotic damage and chemical toxicity of cryoprotectants (CPA) to oocytes during unloading process, the microfluidic chip was used to remove CPA from porcine MⅡ oocytes in this study. Firstly, the effects of unloading time, composition and concentration of diluting solutions of microfluidic method on survival rate and developmental capacity of oocytes were studied, then microfluidic method was compared with traditional one-step and two-step CPA unloading protocols. The results showed that when the total time is 8 minutes, the survival rate and morula rate of oocytes treated with microfluidic method could achieve 95.99% ± 4.64% and 74.17% ± 1.18%, respectively, which were not significantly different from fresh control group (98.53% ± 2.94%; 78.22% ± 1.34%). In addition, 1 mol/L sucrose diluting solutions were more beneficial than other solutions, and it was also showed that microfluidic method achieved better survival, cleavage rate of oocytes than traditional methods. Microfluidic CPA removal protocol can reduce the damage to oocytes during unloading process, and may further improve the cryopreservation effect of oocytes.
Keywords: cryoprotectants, microfluidic chip, oocytes, dilution protocol
引言
自从 1986 年 Chen[1]低温保存人类卵母细胞并最终成功实现妊娠以来，卵母细胞的低温保存成为低温生物医学研究的重要内容，在临床上逐渐呈现出大量的需求。虽然这一领域已经有了一系列重要突破[2-4]，但卵母细胞低温保存后的发育能力还是不高。影响卵母细胞冷冻效果的因素有很多，特别是在低温保护剂的添加和去除过程中，渗透压的急剧变化和高浓度低温保护剂的化学毒性对卵母细胞造成的损伤很大。
为了减小细胞在低温保护剂加载/去除操作中受到的损伤，有研究者将微流控芯片技术引入低温保存领域[5-7]。该技术能使保护剂溶液和缓冲溶液在微流体通道内通过扩散方式混合，实现沿着通道方向保护剂浓度的连续改变，相比于需要将细胞在不同浓度溶液间转移的传统分步加载（去除）保护剂方式，可以大幅度减小分步法中由于溶液浓度突然变化造成的细胞体积突然变化，从而减小细胞受到的机械损伤及渗透性损伤。目前国内外针对微流控芯片用于低温保护剂加载（去除）的研究中，研究者们已利用微流控装置，实现了缓冲溶液对细胞内保护剂的连续性加载（去除），并通过改变细胞体积分数、细胞悬浮液及缓冲溶液流量、流速等参数，研究了细胞的加载（去除）方式及微流控装置的加载（去除）效率，但其实验材料多为肝细胞、红细胞、淋巴细胞等小体积并能制成悬浮液的细胞[8-13]。而本文提及的类似卵母细胞这类大体积细胞，其渗透特性及在通道内的流动行为完全不同于小体积细胞，在临床上多是单个细胞操作，因此在芯片设计上需要有单独的溶液混合通道及细胞操作腔。目前仅有 Heo 等[14]制作了由溶液混合通道、卵母细胞操作腔、细胞进出通道等组成的微流控装置，并将其用于研究卵母细胞低温保护剂加载以及卵母细胞在异丙醇溶液中的渗透特性。而对于微流控装置用于卵母细胞冷冻保护剂去除的相关研究，目前还未见报道。据 Paynter 等[15-16]的研究，卵母细胞在玻璃化保存后，细胞本身所能承受的机械应力会发生变化，对渗透压也变得更为敏感，因此关注低温保护剂的去除过程很有必要。
基于以上原因，本文设计制作了一种可用于卵母细胞低温保护剂加载及去除的微流控芯片[17]，对猪二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ-stage，MⅡ-stage）（简称：MⅡ期）卵母细胞低温保护剂的去除方案进行了优化研究。课题组首先比较了传统的分步法去除与微流控连续性去除对卵母细胞存活率及体外成熟发育的影响，验证连续性去除对卵母细胞的有效性；然后利用该装置，对去除时总时间、去除液成分及浓度进行了优化，完善了微流控芯片用于卵母细胞低温保护剂去除的实验方案。本文研究结果表明，微流控连续性去除方法（以下简称：微流控法）去除低温保护剂能够减小对卵母细胞的损伤，从而可能进一步提高卵母细胞的低温保存效果。
1. 材料与方法
1.1. 主要试剂
实验中所用化学试剂除特别说明外，均购自 Sigma-Aldrich 公司，组织培养液 199（tissue culture meduium-199，TCM199）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自 Gibco 公司，孕马血清促性腺激素、人绒毛促性腺激素购自宁波市第三激素制品有限公司。
各试剂配比如下：
基础液：TCM199 培养液 + 20% FBS；两步法低温保护剂Ⅰ：基础液 + 7.5% 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，Me2SO）+ 7.5% 乙二醇（ethylene glycol，EG）；两步法低温保护剂Ⅱ：15% Me2SO + 15% EG + 0.5 mol/L 蔗糖；两步法去除溶液Ⅰ：基础液 + 0.3 mol/L 蔗糖溶液；两步法去除溶液Ⅱ：基础液 + 0.15 mol/L 蔗糖溶液；微流控法去除溶液分别采用：基础液 +（0.5、1.0、2.0 mol/L）蔗糖、基础液 +（0.5、1.0、2.0 mol/L）葡萄糖、基础液 +（0.5、1.0、2.0 mol/L）海藻糖。
洗卵台氏液：参照戴建军[18]的配置方法，每次配制 500 mL，经 0.22 μm 滤器过滤后进行分装，分装后置于 4℃ 保存。
1.2. 猪卵母细胞的采集和体外成熟培养
实验中所用的猪卵母细胞取自上海市嘉定区某屠宰场采集的新鲜卵巢，放在 37℃ 的生理盐水（含 500 IU 青（链）霉素）中，1 h 内运回实验室，用带有 18 G 针头的 5 mL 注射器抽吸卵巢表面直径 2～6 mm 卵泡的卵泡液并注入 15 mL 离心管中，37℃ 静置 10 min，移除上清液，用少量洗卵台氏液悬浮沉淀后，转入直径 10 cm 培养皿内进行卵母细胞收集。在体视显微镜（SMZ-168，MOTIC，日本）下捡取胞质均匀、包被 3 层或以上致密卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs）用于体外成熟培养。
COCs 用洗卵台氏液洗涤 2～3 次，再用 TCM199 培养液洗涤 2～3 次后，将细胞移入用 4 孔培养板，并置于 CO2 培养箱［（39 ± 0.5）℃、5%CO2、95% 空气、饱和湿度］（Forma Scientific，美国）中进行细胞体外成熟培养，每孔加入 500 μL 培养液（TCM199 培养液 + 10% FBS + 10% 猪卵泡液 + 10 IU/mL 孕马血清促性腺激素 + 10 IU/mL 人绒毛膜促性腺激素），并在其上覆以灭菌矿物油，培养 42～46 h 后，得到 MⅡ期卵母细胞。实验时，MⅡ期卵母细胞用 0.1% 透明质酸酶消化去除卵丘细胞，再用 TCM199 培养液洗涤 3～5 次，备用。
1.3. 微流控芯片及微混合系统
微流控芯片由 Y 型入口、蛇形混合通道及细胞操作腔组成，Y 型通道入口长为 10 mm，蛇型通道长 17 mm，整个管道总长约为 135 mm，细胞操作腔内左右各设置有一排圆柱型障碍物，圆柱型底面直径为 100 μm，两圆柱型间隔为 50 μm，保证细胞在低温保护剂加载或去除时，不易被溶液冲走。微混合系统如图 1 所示。将微流控芯片放置于体视显微镜下，使用两个微注射泵（Pump 11 Pico Plus Elite，Harvard，美国）和两个 1 mL 平头液相微量进样针（上海高鸽工贸有限公司，中国），分别将低温保护剂溶液和缓冲溶液注入芯片。
图 1.
Microfluidic chip and microfluidic mixing system
微流控芯片及微混合系统
1.4. 卵母细胞冷冻保护剂去除方案
1.4.1. 微流控法去除时间优化
如图 2 所示，微流控法去除时间优化时，首先进行卵母细胞低温保护剂两步法加载：将消化好的细胞放入低温保护剂Ⅰ中平衡 3 min 后，迅速转移至低温保护剂Ⅱ中平衡 30 s，然后进行保护剂微流控法去除。实验中，基于文献[26]及简化实验因素的原因，课题组暂未考虑其他两种因素，仅选定 1 mol/L 蔗糖溶液作为微流控法去除液，故微流控法去除保护剂时，芯片的两个入口处分别通入 1 mol/L 蔗糖溶液和 TCM199 培养液，设置 1 mol/L 蔗糖溶液流速占总流速的百分比从 100% 线性减小至 0%，TCM199 培养液的流速占总流速的百分比从 0% 线性增加至 100%，总流速为 5 μL/min，去除总时间分别设为 6 min、8 min、10 min。
图 2.
Flowchart of the unloading time optimization of microfluidic removal method
微流控法去除时间优化过程流程图
1.4.2. 微流控法去除液成分及浓度优化
在优化微流控法去除溶液的种类和浓度时，操作过程如图 3 所示，去除总时间选用 1.4.1 微流控法去除时间优化实验中测定出存活率及体外发育情况最好时的去除总时间。选用的去除液组成及配比如表 1 所示。
图 3.
Flowchart of the composition and concentration of diluting solutions optimization of microfluidic removal method
微流控法去除液成分及浓度优化过程流程图
表 1. The composition and ratio of dilution solution.
微流控法去除溶液的组成及配比
| 样品名称 | 蔗糖/g | 葡萄糖/g | 海藻糖/g | 基础液/mL |
| 0.5 mol/L 蔗糖去除液 | 0.855 8 | - | - | 5 |
| 1 mol/L 蔗糖去除液 | 1.711 5 | - | - | 5 |
| 2 mol/L 蔗糖去除液 | 2.567 3 | - | - | 5 |
| 0.5 mol/L 葡萄糖去除液 | - | 0.450 4 | - | 5 |
| 1 mol/L 葡萄糖去除液 | - | 0.900 8 | - | 5 |
| 2 mol/L 葡萄糖去除液 | - | 1.351 2 | - | 5 |
| 0.5 mol/L 海藻糖去除液 | - | - | 0.945 8 | 5 |
| 1 mol/L 海藻糖去除液 | - | - | 1.891 7 | 5 |
| 2 mol/L 海藻糖去除液 | - | - | 2.837 5 | 5 |
1.4.3. 一步法、两步法、微流控法去除
采用传统两步法对细胞进行低温保护剂加载，再分别采用一步法、两步法和微流控法进行保护剂去除，加载与去除过程如图 4 所示。
图 4.
Flowchart of traditional and microfluidic removal method
传统方法与微流控法去除过程流程图
低温保护剂两步法加载：将消化好的细胞放入低温保护剂Ⅰ中平衡 3 min 后，迅速转移至低温保护剂Ⅱ中平衡 30 s。一步法去除为：将加载后的细胞迅速移至 TCM199 培养液中，平衡 10 min。两步法去除为：将加载后的细胞先转移到两步法去除液Ⅰ中，平衡 5 min 后，再转移至去除液Ⅱ中，平衡 5 min。微流控法去除为：使用细胞口吸器将已加载了低温保护剂的细胞移入微流控芯片中，芯片的两个入口处分别通入 1.4.2 中优化出的微流控法去除液和 TCM199 培养液，设置微流控法去除液流速占总流速从 100% 线性减小至 0%，TCM199 培养液流速占总流速从 0 线性增加至 100%，总流速为 5 μL/min，去除总时间为 1.4.1 中优化出的去除时间。
1.5. 卵母细胞保护剂去除方案效果评价
卵母细胞存活率检测：采用二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）染色法[19-20]检测不同低温保护剂加载去除方案对卵母细胞细胞膜及胞内酯酶系统完整性和活性的影响。将已去除低温保护剂的卵母细胞放入 TCM199 培养液中洗涤 3 次，转移至 10% FDA 染色液中，在培养箱中避光染色 5～10 min 后，再用 TCM199 培养液洗涤 3～5 次，立即拿到荧光显微镜（1XY71，OLYMPUS，日本）下进行观察。胞质发荧光的卵母细胞视为有活力，不发荧光或荧光较弱的均视为死细胞。
卵母细胞体外发育能力检测：采用电激活的方法对卵母细胞进行孤雌激活[21-23]，检测不同低温保护剂加载去除方案对卵母细胞体外成熟发育的影响。将加载并去除低温保护剂后的 MⅡ期卵母细胞放入电激活融合液中平衡 1～3 min，转入铺满激活液的 0.5 mm 宽度的激活槽中，使用电融合仪（BTX2001，SanDiego，美国），在电场强度 1.2 kV/cm、脉冲时间 30 μs、1 次脉冲条件下对卵母细胞进行电激活处理。激活后的孤雌激活胚胎放入胚胎培养液中培养 4～5 h，再转移至胚胎培养液中进行孤雌激活胚胎培养。激活后第 7 天观察胚胎发育情况，统计胚胎所处的发育时。其中，卵裂后拥有 2、4、8、16 个细胞的胚胎分别为 2 细胞时期胚胎、4 细胞时期胚胎、8 细胞时期胚胎和 16 细胞时期胚胎，多于 16 个胞但还未分化出空腔的胚胎为桑椹胚时期胚胎。
1.6. 数据分析
采用 SPSS Statistics 19.0 软件中 One way ANOVA、Duncan’s 新复极差法进行分析，以 P < 0.05 作为差异是否具有统计学意义的评判标准。
2. 结果与讨论
2.1. 微流控法不同去除时间对卵母细胞的影响
细胞在保护剂加载（去除）过程中暴露在保护剂中的时间，会增加保护剂渗透作用和化学毒性对细胞的损伤，因此，以传统去除方法的总去除时间为依据[19]，比较了微流控法不同去除时间对卵母细胞存活率和体外发育潜能的影响，结果如表 2 所示，其中对照组为不经过低温保护剂加载及去除处理的 MⅡ期卵母细胞。
表 2. Effect of unloading time on developmental capacity of oocytes by microfluidic removal method.
微流控去除法不同去除时间卵母细胞体外发育情况
| 组别 | 存活率 | 2-细胞率 | 4-细胞率 | 8-细胞率 | 16-细胞率 | 桑椹胚率 |
| *P < 0.05， **P < 0.01，与对照组相比； △P < 0.05， ▽P < 0.01，与 6 min 组相比； ▲P < 0.05， ▼P < 0.01，与 8 min 组相比；每组样本量均≥45 | ||||||
| 对照组 | 98.53% ± 2.94% | 10.80% ± 2.41% | 4.36% ± 4.36% | 0% ± 0% | 0% ± 0% | 78.22% ± 1.34% |
| 6 min 组 | 73.33% ± 1.48%** | 18.82% ± 1.66% | 7.94% ± 2.91% | 8.38% ± 4.78% | 2.94% ± 4.16% | 43.09% ± 2.70%** |
| 8 min 组 | 95.99% ± 4.64%▽ | 0% ± 0%△ | 15% ± 2.36% | 2.08% ± 2.95% | 0% ± 0% | 74.17% ± 1.18%▽ |
| 10 min 组 | 76.74% ± 1.42%**▼ | 7.89% ± 11.16% | 2.63% ± 3.72%▲ | 11.76% ± 16.64% | 5.57% ± 0.44% | 50.15% ± 3.94%**△▼ |
如表 2 所示，微流控法 8 min 去除方案下，细胞的存活率（95.99% ± 4.64%）与 6 min 组（73.33% ± 1.48%）和 10 min 组（76.74% ± 1.42%）相比，差异具有统计学意义（P < 0.01），与对照组卵母细胞存活率相比（98.53% ± 2.94%）差异无统计学意义。不同处理方法得到的卵母细胞电激活并培养 7 d 后，8 min 组仅有 17.08% ± 3.78% 的胚胎未能跨越 8-细胞时期，74.17% ± 1.18% 的胚胎都发育到了桑椹胚阶段，与对照组（15.16% ± 4.98%；78.22% ± 1.34%）相比，差异无统计学意义；6 min 组存活率与 10 min 组相比，差异无统计学意义，但电激活后仅有 43.09% ± 2.70% 的胚胎发育到了桑椹胚时期，其桑椹胚率与 10 min 组（50.15% ± 3.94%）相比，差异具有统计学意义（ P < 0.05）。这可能是因为，去除时间较短（6 min）时，相同注射模式下，细胞周围溶液形成的浓度梯度较大，对细胞造成的渗透性损伤也较大，而去除时间较长（10 min）时，相同注射模式下，细胞周围洗脱液形成的浓度梯度虽然较小，但细胞在洗脱液中暴露的时间过长，对细胞造成的毒性损伤抵消了浓度梯度较小带来的优势，不利于细胞后期的发育。
2.2. 微流控法不同去除溶液对卵母细胞的影响
为了探究不同去除溶液对卵母细胞的影响，使用微流控法比较了不同浓度的蔗糖、葡萄糖、海藻糖去除液对 MⅡ期卵母细胞存活率及体外发育潜能的影响，结果如表 3 所示，其中对照组为不经过低温保护剂加载及去除处理的 MⅡ期卵母细胞。
表 3. Eeffect of composition and concentration of diluting solutions on developmental capacity of oocytes by microfluidic removal method.
微流控法不同浓度去除液卵母细胞体外发育情况
| 组别 | 存活率 | 2-细胞率 | 4-细胞率 | 8-细胞率 | 16-细胞率 | 桑椹胚率 |
| *P < 0.05， **P < 0.01，与对照组相比； △P < 0.05， ▽P < 0.01，与 0.5 mol/L 蔗糖去除液组相比； ▲P < 0.05， ▼P < 0.01，与 1 mol/L 蔗糖去除液组相比； □P < 0.05， □□P < 0.01，与 2 mol/L 蔗糖去除液组相比； ■P < 0.05， ■■P < 0.01，与 0.5 mol/L 葡萄糖去除液组相比； ○P < 0.05， ○○P < 0.01，与 1 mol/L 葡萄糖去除液组相比； ●P < 0.05， ●●P < 0.01，与 2 mol/L 葡萄糖去除液组相比； ♢P < 0.05， ♢♢P < 0.01，与 0.5 mol/L 海藻糖去除液组相比； ♦P < 0.05， ♦♦P < 0.01，与 1 mol/L 海藻糖去除液组相比；每组样本量均≥45 | ||||||
| 对照组 | 98.53% ± 2.94% | 10.80% ± 2.41% | 4.36% ± 4.36% | 0% ± 0% | 0% ± 0% | 78.22% ± 1.34% |
| 蔗糖去除液 | ||||||
| 0.5 mol/L | 96.61% ± 3.99% | 6.25% ± 8.84% | 12.13% ± 0.52% | 0% ± 0% | 7.97% ± 5.37% | 62.75% ± 5.55%* |
| 1 mol/L | 95.99% ± 4.64% | 0% ± 0% | 15% ± 2.36% | 2.08% ± 2.95% | 0% ± 0% | 74.17% ± 1.18% |
| 2 mol/L | 61.01% ± 6.70%**▽▼ | 5.83% ± 1.18% | 7.5% ± 10.61% | 0% ± 0% | 0% ± 0% | 22.5% ± 3.54%**△▼ |
| 葡萄糖去除液 | ||||||
| 0.5 mol/L | 89.35% ± 2.70%□□ | 17.78% ± 6.29%▲ | 2.78% ± 3.93% | 0% ± 0% | 3.33% ± 4.71% | 57.22% ± 5.50%* |
| 1 mol/L | 95.06% ± 5.89%□□ | 7.74% ± 0.84% | 6.25% ± 8.84% | 7.14% ± 10.10% | 7.74% ± 0.84% | 59.23% ± 7.16%*□ |
| 2 mol/L | 57.33% ± 9.77%**▽▼■■○○ | 3.33% ± 4.71% | 0% ± 0% | 0% ± 0% | 2.94% ± 4.16% | 31.37% ± 2.77%**△▲ |
| 海藻糖去除液 | ||||||
| 0.5 mol/L | 81.90% ± 3.54%*△▲□□○ | 8.06% ± 5.24% | 5.88% ± 7.29% | 2.94% ± 4.16% | 2.17% ± 3.07% | 46.68% ± 7.78%* |
| 1 mol/L | 80.30% ± 3.82%*△▼□□○●● | 7.85% ± 0.22% | 2% ± 2.83% | 2% ± 2.83% | 4% ± 5.66% | 58.77% ± 3.92%*□ |
| 2 mol/L | 68.11% ± 5.75%**▽▼■■○○♢♢♦♦ | 11.25% ± 1.77% | 0% ± 0% | 3.13% ± 4.42% | 0% ± 0% | 27.5% ± 3.54%**△▲○♦ |
如表 3 所示，3 种去除液中，0.5 mol/L 组和 1 mol/L 组存活率及体外成熟发育情况均优于 2 mol/L 组。原因可能是 2 mol/L 组去除液浓度过高，使得细胞在去除过程中体积发生变化，增加了细胞需承受的机械应力，造成了细胞的渗透性损伤。虽然大部分 0.5 mol/L 组的存活率及体外发育情况与 1 mol/L 组相比，差异无统计学意义，但不同去除液处理得到的卵母细胞 0.5 mol/L 组的桑椹胚率普遍略低于 1 mol/L 组。比如 0.5 mol/L 蔗糖组与 1 mol/L 蔗糖组相比，有 7.97% ± 5.37% 的胚胎滞留在了 16-细胞阶段，因此其桑椹胚率略低于 1 mol/L 蔗糖组和对照组，造成这一现象的原因可能是 0.5 mol/L 去除液能提供给细胞的渗透压小于 1 mol/L 组，细胞受到的渗透性损伤及残留在细胞中的低温保护剂造成的毒性损伤，影响了卵母细胞的存活率及体外发育情况。
另外，3 种去除液中，蔗糖、葡萄糖的效果均好于海藻糖。0.5 mol/L、1 mol/L 蔗糖组和 1 mol/L 葡萄糖组的细胞存活率分别能达到 96.61% ± 3.99%、95.99% ± 4.64% 和 95.06% ± 5.89%，三者相比差异无统计学意义，且三者与对照组（98.53% ± 2.94%）相比，差异无统计学意义，但海藻糖组存活率与对照组相比差异均有统计学意义（0.5 mol/L、1/mol/L 海藻糖去除液组 vs. 对照组，P < 0.05；2 mol/L 海藻糖去除液组 vs. 对照组，P < 0.01）。不同去除液处理得到的卵母细胞电激活并培养 7 d 后，仅 1mol/L 蔗糖去除液组的桑椹胚率（74.17% ± 1.18%）与对照组（78.22% ± 1.34%）相比，差异无统计学意义。葡萄糖组中 1 mol/L 组与蔗糖 1 mol/L 组相比，滞留在 16-细胞时期的胚胎数较多（7.74% ± 0.84%），因此桑椹胚率略低于蔗糖 1 mol/L 组。海藻糖组中体外发育较好的 1 mol/L 组也和葡萄糖组类似，但细胞本身存活率就低，因此体外成熟发育情况最不理想。
糖类对细胞起到的保护作用十分复杂，已有研究表明，相比于二糖，单糖是较好的渗透缓冲液[25]，但从以上 3 种不同去除溶液的实验结果来看，1 mol/L 蔗糖去除液最有利于卵母细胞低温保护剂去除后的存活和体外发育，这可能是因为蔗糖在细胞脱水时能通过氢键与大分子中极性残基结合，因而具有稳定蛋白质与膜的作用[26]；海藻糖溶液虽然在脱水环境中保护细胞蛋白质和膜的机制类似于蔗糖[27]，但却不是很好的渗透压缓冲液；葡萄糖溶液在去除时虽然是很好的渗透压缓冲液，但不具有类似蔗糖稳定蛋白质分子的机制，造成的蛋白质及膜损伤，直接影响了细胞孤雌激活后胚胎的发育能力。
2.3. 传统去除法与微流控法对卵母细胞的影响
为探究微流控装置用于卵母细胞低温保护剂去除的有效性，比较了传统的一步法、两步法与微流控法对猪 MⅡ期卵母细胞的存活率和体外发育潜能的影响，结果如表 4 所示，其中对照组为不经过低温保护剂加载及去除处理的 MⅡ期卵母细胞。
表 4. Effect of different unloading methods on developmental capacity of oocytes.
不同去除方案卵母细胞体外发育情况
| 组别 | 存活率 | 2-细胞率 | 4-细胞率 | 8-细胞率 | 16-细胞率 | 桑椹胚率 |
| *P < 0.05， **P < 0.01，与对照组相比； △P < 0.05， ▽P < 0.01，与一步法相比； ▲P < 0.05， ▼P < 0.01，与两步法相比；每组样本量均≥45 | ||||||
| 对照组 | 98.53% ± 2.94% | 10.80% ± 2.41% | 4.36% ± 4.36% | 0% ± 0% | 0% ± 0% | 78.22% ± 1.34% |
| 一步法 | 52.5% ± 2.22%** | 7.76% ± 3.91% | 35.66% ± 13.21%* | 5.13% ± 0.19%* | 7.63% ± 3.35% | 0% ± 0%** |
| 两步法 | 63.25% ± 2.96%**△ | 12.13% ± 0.52% | 17.77% ± 4.33% | 14.83% ± 8.49% | 10.66% ± 2.60%* | 18.01% ± 7.80%**△ |
| 微流控法 | 95.99% ± 4.64%▽▼ | 0% ± 0%*▲ | 15% ± 2.36% | 2.08% ± 2.95% | 0% ± 0%▲ | 74.17% ± 1.18%▽▼ |
如表 4 所示，使用微流控法去除低温保护剂时，卵母细胞的存活率（95.99% ± 4.64%）明显高于一步法（52.5% ± 2.22%）和两步法（63.25% ± 2.96%），与对照组卵母细胞存活率（98.53% ± 2.94%）相比，差异无统计学意义。不同处理方法得到的卵母细胞电激活并培养 7 d 后，由一步法处理得到的胚胎大部分都停留在了 4-细胞时期（35.66% ± 13.21%），极少数能跨越 4-细胞时期，但不能继续发育至桑椹胚时期；由两步法处理得到的胚胎在体外发育停滞时期分布的较为均匀，但能发育至桑椹胚阶段的胚胎（18.01% ± 7.80%）与对照组（78.22% ± 1.34%）间的差异具有统计学意义（P < 0.01）；由微流控法处理得到的胚胎停留在 4-细胞时期的数量几乎只有两步法的一半，大部分胚胎（74.17% ± 1.18%）都能跨越 8-细胞时期，发育至桑椹胚时期，其桑椹胚率与一步法组、两步法组桑椹胚率相比差异具有统计学意义（ P < 0.01）且与对照组桑椹胚率相比，差异无统计学意义。
已有研究表明两步法加载（去除）时，细胞体积变化比一步法小[15]，微流控法可以实现细胞周围溶液浓度的缓慢增加或减少，细胞在加载（去除）过程中体积变化较传统方法更小，因此微流控法细胞实验结果优于传统方法。此外，人类及猪胚胎基因组激活发生在 4-细胞到 8-细胞阶段[24]，因此能否成功跨越 4-细胞、8-细胞阶段，对激活后的卵母细胞很关键，可以间接作为考量卵母细胞前期处理方法是否得当的依据。研究结果表明，微流控法能循序渐进地改变细胞周围的生存环境，因此能够使得大部分细胞都跨越 8-细胞时期。
3. 结论
本文利用以微流控芯片为中心搭建的微混合系统，对猪 MⅡ期卵母细胞低温保护剂的去除方案进行了优化研究。对微流控法的去除总时间、去除液成分及浓度进行了优化实验，并比较了传统的分步法去除与连续性去除对卵母细胞存活率及体外成熟发育的影响。实验结果表明，使用传统两步法对卵母细胞加载保护剂后，采用微流控法去除保护剂，总去除时间 8 min 时，1 mol/L 蔗糖去除液最有利于卵母细胞低温保护剂去除后的存活和体外发育；微流控法去除卵母细胞低温保护剂后，卵母细胞的存活率、体外发育情况，均好于传统去除方法。以上结论验证了连续性去除法的有效性，为微流控法用于去除卵母细胞低温保护剂提供了依据。
Funding Statement
国家自然科学基金（51376132）；上海市自然科学基金（13ZR1429200）
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