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. 2023 Jun 20;43(6):964–969. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.06.11

肠道菌群在体外循环心脏手术后围手术期神经认知障碍中的作用：基于菌群人源化大鼠模型

Role of gut microbiota in perioperative neurocognitive disorders after cardiopulmonary bypass surgery in rats with humanized gut flora

范 嘉宁 1, 孙 莹杰 2, 梁 冰 2, 张 霄燕 2, 肖 诚 3, 黄 泽清 1,*
PMCID: PMC10339293  PMID: 37439168

Abstract

目的

通过肠道菌群人源化大鼠模型探讨体外循环（CPB）后肠道菌群紊乱可否通过激发炎症反应参与围手术期神经认知障碍（PND）的发生。

方法

SPF级成年雄性SD大鼠30只随机分为3组（n=10）：伪无菌大鼠（S）组、伪无菌大鼠+接种健康人源粪菌滤液（NP）组和伪无菌大鼠+接种PND患者粪菌滤液（P）组。造模成功后对所有组别大鼠粪便进行宏基因组学检测，Elisa法测定血清炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量，Western-blot法检测海马组织中GFAP、p-Tau蛋白的表达水平，Morris水迷宫实验评估造模后学习和记忆等认知功能。

结果

宏基因组学测序结果显示粪菌移植后3组大鼠肠道菌群各自聚集，分区良好；S组克雷伯氏菌属（Klebsiella）（P < 0.005）、P组阿克曼菌属（Akkermansia）（P < 0.005）、NP组拟杆菌属（Bacteroides）（P < 0.005）相对丰度显著增高，差异有统计学意义；与S组相比，NP组和P组IL-1β（P < 0.05）、IL-6（P < 0.05）和TNF-α（P < 0.05）的浓度显著降低，GFAP（P < 0.05）、p-Tau（P < 0.05）蛋白表达水平均下降，NP组逃生平台穿越次数（P < 0.05）和兴趣象限停留时间（P < 0.05）均明显增加，P组逃生平台穿越次数（P > 0.05）和兴趣象限停留时间（P > 0.05）均增加，但无统计学差异；与P组相比，NP组IL-1β（P < 0.05）、IL-6（P < 0.05）和TNF-α（P < 0.05）的浓度显著降低，GFAP（P < 0.05）、p-Tau（P < 0.05）蛋白表达水平均下降，逃生平台穿越次数（P < 0.05）和兴趣象限停留时间（P < 0.05）均明显增加。

结论

肠道菌群的差异性组成参与了CPB心脏手术后PND的发生，其机制可能与炎症反应的发生相关。

Keywords: 肠-脑轴, 宏基因组学, 体外循环, 围手术期神经认知障碍

围手术期神经认知障碍（PND）是体外循环（CPB）下心脏手术后常见的中枢神经系统并发症，包括患者在术前及术后一年内发生的所有与认知功能相关的改变[1-3]。PND的发生影响CPB患者的预后，可增加其住院时间、住院费用、出院后再入院率和术后死亡率等[2, 4]。目前普遍认为PND的发病机制主要涉及中枢胆碱能系统功能减退、神经递质或受体异常、载脂蛋白E基因异常和全身炎症反应综合征，而神经炎症的级联反应可被认为是PND发生、发展的中心环节[5]。然而CPB心脏手术后发生的PND尚无有效的临床预防措施，诊断率也相对较低。由此可见，PND的早期鉴别及其发病机制的探索对降低CPB心脏手术后患者并发症的发生率与死亡率十分重要，具有临床意义。

近年来，越来越多的研究将肠道菌群作为治疗和预防神经系统相关疾病的关键靶点。已有证据支持肠道菌群既参与围术期神经认知功能障碍的发生，干预其转归[6, 7]，又与炎症反应的发生密切相关，常与其一起介导多种疾病[8, 9]。有研究表明孤独症或抑郁症患者的肠道微生物群组成异常，而经益生菌治疗后，肠道菌群功能失调得到改善，神经精神病学症状也得到了明显改善[10]。另外，有研究者发现无菌小鼠脑部的小胶质细胞表型比例发生明显改变，大脑功能显著受损；而给予重新定植菌群后部分小胶质细胞比例逐渐恢复正常，认知功能有所改善[11, 12]。这些证据均证明肠道菌群与大脑相关疾病关系密切，可远程调控宿主的行为和学习记忆能力。然而目前的研究多基于阿尔兹海默症（AD）和抑郁症等疾病，且集中于APP/PS1转基因小鼠[13]，而关于围术期PND菌群的研究也多集中于动物实验，关于体外循环致PND患者菌群变化的研究更是鲜有报道。因此本研究拟借助菌群人源化动物模型评价失调的肠道菌群是否通过参与了全身炎症反应，进而影响PND的发生发展。

1. 材料和方法

1.1. 材料

85-2数显恒温磁力搅拌器（常州市亿能实验仪器厂）。氨苄西林、硫酸新霉素、甲硝唑（Sigma）。SuperMAZE软件（上海欣软科技公司）。DYCP-32C型琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂），Covaris M220超声波破碎仪（Covaris），Qubit 2.0量子位荧光定量仪（Life Technologies），Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies）。Universal 320低温离心机（Sigma），酶免试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。GFAP、p-Tau、山羊抗兔IgG抗体（Affinity）。

1.2. 方法

1.2.1. 一般资料

本研究经由北部战区总医院伦理委员会批准[伦审Y(2020)005号]，招募健康志愿者及在北部战区总医院心脏外科行CPB下心脏瓣膜手术后发生PND的患者各10例。健康志愿者为受教育程度≥初中，体质量指数（BMI）在17.5~30.0 kg/m2，简易智力状态检查量表（MMSE）评分≥27分，抑郁症筛查量表（PHQ-9）和广泛性焦虑障碍量表（GAD-7）评分均 < 5分，无功能或器质性肠道系统疾病史，无脑卒中病史或其他器质性脑病史，近3个月未连续服用抗生素制剂超过7 d的成年人；PND患者为受教育程度≥初中，BMI在17.5~30.0 kg/m2，术前MMSE评分≥27分，无功能或器质性肠道系统疾病史，无脑卒中病史或其他器质性脑病史，行体外循环下的心脏瓣膜手术，术后发生PND（根据3D-CAM/CAM-ICU谵妄量表评估）的成年人。

1.2.2. 制备粪菌悬液

所有志愿者于入组后7 d内采集清晨新鲜粪便标本约3 g于无菌采便盒内、-80 ℃保存。由1名接受过严格无菌操作培训的人员制作粪菌悬液：将粪便标本置于50 mL小烧杯内并按1∶10的比例加入无菌生理盐水（1 g粪便加入10 mL生理盐水），以无菌透明贴膜密封，于磁力搅拌器上搅拌15 min，用离心管收集混悬液并以1000 r/min，4 ℃，离心1 min，上层液即为粪菌悬液，-80 ℃保存用于制作菌群人源化大鼠模型。

1.2.3. 粪菌移植

经由北部战区总医院动物实验伦理委员会批准（2020004），由沈阳药科大学动物实验科提供SPF级成年雄性SD大鼠30只，体质量400~450 g，4~5月龄，分笼饲养，期间自由饮水、摄食。造模前，对各组大鼠进行为期7 d，4次/d的水迷宫训练，剔除不会游泳和智能低下的大鼠。按随机数字表法将大鼠随机分为3组：伪无菌大鼠组（S组）、伪无菌大鼠+接种健康人源粪菌滤液组（NP组）和伪无菌大鼠+接种PND患者粪菌滤液组（P组），每组10只。第1~14天给予S组、NP组和P组由氨苄西林（250 mg/kg）、硫酸新霉素（250 mg/kg）、甲硝唑（250 mg/kg）混合配制而成的抗生素鸡尾酒灌胃处理，2次/d，2 mL/次；第15~28天NP组、P组大鼠再分别接受健康人和PND患者的粪菌悬液0.5 mL灌肠处理，2次/d，具体流程如下：大鼠俯卧位，搔刮大鼠下腹部尽量排空留存粪便，无菌生理盐水润滑内径约2 mm的塑料软管并轻柔置入直/结肠，至软管顶端距离肛门约8 cm处缓缓注入粪菌液0.5 mL，轻柔拔出软管后用无菌纱布或棉签压住肛门几秒，执鼠尾使大鼠保持头底脚高姿态约1 min后放回笼中。

1.2.4. Morris水迷宫实验

入组后第1天及造模成功后第1天，对所有组别大鼠进行水迷宫测试并采集轨迹图像及数据：直径1.8 m，水深0.6 m的圆形水箱被划分为4个相等的区域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），水面下1.5 cm处设有逃生平台（直径10 cm），位于Ⅰ象限。去除逃生平台，将大鼠悬尾贴壁轻柔放入水面中，入水点为第Ⅲ象限水箱壁中点。SuperMAZE软件记录1 min内大鼠的运动轨迹、穿越逃生平台的次数和兴趣象限（即逃生平台所在象限）停留时间，以此判断大鼠空间记忆的能力。

1.2.5. 宏基因组学测序检测肠道菌群组成

搔刮法取大鼠粪便2~3颗并即刻用无菌冻存管收集至-80 ℃冰箱保存，由深圳微生态科技有限公司进行宏基因组学测序，采用CTAB法提取粪便样本DNA，琼脂糖凝胶电泳仪分析DNA的纯度和完整性，合格后使用超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用量子位荧光定量仪进行初步定量，稀释文库，随后使用生物分析仪对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量。文库检测合格后，使用Illumina PE150（2×150）高通量测序平台进行测序。

1.2.6. ELISA法测定血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量

取粪便完成后采用深麻醉状态下脊椎脱臼法处死大鼠，无菌取静脉血，静置30 min，置于低温离心机内以3000 r/min离心10 min后，留取上清液-80℃保存直至检测。参照酶免试剂盒说明书操作采用酶联免疫吸附法（Elisa）检测炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量：96T酶标包被板上设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔，对应加入标准品稀释液和待测样品稀释液（样品最终稀释度为5倍），封板膜封板后置于37 ℃温育30 min；洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应30 min；洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃温育10 min；加入终止液，15 min内读取A值并计算出浓度，复孔1次。

1.2.7. Western blot法检测海马组织GFAP和p-Tau蛋白的表达

冰上剥离右侧海马组织，于-80 ℃冰箱内保存供Western blot检测肠胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和磷酸化Tau蛋白（p-Tau蛋白）：结肠组织剪碎后加入裂解液，震荡摇匀后于4 ℃、13 000 r/min条件下离心15 min，取上清液加入配置好的SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳分离，PVDF湿转法转膜，封闭蛋白抗原，洗膜后加入GFAP抗体（稀释度1∶1000）和p-Tau抗体（稀释度1∶1000）孵育，4 ℃下摇床，过夜封闭；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释度1∶10 000），室温孵育60 min，再次洗膜后加入按1∶1比例配置的ECL发光液，暗室内曝光、显影、定影及胶片扫描，蛋白相对表达量为蛋白条带光密度值/内参光密度值×100%，内参蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

1.3. 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析，符合正态分布及方差齐性的计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素或双因素方差分析，之后应用Tukey's检验进行两两比较，采用主坐标分析（PCoA）观察3组肠道菌群组成的差异性，P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 各组大鼠肠道菌群的聚类分析

PCoA分析结果显示粪菌移植后3组大鼠肠道菌群各自聚集，分区良好，提示3组样本定植的肠道微生物结构存在显著差异（图 1）。

图 1.

图 1

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3组大鼠肠道菌群的PCoA分析

PCoA analysis of gut microbiota of the rats in the 3 groups. Axis 1, Axis 2 and Axis 3 denote the first, second and third principal components, respectively, and the percentages indicate the contribution of each principal component to the variance of the samples.

2.2. 各组大鼠肠道菌群在属水平上的差异性分析

在属水平上，3组大鼠肠道菌群的特征性菌群有显著差别，S组克雷伯氏菌属（Klebsiella）（P < 0.005）、P组阿克曼菌属（Akkermansia）（P < 0.005）、NP组拟杆菌属（Bacteroides）（P < 0.005）相对丰度显著增高，差异有统计学意义。与S组相比，P组和NP组克雷伯氏菌属（Klebsiella）相对丰度显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05），而P组和NP组间无统计学差异（P > 0.05）；与P组相比，S组和NP组阿克曼菌属（Akkermansia）相对丰度显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05），而S组和NP组间无统计学差异（P > 0.05）；与NP组相比，S组和P组拟杆菌属（Bacteroides）相对丰度显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05），而S组和P组间无统计学差异（P > 0.05，图 2）。

图 2.

图 2

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3组大鼠肠道菌群在属水平上的变化分布图

Composition analysis of gut mirobiota at the genus level among the 3 groups. A: Relative abundance of Klebsiella; B: Relative abundance of Akkermansia; C: Relative abundance of Bacteroides. **P < 0.005 vs S group; ##P < 0.005 vs P group.

2.3. 各组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度的比较

3组大鼠肠道菌群组成不同时，其血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度也有显著差异。与S组相比，P组和NP组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度均降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与P组相比，NP组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05，表 1）。

表 1.

3组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α浓度的比较

Comparison of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α levels among the 3 groups (n=10, Mean±SD)

Factor (pg/mL) S group P group NP group F P
*P < 0.05 vs S group, #P < 0.05 vs P group.
IL-1β 54.65±4.68# 49.41±9.92* 44.73±5.24*# 32 < 0.001
IL-6 155.50±12.13# 143.40±27.42* 128.10±15.29*# 15 < 0.001
TNF-α 400.30±26.34# 373.90±55.59* 344.70±29.25*# 75 < 0.001
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2.4. Western blot法检测与认知功能相关特异性蛋白GFAP和p-Tau蛋白的表达

3组大鼠肠道菌群组成不同时，其与认知功能相关特异性蛋白GFAP和p-Tau蛋白的表达水平有显著差异。与S组相比，P组和NP组海马组织GFAP、p-Tau蛋白表达水平下降（P < 0.05）；与P组相比，NP组GFAP、p-Tau蛋白表达水平下降（P < 0.05，表 2）。

表 2.

3组大鼠海马组织GFAP、p-Tau蛋白RQ值的比较

Comparison of RQ values of GFAP and p-Tau proteins in the hippocampal of the rats among the 3 groups (n=10, Mean±SD)

Item S group P group NP group F P
*P < 0.05 vs S group, #P < 0.05 vs P group.
GFAP 1.41±0.13# 0.87±0.07* 0.13±0.08*# 137.9 < 0.001
p-Tau protein 1.33±0.08# 0.43±0.06* 0.07±0.03*# 517.3 < 0.001
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2.5. 各组大鼠在Morris水迷宫空间探索实验中的表现

比较3组大鼠造模前的逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间，结果显示各组间无统计学差异（P> 0.05）；比较3组大鼠造模前后的逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间，结果显示S组和P组造模后逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间均比造模前明显降低，差异有统计学意义（P > 0.05），而NP组造模前后其逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间均无统计学差异（P>0.05）；比较3组大鼠造模后的逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间，结果显示与S组相比，NP组逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间均明显增加（P > 0.05），P组逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间均增加，无统计学差异（P>0.05）；与P组相比，NP组逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间均有所增加，差异有统计学意义（P > 0.05，表 3、4）。

表 3.

3组大鼠逃生平台穿越次数的比较

Comparison of the frequency of platform crossing among the 3 groups (n=10, Mean±SD)

Frequency of platform crossing Group
S P NP
*P < 0.05 vs S group (before modeling), #P < 0.05 vs S group (after modeling), △ P < 0.05 vs P group (before modeling), □P < 0.05 vs P group (after modeling).
Before modeling 5.10±1.45 5.30±1.34 4.90±1.60
After modeling 1.60±2.12* 2.80±1.32△ 5.10±1.20#□
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表 4.

3组大鼠兴趣象限停留时间的比较

Comparison of the duration of swimming in the interest quadrant among the 3 groups (n=10, Mean±SD)

Duration of swimming in interest quadrant (s) Group
S P NP
*P < 0.05 vs S group (before modeling), #P < 0.05 vs S group (after modeling), △ P < 0.05 vs P group (before modeling), □P < 0.05 vs P group (after modeling).
Before modeling 28.24±5.37 29.15±5.19 29.73±7.28
After modeling 16.85±2.95* 19.02±6.17△ 27.62±8.26#□
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3. 讨论

参照文献[14]改良制备伪无菌大鼠模型，有研究称经混合抗生素处理的伪无菌动物体内90%的肠道菌群可被消除，行为学表现与绝对无菌动物相似，并具有制备流程简单、成本低、应用范围广等优点，已逐渐成为研究肠道菌群与宿主关系时的经典空白模型[15]。菌群人源化动物模型是指借助粪菌移植（FMT）技术将人类的肠道菌群定植在伪无菌大鼠的消化道中，一方面可使实验动物的肠道菌群与人类更相近，实验结果与人类相关性更强；另一方面啮齿类动物可从动物行为学测试和分子生物学等各个层面提供研究数据，便于我们进行机制的探索和因果关系的推导[16]。因此借助此模型作为揭示肠道菌群与CPB后PND关系的突破口，可为临床治疗PND提供新靶点和新思路。本研究肠道菌群宏基因组学检测结果表明，粪菌移植后3组大鼠体内定植的肠道微生物结构存在显著差异，提示建模成功。

多项研究表明，特定肠道菌株及其代谢产物可发挥促炎或抗炎作用[17-19]。本研究结果发现在属水平上，S组Klebsiella、P组Akkermansia和NP组Bacteroides的相对丰度显著增高，且差异具有统计学意义。众所周知，Klebsiella是克雷伯肺炎的主要致病菌，其感染还可能导致败血症、化脓性脑膜炎等炎性疾病的发生[20]；Akkermansia一般被认为是益生菌，通过降解肠粘膜的粘蛋白而生存，其丰度增加可提高肥胖、Ⅱ型糖尿病等患者的代谢水平，并通过抑制LPS-TLR4/NF-κB信号通路来减轻炎症反应[21]，但最新研究证实高糖饮食的小鼠体内Akkermansia_ muciniphila的相对丰度异常增高，可导致结肠粘膜层变薄、肠屏障受损，进而促进肠内毒素向血液释放、诱发炎症的发生[22]；Bacteroides具有改变免疫应答的能力，可通过调节淋巴细胞和细胞因子的表达来减少炎症相关疾病的发生[23]，而Qu等[24]的研究还表明Bacteroides_fragilis对脂多糖诱导的全身炎症具有保护作用，可能与其诱导短链脂肪酸和IL-10的产生增加相关。而在本研究中，与S组相比，P组和NP组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度表达均降低，其中NP组降低更为显著，说明肠道菌群的差异性组成可影响炎症反应的严重程度，可能与不同肠道菌株丰度增加时发挥的促炎或抗炎作用相关。

目前，多学科领域研究均认为差异性肠道菌群组成与认知功能下降相关疾病关系密切[25-27]，但关于肠道菌群在CPB后PND中的作用及机制尚不明确。有证据支持炎症反应在神经退行性疾病的发生发展中发挥重要作用，IL-1β主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在炎性损伤时高度表达；IL-6是急性炎性反应标志物，其水平持续失调则会诱发炎症发生和过度的自身免疫[28]；TNF-α可通过促进T细胞产生各种炎症因子如IL-1、IL-6、IL-8等来驱动炎症反应，进而对神经元产生有害影响[29]。Vasunilashorn等[30]通过对术后谵妄患者不同时间点炎症因子表达水平的比较发现，IL-2水平可在谵妄发生前开始升高，IL-6可随谵妄发生和康复而升高或降低，这也意味着其血清炎症因子浓度与PND的发生与转归密切相关。本研究结果显示与S组相比，P组和NP组炎症反应程度减轻的同时逃生平台穿越次数、兴趣象限停留时间均明显增加，GFAP、p-Tau蛋白表达水平下降，而NP组的差异更为显著。Mirros水迷宫测试（MWMT）是评估大鼠认知功能最常用的动物行为学实验，其逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间与大鼠学习记忆能力成正相关。p-Tau蛋白作为微管相关蛋白家族一员，可导致神经元微管结构的广泛破坏和正常轴突功能的损害[31, 32]；GFAP为星形胶质细胞的特异性蛋白，其水平的升高提示星形胶质细胞活化，与神经退行性病变下降程度具有显著相关性[33]。结合本研究结果，提示伪无菌大鼠炎症反应严重、学习记忆能力受损显著、GFAP和p-Tau蛋白在海马组织高度表达；接受健康者源粪菌移植后明显缓解了炎症反应程度，改善了受损的学习记忆能力，抑制了GFAP和p-Tau蛋白的过度表达；而接受PND患者源粪菌移植后的大鼠学习记忆能力改善不明显，说明当肠道菌群作为唯一变量时干预了炎症的发生与转归，并且影响了大鼠的学习记忆能力。

综上，本研究通过建立菌群人源化大鼠模型和宏基因组学测序方法表明肠道菌群的差异性组成参与了CPB心脏手术后PND的发生，其机制可能与Akkermansia相对丰度的异常增高和促进炎症反应的发生相关，而Bacteroides可否成为CPB后PND的潜在治疗靶点则需要我们进行进一步论证。

Biography

范嘉宁，主治医师，E-mail: fanjianing0410@163.com

Funding Statement

国家自然科学基金（81471121）；辽宁省重点研发计划项目（2020JH2/10300051）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81471121)

Contributor Information

范 嘉宁 (Jianing FAN), Email: fanjianing0410@163.com.

黄 泽清 (Zeqing HUANG), Email: Huangzeqing1536@163.com.

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