茯苓酸缓解小鼠克罗恩病: 基于抑制 PI3K/AKT 信号通路拮抗肠上皮细胞凋亡

Abstract

目的

明确茯苓酸（PA）对2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠克罗恩病（CD）样结肠炎的作用效果及可能机制。

方法

将24只野生型小鼠随机分为对照组（WT组）、模型组（TNBS组）和PA干预组（PA组），每组8只。TNBS组和PA组采用TNBS诱导CD样结肠炎；PA组在TNBS造模的同时给予PA干预[5 mg/（kg·d），腹腔注射]，而WT组和TNBS组则每日给予等量的生理盐水腹腔注射。1周后处死小鼠，采用疾病活动度（DAI）评分、体质量改变、结肠长度、组织学炎症评分和小鼠结肠黏膜肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平（ELISA检测）评估肠炎程度；采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITCdextran）、肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）及跨上皮电阻抗值（TEER）评估小鼠肠屏障功能；TUNEL染色检测各组小鼠肠上皮细胞凋亡情况；通过网络药理学预测PA治疗CD可能的作用靶点；采用String平台和Cytoscape 3.7.2软件进行蛋白互作网络构建；采用David数据库对预测靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析；应用AutoDock 4.2.6进行PA与关键靶点的分子对接；采用Western blot检测各组小鼠结肠黏膜组织中p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平以验证KEGG富集分析结果。

结果

PA组小鼠DAI评分、组织学炎症评分、体质量降低幅度和结肠黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著低于TNBS组（P<0.05），但仍高于WT组（P<0.05）；PA组小鼠结肠长度显著长于TNBS组（P<0.05），但仍短于WT组（P<0.05）；PA组小鼠血清中FITC-dextran和I-FABP水平较TNBS组显著降低（P<0.05），但仍高于WT组（P<0.05），而肠组织TEER水平较TNBS组显著升高（P<0.05），但仍低于WT组（P<0.05）；PA组小鼠肠上皮细胞凋亡率显著低于TNBS组（P<0.05），但仍高于WT组（P<0.05）。通过数据库共筛选到PA和CD交集靶点248个；构建PPI网络得到PA作用于CD的核心靶点分别为EGFR、HRAS、SRC、MMP9、STAT3、AKT1、CASP3、ALB、HSP90AA1、HIF1A；GO功能富集分析显示PA对细胞凋亡进程具有负向调控作用，KEGG富集分析显示PA治疗CD可能与PI3K/AKT信号通路密切相关；分子对接显示PA与AKT1、ALB、EGFR、HSP90AA1、SRC及STAT3等6个靶点有较强的结合力；同时，Western blot检测结果显示PA组小鼠结肠黏膜组织中p-PI3K和p-AKT水平较TNBS组显著降低（P<0.05），但仍高于WT组（P<0.05）。

结论

PA可能通过调控PI3K/AKT信号通路拮抗肠上皮细胞凋亡保护肠屏障从而缓解TNBS小鼠CD样肠炎。

炎症性肠病（IBD）在我国的发病率呈现逐年增长的趋势, 尤以克罗恩病（CD）为甚^{[1, 2]}。CD以慢性复发性肠道炎症为主要病理特征, 具有不可治愈性和终身复发性特点^{[3, 4]}。药物治疗是CD的主要治疗方式, 然而即便在以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）单抗为代表的生物制剂广泛使用的情况下, CD的手术率仍然没有得到明显降低^{[5, 6]}。传统的免疫调节剂、激素和肠黏膜保护剂等多存在疗效不稳定、药物毒副作用、药物抵抗或药物不耐受等不足, 开发更为安全、有效的CD治疗药物是目前亟待解决的问题^{[5, 7]}。

茯苓酸（PA）是一种从茯苓中提取的天然羊毛脂三萜化合物^{[8, 9]}, 新近研究显示PA几乎无毒副作用且具有抗炎和细胞保护等多种生物学功能: PA不仅能够改善脂多糖诱导的大鼠急性肾损伤^[10], 还对H2O2诱导的牙髓细胞炎症反应具有抑制作用^[11]。此外, PA对氧化应激导致的内皮细胞损伤^[12]及缺氧/再氧诱导的神经元细胞损伤均具有保护作用^[13]。然而目前尚未见PA对CD作用效果的相关报道, 本研究拟以2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的小鼠结肠炎作为CD模型^[14], 观察PA干预对结肠炎的作用效果, 同时采用网络药理学和分子对接技术分析其可能的作用机制, 并于在体实验进行验证, 以期阐明PA应用于CD治疗的潜力。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 实验动物

选择雄性C57BL/6J小鼠（江苏集萃药康生物科技股份有限公司）, 6~8周龄, 体质量20±2 g, 饲养于无特定病原菌环境下。本项目获得蚌埠医学院伦理委员会批准（审批号: 伦动科批次[2022]第295号）。1.1.2药物和试剂PA（上海源叶生物科技有限公司, HPLC ≥ 97%）。TNBS和异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）（Sigma-Aldrich）。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（AKT）、磷酸化的AKT（p-AKT）, 磷酸化的PI3K（p-PI3K）及β-肌动蛋白（β-actin, Abcam）。TNF-α、白细胞介素1β（IL-1β）、及白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒（Santa Cruz）。肠型脂肪酸结合蛋白（I- FABP）ELISA试剂盒（博士德）。TUNEL染色试剂盒（Roche）。

1.2. 方法

1.2.1. 动物模型建立、干预和取检

将WT小鼠随机分为对照组（WT组）、模型组（TNBS组）和PA干预组（PA组）, 每组8只。TNBS组和PA组小鼠接受TNBS造模处理^{[15, 16]}: 采用1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg, 腹腔注射）进行麻醉, 待麻醉成功后使用2.5% TNBS酒精溶液（0.1 mL）对小鼠进行灌肠处理, 并保持头低足高倾斜体位15 min。造模当天, PA组小鼠给予PA干预[5 mg/（kg·d）, 腹腔注射], WT组和TNBS组每日给予等量的生理盐水。1周后采用颈椎脱臼法处死小鼠, 取检整段结肠、拍照并测量结肠长度; 将结肠沿纵轴剖开分为两段, 一段于福尔马林中固定, 一段冻存于-80 ℃冰箱。

1.2.2. 小鼠肠炎疾病活动度评分、体质量及结肠长度测量

小鼠肠炎症状采用肠炎疾病活动度（DAI）评分进行量化, 该量表的评分范围为0~5分, 分值越高肠炎症状越重^[17];实验期间每日记录小鼠体质量; 取检后测量小鼠结肠长度。

1.2.3. 小鼠肠炎组织学评估及肠黏膜炎症介质水平检测

对小鼠结肠组织进行苏木精-伊红（H & E）染色, 并参考Spencer推荐的肠炎组织学评分量表对小鼠结肠组织炎症进行量化评估, 该量表评分范围为0~4分, 评分越高代表肠炎越重^[18]。采用ELISA试剂盒检测小鼠结肠粘膜组织中炎症因子水平, 包括: TNF-α、IL-6和IL-1β。检测操作依据产品说明书进行。

1.2.4. 小鼠肠屏障功能检测

（1）在体肠通透性实验: 小鼠禁食4 h后给予FITC-dextran灌胃（600 mg/kg）处理, 4 h后处死小鼠, 行心脏穿刺采血, 并使用分光光度计测定血清中FITC-dextran水平; （2）小鼠外周血I-FABP检测: 收集小鼠外周血血清, 采用ELISA试剂盒检测IFABP水平。ELISA检测操作依据产品说明书进行; （3）检测跨上皮电阻值（TEER）测定: 使用PBS冲洗小鼠肠腔内容物, 将肠段置于克雷布斯缓冲液中（37 ℃, pH: 7.33~7.37）。肠管沿肠系膜轴切成2.8 mm×11 mm大小, 并放入矩形滑块中, 最后将滑块放入Ussing chamber系统（华纳仪器）。两腔均加入Krebs缓冲液, 血清侧加入10 mmol/L葡萄糖作为能量源, 管腔侧加入10 mmol/L甘露醇维持渗透压平衡。通过系统和分析软件调节电压和电流。待组织保持平衡后测量TEER值^[19]。

1.2.5. 结肠黏膜PI3K/AKT信号检测

采用Western blot法检测小鼠结肠组织p-PI3K和p-AKT水平, 简述为: 采用含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解结肠组织, 离心分离上清。经BCA法检测目标蛋白浓度后, 依次进行上样, 电泳, 转膜, 脱脂牛奶封闭, 孵育一抗: 兔抗PI3K（1∶1000）、兔抗AKT（1∶1000）、兔抗p-PI3K（1∶1000）兔抗p-AKT（1∶1000）及β-actin（1∶3000）, 孵育二抗, 再经ECL化学发光液显色, 凝胶成像仪显影, 最后使用ImageJ软件分析目的条带的灰度值并计算相对表达量。

1.2.6. 筛选PA作用的潜在靶点和CD疾病相关靶点

分别从Swiss Target Prediction数据库、Pharmmapper数据库、SuperPred数据库和SEA数据库获取PA可能的潜在作用靶点, 在GeneCards数据库、PharmGKB数据库、DisGeNet数据库、DrugBank数据库及TTD数据库以“Crohn's disease”为关键词检索CD相关的疾病靶点。

1.2.7. 交集靶点获取及蛋白相互作用网络构建

将疾病靶点与药物靶点导入Venny 2.1在线工具, 绘制韦恩图, 并通过取交集得到PA治疗CD的潜在靶点。将交集靶点导入String平台, 绘制蛋白相互作用PPI网络, 并将PPI网络导入Cytoscape3.7.2软件进一步简化筛选, 得到核心靶点网络图^[20]。

1.2.8. GO功能及KEGG通路富集分析

将交集靶点导入David数据库进行GO和KEGG通路富集分析, 限定物种为“Homo Sapiens”, 根据P值选取排名靠前的结果进行可视化处理。

1.2.9. 分子对接

在PDB数据库下载靶点蛋白及3D结构pdb格式文件, 在PubChem数据库中下载PA 2D结构sdf格式, 通过Open Babel GUI软件转换得到PA的pdb格式文件。采用AutoDock 4.2.6软件进行PA与关键靶点的分子对接并计算其结合能。利用PyMOL软件对结果进行可视化分析^{[21, 22]}。

1.2.10. 统计学分析

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析, 连续型变量采用均数±标准差表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用Tukey多重比较法。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. PA改善TNBS小鼠结肠炎临床症状

实验前后, PA组小鼠DAI评分显著低于TNBS组（P < 0.05）, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 1A）。PA组小鼠体质量增加显著高于TNBS组, 但仍低于WT组（P < 0.05, 图 1B）。同时, PA组小鼠结肠长度显著长于TNBS组（P < 0.05）, 仍短于WT组（P < 0.05, 图 1C、D）。

图 1.

PA干预对TNBS小鼠结肠炎临床症状的影响

Effect of PA treatment on clinical symptoms of mice with TNBS-induced colitis. A: DAI scores of the mice in each group. B: Weight changes of the mice in each group. C, D: Colon length of the mice in each group. ^*P < 0.05 vs WT; ^#P < 0.05 vs TNBS; n=8.

2.2. PA改善TNBS小鼠结肠组织损伤和肠黏膜炎症因子水平

PA组小鼠肠炎组织学评分显著低于TNBS组小鼠（P < 0.05）, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 2A、B）。此外, PA组小鼠肠黏膜组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著低于TNBS组（P < 0.05）, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 2C）。

图 2.

PA干预对TNBS小鼠结肠组织损伤和肠黏膜炎症因子水平的影响

Effects of PA on colonic tissue injury and intestinal mucosal inflammatory cytokines level in TNBS-treated mice. A: HE staining of the colon tissues in each group. B: Histological inflammation scores of the mice in each group. C: Levels of inflammatory cytokines in the intestinal mucosa in each group determined by ELISA. ^*P < 0.05 vs WT; ^#P < 0.05 vs TNBS; n=8.

2.3. PA改善TNBS小鼠肠屏障功能

PA组小鼠血清FITC-dextran水平较TNBS组显著降低, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 3A）。PA组小鼠血清I-FABP水平显著低于TNBS组（P < 0.05）, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 3B）, 此外, PA组小鼠肠TEER值较TNBS组显著升高（P < 0.05）, 但仍低于WT组（P < 0.05, 图 3C）。

图 3.

PA干预对TNBS小鼠肠屏障功能的影响

Effect of PA on intestinal barrier function in TNBS-treated mice. A: Serum levels of FITC-dextran in each group. B: Serum levels of I-FABP in each group. C: TEER values of the colon tissues in each group. ^*P < 0.05 vs WT; ^#P < 0.05 vs TNBS (n=8).

2.4. PA改善TNBS小鼠肠上皮细胞过度凋亡

TUNEL染色显示, 经PA干预后PA组小鼠肠上皮细胞凋亡率较TNBS组显著降低（P < 0.05）, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 4A、B）。

图 4.

PA干预对TNBS小鼠肠上皮细胞凋亡的调控作用

Effect of PA on apoptosis of intestinal epithelial cells in TNBS-treated mice. A: TUNEL staining of the intestinal epithelial cells in each group. B: Proportion of TUNEL-positive intestinal epithelial cells in each group. ^*P < 0.05 vs WT; ^#P < 0.05 vs TNBS (n=8).

2.5. 获取PA和CD交集靶点

从Swiss Target Prediction、Pharmmapper、SuperPred和SEA数据库获取PA潜在的作用靶点（图 5A）, CD相关疾病靶点从GeneCards、DrugBank、TTD、PharmGKB、DisGeNet获取（图 5B）, 去除重复值后, 将疾病靶点和药物作用靶点取交集, 得到交集靶点248个（图 5C）。

图 5.

PA和CD交集靶点的获取

Acquisition of intersection targets of PA and CD. A: CD-related genes. B: Possible potential targets of PA. C: Venn diagram of intersection genes of PA and CD.

2.6. 构建PPI网络图

将248个交集靶点导入String数据库建立PA治疗CD的PPI网络（图 6A）, 并利用Cytoscape软件进行可视化分析。结果显示, 网络中共有248个节点和3481条边。使用“MCODE”插件进行拓扑分析显示, EGFR、HRAS、SRC、MMP9、STAT3、AKT1、CASP3、ALB、HSP90AA1、HIF1A为PA作用于CD的核心靶点, 并得到核心靶点PPI网络图（图 6B）。

图 6.

核心PPI网络图

Core protein-protein interaction network diagram.A: PPI network for PAtreatment of CD. B: Core target selection.

2.7. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

对交集靶点进行GO富集分析, 共得到1072条目, 包括生物过程（BP）788个、细胞组分（CC）95个, 分子功能（MF）189个, 其中生物过程主要涉及对细胞凋亡的负向调控作用等（图 7A）, 提示PA缓解CD样肠炎可能与拮抗肠上皮细胞凋亡有关。KEGG通路富集分析共得到161条通路, 选取前20条通路进行可视化处理（图 7B）。

图 7.

GO功能及KEGG通路富集分析

GO function and enrichment analysis of KEGG pathways.A: GO-BP. B: KEGG pathway.

2.8. 分子对接

选取核心靶点AKT1、ALB、EGFR、HSP90AA1、SRC、STAT3与PA进行分子对接验证（图 8）。采用结合能评价小分子药物和大分子蛋白的结合情况: 若结合能小于0 kcal/mol, 表明PA能与该蛋白能够进行自发结合; 结合能绝对值越大, 表明发生结合作用的可能性越大。分子对接结果显示, PA与以上6个靶点的结合能均小于0 kcal/mol（表 1）。

图 8.

可视化分析PA与关键靶点对接情况

Visual analysis of PA docking with the key targets. A: PA and HSP90AA1. B: PA and STAT3. C: PA and AKT1. D: PA and ALB. E: PA and EGFR. F: PA and SRC.

表 1.

分子对接结合力结果

Molecular docking binding force

Compound	Target	PDB	Energy (kcal/mol)
PA	AKT1	3O96	-10.2
PA	ALB	7VR0	-9.6
PA	EGFR	7JXQ	-8.4
PA	SRC	3EL7	-8.4
PA	STAT3	6TLC	-7.6
PA	HSP90AA1	8B7I	-7.0

2.9. PA保护TNBS小鼠结肠炎可能与调控PI3K/AKT信号有关

Western blot结果显示, PA组小鼠结肠黏膜组织中p-PI3K和p-AKT水平较TNBS组显著降低（P < 0.05）, 但仍高于WT组（P < 0.05, 图 9A、B）。

图 9.

PA干预对TNBS小鼠结肠黏膜组织中PI3K/AKT 信号通路的作用

Effect of PA on PI3K/AKT signaling pathway in the colonic mucosa of TNBS-treated mice. A: PI3K/AKT level in the intestinal mucosa detected by Western blotting. B: Quantitative analysis of the protein expressions. ^*P<0.05 vs WT; ^#P<0.05 vs TNBS; n=8.

3. 讨论

本研究发现天然植物化合物PA可以显著改善TNBS结肠炎小鼠的肠道炎症症状、组织学损伤并抑制肠道促炎因子水平, 这与其通过拮抗肠上皮细胞凋亡而保护肠屏障功能有关, 而信号机制分析显示PA改善TNBS小鼠CD样肠炎作用可能与抑制PI3K/AKT信号有关。

我们选择TNBS诱导的结肠炎小鼠作为CD动物模型, 这是一种诱导成功率高、重复性好且受到国内外认可的CD模型^{[15, 23]}。研究结果显示, PA可以显著缓解TNBS小鼠DAI评分、体质量减轻和结肠缩短等肠炎症状。组织学分析显示, PA干预显著改善了TNBS小鼠肠炎病理组织学评分。此外, PA干预显著降低了肠道促炎介质（TNF-α、IL-6和IL-1β）水平。以上结果从临床症状、组织学损伤和分子水平3个层次均证实PA具有保护CD样肠炎的作用。新近研究显示, PA不仅能够改善腺性膀胱炎小鼠的膀胱组织炎症^[24], 还可通过抑制NLRP3炎性小体的激活缓解小鼠的胰腺纤维化^[25], 而我们研究进一步拓展了PA发挥抗炎作用的疾病应用领域。

为发掘PA作用于CD样肠炎的途径, 我们进一步分析了PA对肠屏障的作用效果。结果发现PA可降低TNBS小鼠外周血I-FABP水平, 其是一种主要表达于肠黏膜上皮细胞的胞液蛋白, 在肠上皮屏障受损时IFABP可释放至外周血, 是一种评估肠屏障功能的敏感指标^{[26, 27]}。同时, 在体肠屏障通透性试验和离体肠屏障电阻抗检测均证实PA在体干预对TNBS小鼠肠屏障功能具有保护作用。肠屏障损伤可引发肠腔内异种抗原、毒素、细菌等进入肠管实质内, 这是引发或维持慢性肠道炎症的重要因素之一^{[28, 29]}, 而PA保护肠屏障的作用可一定程度解释其对CD样肠炎的保护作用。

CD肠屏障功能障碍的机制并不完全明确, 但目前认为肠上皮细胞过度凋亡是引发屏障功能受损的关键因素^{[30, 31]}。既往研究表明PA可抑制脑缺血/再灌注导致的神经元细胞凋亡^[32], 还能够保护肺上皮细胞和心肌细胞抵抗脂多糖诱导的凋亡损伤^{[10, 33]}。为了明确PA保护肠上皮细胞屏障的途径, 我们进一步分析了PA干预对TNBS小鼠肠上皮细胞凋亡的影响, 并发现PA可以显著降低肠上皮细胞凋亡率。这一组数据显示PA保护TNBS小鼠肠上皮屏障的作用至少部分和拮抗肠上皮细胞过度凋亡有关。

我们基于网络药理学进一步分析PA对CD的治疗潜力以及其可能的分子机制, 结果发现PA主要参与了对细胞凋亡的负向调控作用, 这与我们的预期结果相符。此外, KEGG富集分析提示PA可能通过PI3K/AKT信号通路发挥拮抗肠上皮细胞凋亡的作用, 且抑制PI3K/AKT信号通路的激活对肠上皮细胞凋亡具有拮抗作用已有相关文献报道^{[34, 35]}。我们的研究数据提示PA对TNBS小鼠的保护性作用至少部分和抑制PI3K/AKT信号有关。既往报道显示PA在其他疾病中可参与多条信号通路的调控过程。在肺动脉高血压大鼠模型中, PA可通过调控Nrf2-Keap1-ARE通路促进低氧诱导的肺血管重塑^[36];在大鼠肺炎模型中, PA可通过调节NF-κB和MAPK通路抑制脂多糖诱导的肺上皮细胞损伤^[33], 而我们的研究进一步丰富了PA发挥生物学作用的可能机制。

本研究通过在体研究证实了PA具有拮抗CD样肠炎的作用以及可能的作用机制, 为临床治疗药物的选择提供了理论基础。PA是一种天然植物化合物且几乎无毒副作用, 药物安全预期性高^[10], 本研究发现PA可以通过调控PI3K/AKT信号拮抗肠上皮细胞凋亡, 这进一步丰富了PA的药理学作用。

虽然我们选择了TNBS小鼠这种公认的CD模型, 但迄今为止尚无能够代表CD全部疾病规律的动物模型; 此外, PA生物学功能尚未得到全面揭示, 虽然我们发现了其具有拮抗肠上皮凋亡、调控PI3K/AKT信号等作用, 但可能忽略了PA的其他作用。综上, PA可能通过调控PI3K/AKT信号拮抗肠上皮细胞凋亡保护肠屏障, 从而缓解TNBS小鼠CD样肠炎。

Biography

邵荣瑢，硕士，主管技师，E-mail: srr0707@163.com

Funding Statement

蚌埠医学院自然重点项目（2021byzd046）；安徽省高校自然科 学基金重点项目（KJ2020A0550）；蚌埠医学院第一附属医院高水平科技创 新团队（BYYFY2022TD002）；蚌埠医学院重大科技项目孵育计划 （2021byfy001）；蚌埠医学院第一附属医院杰出青年基金（2019byyfyjq01）