Abstract
目的
研究抑郁样小鼠灰质体积的变化及其可能的内在机制。
方法
将24只6周龄C57小鼠随机分为对照组（n=12）与造模组（n=12），利用慢性不可预知温和刺激（CUMS）对小鼠进行35 d的抑郁造模。通过小动物磁共振对两组小鼠进行成像, 观察抑郁小鼠较对照组小鼠灰质体积的结构变化。利用免疫印迹与免疫荧光染色的方法观察小鼠相应皮质脑源性神经营养因子（BDNF）的表达情况。
结果
造模组小鼠较对照组小鼠在矿场实验中在中央位置的行走距离下降（P < 0.05），在强迫游泳实验中不动时间增加（P < 0.05）。小动物磁共振成像结果显示，造模组小鼠的额叶皮质体积下降（P < 0.001，当团块水平≥10756时，过P=0.05的FDRc矫正）。在蛋白印迹实验中，额叶皮质内成熟BDNF的表达下降（P < 0.05）；免疫荧光染色显示，BDNF在造模后表达下降，并且VBM分析得到的差异团块的体积大小与蛋白印迹实验中成熟BDNF表达水平的高低存在相关（P < 0.05）。
结论
抑郁造模后小鼠额叶皮质体积的下降与额叶皮质内成熟BDNF表达下降有关。
Keywords: 慢性不可预知温和刺激, 基于体素的形态学方法, 脑源性神经营养因子
Abstract
Objective
To investigate the changes in gray matter volume in depressive-like mice and explore the possible mechanism.
Methods
Twenty-four 6-week-old C57 mice were randomized equally into control group and model group, and the mice in the model group were subjected to chronic unpredictable mild stimulation (CUMS) for 35 days. Magnetic resonance imaging was performed to examine structural changes of the grey matter volume in depressive-like mice. The expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the grey matter of the mice was detected using Western blotting and immunofluorescence staining.
Results
Compared with the control mice, the mice with CUMS showed significantly decreased central walking distance in the open field test (P < 0.05) and increased immobile time in forced swimming test (P < 0.05). Magnetic resonance imaging showed that the volume of the frontal cortex was significantly decreased in CUMS mice (P < 0.001, when the mass level was greater than or equal to 10 756, the FDRc was corrected with P=0.05). Western blotting showed that the expression of mature BDNF in the frontal cortex was significantly decreased in CUMS mice (P < 0.05), and its expression began to decrease after the exposure to CUMS as shown by immunofluorescence staining. The volume of different clusters obtained by voxel-based morphometry (VBM) analysis was correlated with the expression level of mature BDNF detected by Western blotting (P < 0.05).
Conclusion
The decrease of frontal cortex volume after CUMS is related with the reduction of mature BDNF expression in the frontal cortex.
Keywords: chronic unpredictable mild stimulation, voxel-based morphometry, brain-derived neurotrophic factor
抑郁症是一种高病发率、高自杀率和高复发率的异质性疾病[1]。尽管已有数十年的基础科学、临床神经科学和精神病学研究，但人们对抑郁症的内在发病机制仍然不明确。基于体素的形态学方法（VBM）是目前常用的无创分析活体大脑解剖学的方法之一，多项抑郁症患者VBM分析研究结果表明，额叶、海马与杏仁核等边缘系统的脑区体积在抑郁症患者中明显下降[2-5]，但对于抑郁症患者VBM分析结果的内在机制的研究仍然不够清楚。
脑源性神经营养因子（BDNF）是中枢神经分布最广泛的神经营养因子，在中枢神经系统中发挥着重要的作用，尤其对于神经元成熟，突触形成和突触可塑性至关重要[7, 8]。BDNF在前额叶、海马与杏仁核等边缘系统中高表达[9]，这些脑区都与抑郁症发病密切相关。有研究表明抑郁症患者血浆BDNF水平与抑郁症的严重程度存在负相关[9-12]，此外，额叶内BDNF的表达下降在压力引起的抑郁中发挥重要的作用[13, 14]，因此猜想额叶内BDNF表达异常可能与抑郁症VBM结果改变有关。
由于抑郁症患者VBM分析结果的差异脑区内分子水平难以检测，而慢性不可预知温和刺激(CUMS)造模小鼠是一种较为理想和可靠的抑郁动物模型，造模后探索能力显著下降、兴趣丧失、行为绝望以及快感缺乏与抑郁症临床表现中的精神运动性阻抑症状极为相似[6]。因此，本研究拟通过CUMS造模小鼠检测脑区组织内的BDNF水平，探究抑郁症VBM分析结果与相应脑区内BDNF表达水平的内在关系。
1. 材料和方法
1.1. 实验动物
24只6周龄雄性C57小鼠购买自南方医科大学南方医院实验动物中心信息管理平台。
C57小鼠随机分为正常对照组与抑郁造模组，12只/组，饲养于南方医科大学南方医院动物实验中心。本研究已通过动物实验伦理审查（编号：IACUC-LAC- 20220920-002）
1.2. CUMS抑郁造模
抑郁造模组小鼠被随机每天给予以下刺激：剥夺水24 h、剥夺食物24 h、禁锢4~6 h和强迫在冷水（8~10 ℃）中游泳10 min，连续刺激5周。正常对照组不接受任何处理。在造模过程中，造模组小鼠死亡2只，剩余10只。
1.3. 行为学测试
1.3.1. 矿场实验
在测试前的3 d里，让小鼠熟悉实验环境，实验者抚摸小鼠。在实验开始时，用75%的酒精擦拭矿场盒子。矿场盒子是一个长30 cm、宽30 cm、深35 cm的方形盒子。每只小鼠被放入盒子后，使用EthoVision软件（7.0版; Noldus，瓦赫宁根）检测小鼠的运动轨迹。
1.3.2. 强迫游泳实验
透明的玻璃容器中装满大约35 cm深的水，温度为28 ℃。在实验前3 d，老鼠被允许游泳1次/d，以熟悉环境和实验者。实验中，将小鼠轻轻放入容器中，让其游5 min，记录不动时间，小鼠的不动状态是放弃挣扎，只保持头部露出水面。
1.4. 小动物磁共振
1.4.1. 小动物磁共振扫描
磁共振设备是南方医科大学中心实验室7.0 T小动物磁共振扫描仪（PharmScan, Bruker）。在正式扫描之前，先将小鼠放在含有5%异氟烷的麻醉诱导箱内，待小鼠脚趾收缩反应消失，对光反射迟钝后将小鼠固定转移至扫描床，连接呼吸机用2.5%异氟烷维持麻醉状态，用37 ℃的加热垫对小鼠腹部保温。压力传感器（SAII Instruments, Model1030 Monitoring & Gating System）可在扫描过程中检测小鼠的呼吸频率、心率与体温，待小鼠状态稳定后，即可进行扫描。用三维T2加权成像快速采集弛豫增强序列（RARE）获取结构像，参数如下：重复时间（TR）=1800 ms，回波时间（TE）=45 ms，翻转角90°，采样矩阵=256×256，体素大小=0.078 mm×0.078 mm×0.512 mm，32层，层厚/间隔=0.512/0 mm。在采集图像过程中由于2只小鼠麻醉不稳定，扫描图像质量差而未纳入统计（对照组：n=12；CUMS模型组：n=8）。
1.4.2. 小动物磁共振图像分析
将DICOM格式的图像转换为NIFTI格式，采用ITKSNAP与MATLAB（MathWorks, Natick, MA）软件，即自动与手动相结合的方式剥掉小鼠脑部头皮。使用SPM8软件（http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm8/）和MATLAB软件进行VBM分析，其预处理的大致流程如下：首先，每个T2加权图像被调整了10倍大小，将调整大小的t2加权图像对齐到C57Bl/6图谱的小鼠大脑解剖模板上；其次，根据组织概率图，将结构像分割成灰质、白质与脑脊液3部分，然后将灰质部分的图像空间归一化到模板[15]。第三，通过Jacobian调制归一化信号强度；最后，使用8 mm FWHM高斯核对得到的图像进行平滑处理，平滑后的图像即可用于后续统计。具体流程（图 1）。VBM结果的统计分析使用的是SPM8软件，大致流程包括统计建模、模型评估、设计Contrasts，两组之间采用双样本T检验，得到差异脑区（P < 0.001，当团块水平大于等于10 756时，过P=0.05的FDRc矫正）。
图 1.
VBM分析流程图
Flowchart of voxel-based morphometry (VBM) analysis.
1.5. 蛋白免疫印迹实验
麻醉小鼠灌注PBS，根据小鼠脑图谱分离额叶皮质脑组织。然后以100 µL/mg的比例向组织中加入WB裂解液（Beyotime, P0013）。涡旋（60 Hz，60 s）和离心（12 000×g，4 ℃，15 min）后，使用BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime Biotechnology, P0009）定量蛋白裂解物。各取30 μg样品经过十烷基硫酸酯聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上，25 ℃下用5% BSA阻断2 h。一抗（1∶5000 dilution; Abcam; ab108319）4 ℃孵育过夜，二抗常温孵育1 h。结果通过化学发光进行可视化（GE医疗生物科学）。使用Imaging J软件对图像进行定量分析。
1.6. 免疫荧光实验
麻醉小鼠前后分别灌注PBS与多聚甲醛，取出小鼠脑组织固定，脱水后，OCT包埋，切片机切成20 μm厚的切片。PBS洗3遍，山羊血清封闭0.5 h，一抗（1∶500 dilution; Abcam）4 ℃孵育过夜，PBST洗3遍，二抗常温避光孵育1 h，PBS洗3遍常温孵育DAPI 5 min，封片。
1.7. 统计学分析
采用GraphPad Prism8软件对行为学及蛋白定量值进行统计分析，对照组与造模组之间比较采用双样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. CUMS造模小鼠的抑郁行为
在矿场实验中，CUMS造模后的小鼠在矿场运动的总距离差异没有统计学意义（P > 0.05，图 2A、C），但在矿场中央的运动距离下降（P < 0.05，图 2B、C），相比对照小鼠，CUMS造模小鼠自发活动变化不明显，但小鼠对中央区域的探索行为明显下降。造模后的小鼠在强迫游泳实验中的不动时间增加（P < 0.05，图 2D）。经过5周的CUMS，小鼠表现出探索行为的下降与行为绝望的增加。
图 2.
行为学实验结果(A、B、C)矿场实验(D)强迫游泳实验
Behavioral test results of the mice in the control group (n=12) and chronic unpredictable mild stimulation (CUMS) group (n=10). A: Total walking distances in open-field test. B: Central walking distances in open-field test. C: Diagram in open field test, and red frame indicates the central area. D: Immobile time in forced swimming test. *P < 0.05 vs control.
2.2. CUMS抑郁小鼠额叶灰质体积的下降
采集造模组与对照组小鼠的磁共振图像，通过VBM分析方法，分析对照组与CUMS组的小鼠全脑灰质体积，结果显示CUMS组小鼠的额叶皮质（FC）体积明显下降（P < 0.001，当团块水平大于等于10 756时，过P=0.05的FDRc矫正，图 3）。
图 3.
VBM分析结果
Results of VBM analysis. The map shows clusters of decreased (red) volumes in the CUMS model group compared to the control group (Control: n=12; CUMS: n=8). P < 0.001, when the mass level was greater than or equal to 10 756, the FDRc was corrected with P=0.05.
2.3. CUMS抑郁小鼠额叶皮质体积的下降与额叶内BDNF表达下降有关
在所有测试的样本中，分别检测到14和28 000 BDNF免疫反应条带，分别代表前体BDNF（pBDNF）和成熟BDNF（mBDNF）。与对照组相比，CUMS造模组小鼠成熟形式的BDNF蛋白表达水平下降（P < 0.05，图 4A、B），前体形式的BDNF在对照组与造模组之间没有统计学差异（P > 0.05，图 4A、C）。为进一步验证mBDNF在造模组表达下降的这一趋势，通过免疫荧光实验观察到，额叶皮质内的mBDNF荧光强度在造模组较对照组也成下降趋势（图 4E）。将VBM分析得到的差异团块的体积大小与蛋白印迹实验中成熟BDNF表达水平做相关分析，结果显示，VBM分析得到的差异团块的体积大小与成熟BDNF表达水平正相关（图 4D）。
图 4.
CUMS与正常对照组BDNF表达水平
Expression level of BDNF in the frontal cortex in CUMS and control groups. A-C: Western blotting of BDNF expression in the frontal cortex in the control (n=6) and CUMS (n=6) groups. D: Relationship between the relative expression of mBDNF and cluster volume in the control (n=6) and CUMS (n=6) groups. E: Immunofluorescence of BDNF in the frontal cortex of the mice (Original magnification: ×200). *P < 0.05.
3. 讨论
矿场实验可用于检测实验动物的自发行为与探索行为，小鼠对空旷的场地具有畏惧感，并偏好躲在角落，因此小鼠逃避往空旷场地的中心移动，但又存在对中央区域的好奇而驱使其探索，故矿场实验可对小鼠的探索行为进行评估，其在矿场中运动的总距离反映了小鼠的自发活动，中央距离则反映小鼠的探索行为，是抑郁行为的表现。本文利用CUMS造模，在不影响矿场实验的总距离的前提下，造模小鼠在中央的运动距离明显下降，表明造模小鼠出现了探索行为的减少。在强迫游泳实验中，我们给小鼠营造了一种无法逃离的强迫环境，小鼠会试图逃脱，反复失败后会保持静止，陷入行为绝望，而抑郁小鼠的行为绝望持续时间会更久。造模后在强迫游泳实验中小鼠的不动时间明显增加，这表明小鼠行为绝望的增加，同样是抑郁行为的表现。
在一项抑郁症患者的磁共振研究中，经VBM发现抑郁症患者前额叶体积较正常健康对照明显下降[3]，为了探究抑郁小鼠同抑郁症患者灰质脑体积的变化是否具有一致性，我们同样采用了在活体上能无创对小鼠灰质体积进行分析的方法-VBM，分析结果显示CUMS造模的抑郁小鼠较正常组小鼠的额叶皮质体积明显下降，这种结果与抑郁症患者的VBM分析结果相一致[3, 4]，进一步验证了额叶在抑郁症发病中起到的作用。
BDNF与抑郁症的发生、发展和治疗有关，是目前抑郁症相关神经生物学领域研究最多的神经营养因子[16]，抑郁症发病的神经营养因子假说也被提出。本实验发现抑郁小鼠额叶皮质内成熟的BDNF蛋白表达水平下降，并且免疫荧光实验也出现了同样的趋势，这表明了BDNF的降低可能是抑郁小鼠额叶皮质体积下降的重要原因。有研究中指出血清BDNF在抑郁症患者前额叶体积下降的可能作用[3]，而本实验首次证明了抑郁样小鼠额叶皮质内部BDNF表达水平的降低与额叶皮质体积下降是存在相关的。
BDNF在大脑中是非常重要的营养蛋白，主要在神经元中合成，并在神经元发育、突触可塑性和精神疾病的病理和治疗中起着重要的作用[17-20]。额叶皮质是抑郁症发病发展中持续受损的脑区之一[21]，BDNF是神经元生长的重要调节因子，额叶内神经元萎缩在抑郁症的发生发展中十分关键[22-25]。本研究发现额叶体积在抑郁小鼠中出现下降，并且额叶体积的大小与BDNF在额叶内的表达水平存在正相关。因此，推测BDNF表达不足导致额叶内神经元的萎缩进而引起了抑郁小鼠额叶灰质体积的下降，这可能是BDNF表达水平的下降与额叶灰质体积下降存在相关的内在原因。
本文首次将CUMS抑郁小鼠额叶皮质体积的下降的机制与额叶内BDNF表达下降联系起来，压力造模后BDNF表达下降引起的额叶皮质异常的结构可能参与了抑郁症的发生发展。但本研究仅观察了额叶内BDNF表达水平的下降，对于其它脑区内BDNF的水平是否也有改变没有验证，并且对于BDNF是否是通过影响了神经元的生长进而引起额叶皮质的萎缩，仍需进一步探索。
Biography
崔维维，在读硕士研究生，E-mail: cww970216@126.com
Funding Statement
国家自然科学基金（82172012）；广东省自然科学基金（2021A1515012253）
Supported by National Natural Science Foundation of China (82172012)
Contributor Information
崔 维维 (Weiwei CUI), Email: cww970216@126.com.
文 戈 (Ge WEN), Email: 1113470826@qq.com.
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