遗传和表观遗传机制在先天性心脏病中的研究进展

Abstract

Congenital heart disease (CHD) is a type of birth defects due to the abnormal development of heart and blood vessels during embryonic stage. Studies indicate that the etiology of CHD is complicated. Genetic and epigenetic mechanisms including chromosomal abnormalities, gene mutations, nucleic acid modifications, non-coding RNAs may play important roles in CHD. At present, genetic mechanisms such as chromosome abnormality and gene mutation have been widely used in the diagnosis and treatment of clinical diseases. However, the application of genetic and epigenetic modification in diagnosis and treatment of CHD still need further research. This paper reviews the relationship between chromosomal abnormality, gene mutation, copy number variation, epigenetic modification and the occurrence of CHD, which may provide a basis for further exploring the early diagnosis and individualized therapy of CHD.

先天性心脏病是最常见的出生缺陷，也是目前全球婴儿死亡的主要原因 ^{[ 1]} 。流行病学调查结果显示，先天性心脏病在美国的发病率为2%~3% ^{[ 2]} ，在我国为0.6%~1% ^{[ 3]} ，且占我国常见出生缺陷的1/3 ^{[ 4]} 。先天性心脏病的主要类型有室间隔缺损、房间隔缺损、房室间隔缺损、动脉导管未闭、法洛四联症、右心室双向流出道、大动脉转位等。除少数轻度心脏缺损患儿5岁以内有自愈机会外，绝大多数患儿需要手术治疗。先天性心脏病的病因主要包括遗传因素和环境因素及两者之间的相互作用( 图 1)。本文综述了遗传和表观遗传机制在先天性心脏病发生中的作用，以期为进一步探究先天性心脏病早期诊断及个体化治疗提供依据。

染色体异常包括数目异常和结构畸变。先天性心脏病患者中染色体异常的发生率高达18%~ 22% ^{[ 5]} ，其中主要是染色体数目异常，包括21三体综合征(唐氏综合征)、18三体综合征(爱德华综合征，即Edwards综合征)等；少数染色体异常由结构畸变导致，其中发生率较高的为22号染色体长臂缺失(迪格奥尔格综合征，即DiGeorge综合征)、4号染色体短臂缺失(Wolf-Hirschorn综合征)以及5号染色体短臂缺失(猫叫综合征)等 ^{[ 6]} 。

染色体异常引起的综合征多伴有先天性心脏病。研究表明，80%~100%的18三体综合征患者伴有先天性心脏病 ^{[ 7]} ；21三体综合征患者中心脏缺陷的发生率为40%~50% ^{[ 8]} ，其中大多数患者确诊为房室间隔缺损。22号染色体结构异常是引起先天性心脏病最常见的原因 ^{[ 9]} ，其中最严重的一类是22q11.2缺失或扩增，可导致多种类型的先天性心脏病，包括房间隔缺损、室间隔缺损、动脉导管未闭、法洛四联症等 ^{[ 10]} 。4号染色体短臂缺失和5号染色体短臂缺失中出现先天性心脏病较为少见，主要表现为室间隔缺损，其临床表现的严重程度也不一致，可能与正常细胞和染色体短臂缺失细胞的混合嵌合现象有关，异常细胞所占比例越高，先天性心脏病的临床表现越严重。

除常染色体异常外，性染色体异常也可导致先天性心脏病。特纳综合征主要由X染色体结构异常引起，其染色体除45，X外，可有多种嵌合体，不同的嵌合体导致心脏畸形的临床症状不一致 ^{[ 11]} ，如二叶式主动脉瓣、主动脉缩窄或扩张、主动脉壁夹层形成等。X染色体数目异常在临床上较少见，但其也可以导致患者的心脏发育不全，如临床上出现的49，XXXXX病例伴有心脏发育异常及血管畸形 ^{[ 12]} 。

在临床应用中，常规的染色体镜检只能观察到染色体结构、数目改变及大片段异常，容易导致先天性心脏病漏诊。现代精准医学利用高通量染色体芯片技术，可以对染色体微小片段的缺失和异常进行检测，大大降低了先天性心脏病的漏诊率。研究发现，利用高通量染色体芯片对胎儿进行产前检测能有效检测出超声确诊的先天性心脏病胎儿中存在染色体微小片段缺失，可以作为产前胎儿先天性心脏病诊断的有效工具 ^{[ 13]} 。基因芯片是一种现代分子检测技术，能够检测出常规染色体检查不能检出的染色体微缺失和微重复综合征。临床上所说的基因芯片通常是指微阵列比较基因组杂交芯片技术，通过这一技术可以更加准确地发现疾病相关的染色体变异，提高先天性心脏病胎儿亚显微染色体畸变的检出率 ^{[ 14]} 。

基因突变也是先天性心脏病的一个重要遗传病因 ^{[ 15]} ，目前证实的与先天性心脏病相关的基因数目超过50个( 表 1)，包括转录因子、信号通路基因及心脏结构组分基因，基因缺失或突变是最常见的异常 ^{[ 16- 91]} 。

表1 与先天性心脏病相关的基因及其表型

Table 1 Genes associated with congenital heart disease and their cardiac phenotypes

基因	心脏表型	参考文献
ACTC1	房间隔缺损、室间隔缺损	[ 17]
ACVR2B	心脏左右轴异位畸形	[ 18]
ALK2	房间隔缺损	[ 19]
AXIN2	先天性瓣膜缺损	[ 20]
ANKRD1	总静脉回流异常	[ 21]
BAF60C	房间隔缺损、室间隔缺损、房室间隔缺损、心脏圆锥动脉畸形	[ 22]
BRAF	肺动脉狭窄、房间隔缺损	[ 23]
BRG1	房间隔缺损、室间隔缺损	[ 24]
CHD7	法洛四联症、右室双向流出道	[ 25]
CITED2	房间隔缺损、室间隔缺损	[ 26]
CRELD1	房室间隔缺损	[ 27- 29]
CX40	心室发育不良	[ 30]
CX43	法洛四联症	[ 31]
DLC1	房间隔缺损	[ 32]
ELN	上腔静脉主动脉狭窄	[ 33]
FOXH1	法洛四联症、先天性心功能异常	[ 34]
GATA4	房间隔缺损、房室间隔缺损、法洛四联症	[ 35- 38]
GATA6	持续性动脉硬化性肺动脉瓣	[ 39]
GDF1	法洛四联症、大动脉转位	[ 19]
GJA5	室间隔缺损、法洛四联症、主动脉狭窄	[ 40- 41]
HAND2	法洛四联症	[ 42- 43]
HDAC5	室间隔缺损	[ 44]
HEY2	三尖瓣闭锁	[ 45]
HRAS IRX4	肺动脉狭窄、心动过速室间隔缺损	[ 46][ 47]
JAG1	法洛四联症	[ 48- 49]
KRAS	肺动脉狭窄、房间隔缺损	[ 50]
MAP2K1	肺动脉狭窄、房间隔缺损	[ 51]
MED13L	大动脉转位、左心发育不良、主动脉狭窄	[ 52]
MYBPC3	房间隔缺损、室间隔缺损	[ 53- 55]
MEF2C	室间隔缺损	[ 56]
MESP1	右室双向流出道	[ 57]
MYH6	房间隔缺损	[ 58]
MYH7	左心室心肌致密化不全、二叶式主动脉	[ 59]
NKX2.5	房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症、右室双向流出道、左心发育不全	[ 60- 64]
NKX2.6	持续性动脉硬化性肺动脉瓣	[ 65]
NODAL	大动脉转位	[ 66- 69]
NOTCH1	主动脉瓣疾病	[ 67- 68]
NOTCH2	法洛四联症、肺动脉狭窄、主动脉狭窄	[ 69]
NR2F2	房间隔缺损、主动脉狭窄	[ 70]
PTPN11	房间隔缺损、室间隔缺损、肺动脉狭窄	[ 71]
RAF1	房间隔缺损、法洛四联症	[ 72]
PAX2	室间隔缺损	[ 73]
RIT1	室间隔缺损、法洛四联症、主动脉狭窄	[ 74]
SEMA3E	法洛四联症、右室双向流出道	[ 75]
SMAD6	主动脉瓣疾病	[ 76]
SMYD1	心室发育不良	[ 77]
SOS1	房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症	[ 78]
SOX9	法洛四联症	[ 79]
STRT1	房间隔缺损、室间隔缺损	[ 80]
TBX1	室间隔缺损、主动脉弓中断	[ 81- 83]
TBX5	房间隔缺损、室间隔缺损、房室间隔缺损	[ 84]
TBX20	房间隔缺损、室间隔缺损、左心发育不良、动脉导管未闭	[ 85- 86]
TDGF1	法洛四联症	[ 34]
WHSC1	房间隔缺损、室间隔缺损	[ 87]
ZFPM2	法洛四联症、右室双向流出道	[ 88]
ZIC3	房间隔缺损、大动脉异位	[ 89- 91]

转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)、NK2同源盒蛋白1(NKX2.5)和T-框蛋白(TBX)5形成复合物，在心脏间隔形成过程中发挥重要的基因调节作用 ^{[ 92]} 。 NKX2.5突变会造成心脏房室缺损， TBX5突变造成心脏间隔缺损 ^{[ 60- 64, 84]} 。 GATA4需要与 TBX5协同发挥作用，其中一个基因的突变会影响彼此间的相互作用能力 ^{[ 93]} ，最终引起表型异常。 TBX1和成纤维细胞生长因子8( FGF8)基因突变通过阻碍第二心岛的正常发育而导致心脏流出道异常 ^{[ 82]} 。中胚层后方同源物1( MESP1)基因编码正常心血管发育所需的基本螺旋-环-螺旋转录因子， MESP1缺失突变会造成右心室双向流出道从而导致先天性心脏病 ^{[ 57]} 。

Wnt/β-catenin信号通路主要作用于心脏瓣膜的发育过程，在瓣膜形成的发育过渡期起到关键作用。Axis抑制蛋白2(AXIN2)参与心脏瓣膜生长、延伸阶段的调控，同时它的表达产物是Wnt/β-catenin信号通路的负调节因子。 AXIN2过度表达将引起Wnt/β-catenin信号通路的异常中断，导致常见的先天性瓣膜缺损 ^{[ 20]} 。

VHL-HIF信号通路主要参与心室肌的特化过程。E3泛素连接酶Vhl的缺失导致低氧诱导因子(HIF)1α过度活化，阻断中间代谢产物的转移并损害心脏成熟和功能发挥，HIF1小梁激活引起糖酵解特征的改变导致建立心脏传导系统所必需的基因缝隙连接蛋白(CX)40、TBX5表达下降，进而影响心室肌特化过程。VHL-HIF信号通路的异常最终导致心室肌发育不良，从而引起先天性心脏病的发生 ^{[ 30]} 。

心内膜中NOTCH信号通路突变可导致先天性结构畸形 ^{[ 94]} 。NOTCH信号通路通过调控TNF-α的表达，在心内膜间质转化后，抑制瓣膜内间质细胞的增生从而促进其凋亡，作用于主动脉瓣膜的发育过程。该通路的异常会造成二叶型主动脉瓣，甚至出现主动脉瓣狭窄，进而产生左心室发育障碍 ^{[ 69]} 。NOTCH信号通路的异常突变还会导致信号和转录调节因子NOTCH1表达下降，引起一系列发育性主动脉瓣异常和严重瓣膜钙化，同时导致NOTCH1的配体Jagged1蛋白(JAG1)表达降低，进而引起法洛四联症的发生 ^{[ 49]} 。

在临床诊断中，随着第二代测序技术包括全基因组测序、外显子测序和转录组测序等的广泛应用，先天性心脏病相关基因的发现成为可能，对于先天性心脏病患儿的遗传诊断、早期预防及个性化治疗具有重要意义 ^{[ 95]} 。现代精准医学利用全基因组测序技术，可以准确定位疾病相关的基因，配合实时荧光定量PCR技术能够检测心脏组织中相关基因表达量的变化。先天性心脏病患者心脏组织全基因组测序结果显示， BRG1 ^{[ 24]} 、心脏和神经嵴衍生蛋白2( HAND2) ^{[ 42- 43]} 、Zic基因家族成员3 ( ZIC3) ^{[ 30, 89- 91]} 等基因的突变是导致先天性心脏病的重要因素；心肌细胞标记基因Mut Y同源性( MYH) 6突变会产生房间隔缺 ^{[ 58]} ， MYH7点突变则可能会造成二叶式主动脉瓣 ^{[ 59]} 。部分基因并没有发生序列上的变化，但是其表达水平发生明显变化。因此，表观遗传学修饰可能是这些基因表达下调的主要原因。

拷贝数变异是基因组重排而导致的，一般是长度为一千到几百万碱基对DNA片段的缺失或扩增。包含几百万碱基对的大片段变异可以通过荧光原位杂交进行分析，而仅包含几百到一千碱基对的小片段变异可以运用高通量微阵列比较基因组杂交芯片技术来识别。研究发现，拷贝数变异在多种遗传变异所致的先天性心脏病中起重要作用 ^{[ 96- 103]} ，主要的变异包括染色体22q11.2、15q11.2、8p23.1、7q21.3、4q22.1、1q21.1等位点的微缺失或微扩增。

染色体22q11.2变异是最常见的一类拷贝数变异，与先天性心脏病相关的主要是22q11.2微缺失，主要表现有主动脉弓中断(约50%)、动脉干畸形(约33%)、法洛四联症(约15%)、室间隔缺损(5%~10%) ^{[ 104- 105]} 。第二代测序结果发现，单纯的22q11.2微缺失是造成先天性心脏病的一部分原因，在其变异位点上的 TBX1 ^{[ 106]} 、Crk样蛋白( CRKL) ^{[ 107]} 、迪格奥尔格综合征危象区基因8( DGCR8) ^{[ 108]} 也起到关键作用。此外临床研究发现，22q11.2微缺失和圆锥动脉畸形所导致的先天性心脏病患儿较其他原因引起的相同类型的先天性心脏病患儿术后病死率更高 ^{[ 105, 109]} 。

染色体15q11.2微缺失也是拷贝数变异中的一类，典型的缺失在其变异位点上包含4个关键基因FMRP相互作用蛋白1( CYFIP1)、普拉德-威利综合征/Angelman综合征非印迹蛋白( NIPA) 1、 NIPA2和微管蛋白γ复合体关联蛋白5 ( TUBGCP5)，其共同作用导致先天性心脏病发生，主要表现为左心畸形、主动脉缩窄、房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症及总静脉回流异常 ^{[ 110]} 。

不同于之前的两类拷贝数变异，染色体8p23.1的微缺失 ^{[ 111]} 和微扩增 ^{[ 112- 113]} 都与先天性心脏病的发生密切相关。在8p23.1位点上发挥作用的基因是 GATA4， GATA4与 TBX5协同作用导致先天性心脏病发生 ^{[ 114]} 。

表观遗传学修饰主要包括DNA修饰、RNA修饰、组蛋白修饰、非编码RNA和染色质重塑等，在多种生物学过程和疾病发生中发挥重要作用。研究发现，表观遗传调控心脏的正常发育过程，参与先天性心脏病的发生 ^{[ 115]} 。

在临床研究中，DNA甲基化是先天性心脏病致病基因表观遗传修饰中的一个重要组成部分，研究最为广泛。现代精准医学利用DNA甲基化检测技术能精确定位到基因单个CpG点的甲基化状态。研究表明，在人类基因组中60%的基因启动子区存在CpG岛，其在正常情况下处于非甲基化状态，CpG岛的甲基化异常会引起基因沉默 ^{[ 116]} 。DNA甲基化修饰可以引起先天性心脏病相关致病基因表达下降，即随着基因甲基化程度降低，相关疾病发生的风险增加 ^{[ 117]} 。

微小RNA(miRNA)在心脏发育过程中起到重要的调控作用 ^{[ 118- 119]} 。心脏组织全基因组测序结果分析发现, CX43基因是心脏发育过程中的重要基因。通过实时荧光定量PCR技术检测法洛四联症患者的心脏组织发现， CX43基因呈现高表达 ^{[ 21]} 。研究者通过筛查确定了与 CX43基因有关的10个miRNA，其中miRNA-1和miRNA-206表达明显下调，表明这两个miRNA的下调可能是导致 CX43基因高表达并最终引起先天性心脏病的原因。最新的研究发现，miRNA-34a通过激活NOTCH信号通路抑制 NOTCH1基因的表达，进而导致先天性心脏病的发生 ^{[ 120]} 。

DNA甲基化是指DNA中胞嘧啶的5号碳原子位置加入一个甲基基团，取代了原来的氢原子，是由DNA甲基转移酶(DNMT)介导的过程 ^{[ 121]} 。DNMT主要包括Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b，其中Dnmt3a和Dnmt3b主要介导从头甲基化的过程，Dnmt1则介导DNA复制过程中甲基化的维持。DNA甲基化会调控心脏关键基因的表达，影响相关信号通路和下游功能，进而导致先天性心脏病。透明质酸合成酶2( Has2)是心脏发育的关键基因，在心内膜-间质转化和心脏瓣膜形成过程中发挥重要作用。在胚胎发育的第14.5天，小鼠心脏瓣膜内的 Has2基因出现下调，而该下调过程依赖于Dnmt3b介导的DNA甲基化 Has2增强子，实现基因调控，进而调控瓣膜正常形成; 不同胚胎时期的小鼠心脏内的差异甲基化位点大部分是在心脏发育的关键基因上 ^{[ 122]} 。在先天性心脏病患者中的相关基因也有甲基化的异常，如在患者心肌中 BRG1基因内的CpG区会表现出异常的低甲基化 ^{[ 123]} ，导致患者出现房间隔缺损、室间隔缺损 ^{[ 24]} ; 而启动子区的 CITED2基因异常甲基化也会导致患者出现房间隔缺损、室间隔缺损 ^{[ 26]} 。

组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶的作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等过程。参与组蛋白修饰调控的酶主要包括组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶(HDAC) ^{[ 15]} 。生殖细胞中敲除Ⅱ类HDAC中的 HDAC5和 HDAC9会引起室间隔缺损 ^{[ 44]} ，而在生殖细胞中敲除Ⅲ类HDAC中的沉默信息调节因子2相关酶1( SIRT1)则会造成房间隔缺损、室间隔缺损和心脏瓣膜缺损 ^{[ 80]} 。生殖细胞中敲除组蛋白甲基转移酶 SMYD1造成心室发育不全 ^{[ 77]} ，而敲除其中另一个组蛋白甲基转移酶 WHSC1则会造成心房和心室间隔缺损 ^{[ 87]} 。此外，研究发现组蛋白去甲基化酶的异常也会造成心脏发育受损，如组蛋白去甲基化酶Jumonji缺乏会导致右室双流出道和过度小梁化 ^{[ 15]} 。

ATP依赖的染色质重塑复合体有四个，根据复合体内ATP酶亚基的序列和结构，分为SWI/SNF、ISWI、CHD和INO80 ^{[ 124]} 。这些复合体在其他因子的辅助下，调控核小体的再定位和去除，从而促进或抑制基因表达。SWI/SNF和CHD这两个复合体与心脏缺陷联系紧密。哺乳动物体内的SWI/SNF复合体类似物是Brg1/BAF复合体。作为SWI/SNF复合体中的ATP酶亚基， Brg1在心脏发育过程中发挥着关键的作用。在小鼠胚胎发育第9.5天时条件性敲除心肌细胞中的 Brg1，会造成室间隔缺损；而在第二心岛敲除 Brg1，则会造成右心室及流出道发育不全 ^{[ 24]} 。染色质域解旋酶DNA结合蛋白(CHD)家族是染色质重塑复合体中的重要一类，其中CHD7在中胚层系统的心脏分隔和成熟、神经分布及血管生成中发挥重要作用，缺失CHD7主要表现为圆锥动脉干畸形、房间隔缺损、室间隔缺损及房室间隔缺损 ^{[ 25]} 。此外，研究发现在小鼠胚胎中 Baf60c选择性表达于心脏与体节，条件性敲低 Baf60c会造成第一心岛发育缺陷、心室发育不全、流出道异常 ^{[ 22]} 。

非编码RNA是指不翻译成蛋白质的RNA，其中参与基因调控的非编码RNA包括miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、PIWI相互作用RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)等 ^{[ 125]} 。miRNA和lncRNA是非编码RNA中研究最为广泛的。

miRNA是一类广泛存在于真核细胞中并且高度保守的约22个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA。调控方式主要通过靶向结合mRNA，进而抑制或阻断翻译 ^{[ 126- 127]} 。心脏发育是一个多基因调控的过程，miRNA可参与心脏发育相关通路的调控进而导致先天性心脏病的发生 ^{[ 128]} 。室间隔缺损是最常见的先天性心脏病类型。实验表明，在室间隔缺损患者的心脏组织中，miRNA-1-1表达明显下调。通过筛选证实 SOX9是miRNA-1-1的靶基因， SOX9是心脏瓣膜和间隔发育重要的调控基因，其表达下降引起心脏发育缺陷 ^{[ 79]} 。法洛四联症是常见的严重青紫型先天性心脏病。实验证实，在法洛四联症患者的心脏组织中，miRNA-1275、miRNA-27b和miRNA- 421表达上调，而miRNA-1201和miRNA-122表达下调 ^{[ 129]} 。肌细胞增强因子2( Mef2c)是miRNA-27b的靶基因，miRNA-27b过度表达可抑制 Mef2c从而影响心肌发育，导致心肌肥厚 ^{[ 130]} 。最新研究发现， Frataxin ( FXN)是先天性心脏病中表达差异最明显的中枢基因, miRNA-145过表达可以抑制 FXN基因的表达；同时，miRNA-145通过影响 FXN基因表达，对细胞凋亡和线粒体功能进行调控，进而导致先天性心脏病的发生 ^{[ 131]} 。

lncRNA是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA通过控制基因表达调节细胞过程不编码蛋白质的新型转录物。对临床室间隔缺损患者的心脏样本进行转录组分析，发现具有显著表达差异的lncRNA，从中挑选高度保守的lncRNA uc.299作为研究对象。结果表明，uc.299定位于 PAX2基因的第1个内含子和第2个外显子交接处 ^{[ 73]} ，而 PAX2参与许多器官的发育，其异常表达常引起疾病的发生 ^{[ 132]} ，uc.299的显著低表达最终导致了先天性心脏病的发生。

通过数十年的研究，已知各种类型的染色体变异、基因突变及表观遗传性修饰等与先天性心脏病的发生密切相关。但是关于表观遗传学修饰及环境因素的相互作用在先天性心脏病发生中的角色仍然还有很多未知。随着精准医学概念的提出，基因组测序、生物芯片和生物信息技术的快速进展和应用，先天性心脏病的治疗和研究进入了一个全新的阶段。这些新技术的运用将为先天性心脏病的预防、诊断和治疗提供有效的方法，为先天性心脏病的个体化医疗开辟新的途径。

Funding Statement

浙江省重点研发计划（2017C03009）；浙江省卫生高层次人才培养工程（2016-6）