骨巨细胞瘤组织S100A8和S100A9表达及与肿瘤影像学表现的相关性分析

Abstract

Objective

To investigate the mRNA and protein expression levels of S100A8 and S100A9 in giant cell tumor(GCT) of bone, and its relation with radiological findings and biological behavior.

Methods

Forty three patient with GCT of bone admitted in Ruijin Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine from January 2009 to June 2012 were enrolled in the study. The expression levels of S100A8 and S100A9 mRNA and protein were detected by using semiquantitative RT-PCR and Western blotting in 43 specimens of GCT and 6 specimens of normal bone marrow. The CT and MRI findings of patients were retrospectively reviewed, its relation with tissue expression of S100A8 and S100A9 was analyzed.

Results

Among 43 GCT cases 40 showed positive expression of S100A8 and S100A9 mRNA and protein, and the expression levels were significantly higher than those in normal bone marrow( P < 0.05). The expression level of S100A8 protein was significantly different in bone GCT with different composition ratio on MRI( P < 0.05).The expression level of S100A9 protein was significantly different in GCT with different degree of bone destruction on CT scan( P < 0.05).

Conclusion

The expression of S100A8 and S100A9 mRNA and protein is up-regulated in GCT of bone. The expression of S100A8 and S100A9 is associated with the real composition ratio and the degree of bone destruction, respectively, indicating that S100A8 and S100A9 may be involved in the biological behavior of bone GCT.

近年来的研究表明，炎症在肿瘤的发生发展过程中起着十分重要的作用。它们之间有着十分复杂而密切的关系。而在炎症和肿瘤发生的分子生物学机制中，S100A8和S100A9蛋白起着十分重要的作用。S100A8和S100A9是S100蛋白家族中的一员，有炎症趋化及促进肿瘤生长等作用 ^{[ 1, 2]} 。S100A8和S100A9的高表达与肝癌、肾癌、肺癌及乳腺癌等的发生发展关系密切 ^{[ 3]} 。实验表明，S100A8、S100A9和羟基聚糖、糖化终末产物受体在炎症介导的癌症如肠癌中起着重要作用，它们之间的相互关系通路可能为临床治疗提供靶位 ^{[ 2]} 。但这些研究现阶段涉及软组织及骨肿瘤的文献极少 ^{[ 4, 5]} ，未见与骨巨细胞瘤的相关报道。S100A8、S100A9在骨巨细胞瘤中的表达情况如何及是否参与骨巨细胞瘤的发生发展，与骨巨细胞瘤的复发及影像学表现是否有关等，值得我们进一步探寻。前期我们对骨巨细胞瘤组织进行基因芯片(Affymetrix Genome 230 2.0 Array)检测发现，骨巨细胞瘤中S100A8、S100A9基因表达呈两倍以上增加。在临床中我们发现，不同的骨巨细胞瘤患者CT表现的骨质破坏程度不同，MRI表现的囊变坏死及实质成分比例亦有不同表现，S100A8、S100A9表达是否与骨巨细胞瘤的骨质破坏程度及实质成分多少有关？本研究旨在通过检测骨巨细胞瘤中S100A8、S100A9的表达水平，探讨其表达与骨巨细胞瘤影像学关系，从而对骨巨细胞瘤的侵袭性、预后进行一定的预测和判断，为临床可能的治疗方法提供依据。

收集2009年1月至2012年6月在上海交通大学医学院附属瑞金医院手术及病理学检查证实并随访2年以上的43例骨巨细胞瘤患者的临床资料，其中男性20例，女性23例，年龄17~65岁，平均年龄(32.9±5.6) 岁，病变部位以股骨远端、胫骨近端等为主。所有病例至少随访两年以上，复发者18例。并采集骨巨细胞瘤患者的新鲜肿瘤组织，EP管分装，－80℃保存备用。另外，取6例全髋关节置换术患者的股骨骨髓作为对照，提取单个核细胞，装入1.5 mL的EP管，－80℃保存备用。这6例患者中男性4例，女性2例，年龄56~72岁，无血液系统疾病及其他影响骨髓的疾病。

Trizol试剂盒购自美国lnvitrogen公司；β-actin及S100A9单克隆抗体购自美国Abcam公司；S100A8单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。主要仪器有低温冷冻离心机(美国Sigma公司)、台式高速离心机(德国Kendro公司)、PCR扩增仪(德国Biometra公司)、电泳仪系统(美国Bio-Rad公司)、电泳槽、VDS成像系统(美国Pharmacia公司)。CT扫描采用High-speed和Light speed CT机(美国GE公司)；MRI扫描采用Sigma 1.5 T或3.0 T超导型磁共振设备(美国GE公司)。

按Trizol试剂盒说明书，提取组织中总RNA，合成cDNA第一链。引物由上海生工生物工程技术有限公司设计合成，引物序列：GAPDH：上游引物5′-CAC TGA CAC GTT GGC AGT GG-3′，下游引物5′-CAT GGA GAA GGC TGG GGC TC-3′；S100A8：上游引物5′-TGT CAG CTG TCT TTC AGA AG-3′，下游引物5′-ACG CCC ATC TTT ATC ACC AG-3′；S100A9：上游引物5′-GGG AAT TCA AAG AGC TGG TG-3′，下游引物5′-CAC TTG TGA TCT TGG CCA CTG-3′。PCR在25 μL反应体系中进行，PCR扩增程序为95 ℃10 min热启动，然后95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，扩增31个循环；最后72 ℃保温10 min。PCR产物在含有溴化乙啶的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较扩增产物的大小。VDS成像系统扫描分析图像，计算目的条带与GAPDH条带灰度值的比值，进行半定量分析。

组织以1:5比例加入裂解缓冲液，200 mg加1 mL缓冲液，匀浆机匀浆，4 ℃ 12000× g离心1 h，取上清液。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度后备用。制胶后，每孔加入100 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，电泳结束后按半干法将电泳产物转印到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗(浓度1:1000稀释)，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(浓度1:4000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，加ECL试剂在室温下反应1 min。碱性磷酸酶显色，扫描，计算目的条带与β-actin条带灰度值的比值，进行半定量分析。

CT检查：使用High-speed或Light speed CT机，取骨窗和软组织窗，层厚、层距5~10 mm。CT主要分析骨巨细胞瘤患者骨质破坏程度，分为无、轻度(骨皮质破坏＜25%)、中度(骨皮质破坏25%~50%)、重度(骨皮质破坏>50%)骨皮质破坏。

MRI检查:使用3.0 T超导型磁共振设备，扫描参数：层厚5 mm/层间距1 mm，视野(FOV)18 cm×18 cm~45 cm×45 cm，矩阵192×256，行T1WI(TR500 ms，TE20 ms)、T2WI(TR3000 ms，TE100 ms)、STIR (TR3500 ms，TI 110 ms，TE30 ms)。根据病变部位采用表面线圈或体线圈。MRI主要分析实质成分比例( < 50%、50%~75%和>75%)、水肿程度(无、轻、中、重度骨水肿)和关节积液(分为少量、中等、大量积液)。

图 1为右肱骨近段骨巨细胞瘤CT和MRI表现。

患者术后定期随访2年及以上。随访复查CT或MRI，根据影像学及临床表现判断患者是否复发，考虑复发者再次手术治疗，并经病理学检查证实为肿瘤复发。

所得数据采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差( x ± s)表示，两独立样本比较采用 t检验，多组间比较采用方差分析，以 P < 0.05为差异有统计学意义。

43份骨巨细胞瘤组织中有40份检测出S100A8、S100A9 mRNA表达，3份未检测到S100A8、S100A9 mRNA的明显表达；对照组只检出少量S100A8、S100A9 mRNA表达。骨巨细胞瘤组织S100A8和S100A9 mRNA的表达量(1.014±0.035和1.018±0.043) 较对照组(0.301±0.016和0.270±0.020) 增加(均 P < 0.05)，见 图 2。

PCR结果显示，不同CT、MRI表现的患者骨巨细胞瘤组织S100A8及S100A9 mRNA表达结果差异无统计学意义(均 P>0.05)，见 表 1。

表1 骨巨细胞瘤患者CT、MRI表现与肿瘤组织S100A8、S100A9表达的关系

Table 1 The relationship between S100A8/A9 expression levels and CT, MRI findings in patients with giant cell tumor of bone

x ± s
CT和MRI表现及肿瘤复发情况	n	mRNA	蛋白
S100A8	S100A9	S100A8	S100A9
CT示骨质破坏程度	无	9	1.067±0.16	1.077±0.17	0.471±0.88	0.263±0.15
	轻度(＜25%)	8	1.027±0.24	0.983±0.25	0.352±0.23	0.408±0.15
	中度(25%~50%)	14	0.940±0.29	0.907±0.30	0.459±0.46	0.495±0.29 *
	重度(>50%)	12	1.031±0.21	1.084±0.33	0.908±0.79	0.475±0.24 *
MRI示实质成分比例	< 50%	7	0.962±0.17	0.927±0.19	0.535±0.53 △	0.284±0.16
	50%~75%	6	1.010±0.23	1.041±0.25	0.449±0.45 △	0.399±0.18
	>75%	30	1.026±0.24	1.031±0.30	1.196±1.26	0.463±0.26
MRI示水肿程度	无	3	1.188±0.04	1.170±0.06	0.087±0.02	0.189±0.07
	轻度( < 1cm)	18	1.055±0.19	1.025±0.36	0.556±0.50	0.490±0.28
	中度(1~2cm)	15	1.032±0.26	1.067±0.21	0.544±0.70	0.418±0.19
	高度(>2cm)	17	0.903±0.22	0.918±0.22	0.849±0.98	0.373±0.24
MRI示关节积液	少量( < 1cm)	18	1.041±0.26	0.994±0.27	0.491±0.55	0.435±0.31
	中等(1~2cm)	22	1.009±0.21	1.040±0.29	0.619±0.77	0.430±0.19
	大量(>2cm)	3	0.851±0.17	0.945±0.03	0.645±0.48	0.325±0.17
肿瘤复发情况	未复发	25	0.980±0.18	0.959±0.22	0.643±0.79	0.438±0.23
	复发	18	1.056±0.28	1.089±0.32	0.461±0.41	0.406±0.26

CT示不同骨质破坏程度S100A9蛋白表达量有差异( F=3.557， P=0.037)，与CT示无或轻度骨质破坏程度比较， ^* P < 0.05.MRI示不同实质成分比例S100A8蛋白表达量有差异( F=2.013， P=0.048)，与MRI示实质成分比例大于75%比较， ^△ P < 0.05.

43份骨巨细胞瘤组织有40份检测出S100A8、S100A9蛋白表达，3份未检测到S100A8、S100A9蛋白明显表达；6份对照组组织S100A8、S100A9蛋白少量表达。骨巨细胞瘤组S100A8、S100A9蛋白相对表达量(0.567±0.066和0.425±0.024) 较对照组(0.071±0.008和0.160±0.060) 均增加(均 P < 0.05)，见 图 3。

CT检查提示不同的骨质破坏程度的骨巨细胞瘤组织S100A9蛋白表达差异有统计学意义( P < 0.05)，即肿瘤骨质破坏程度为中—重度者S100A9蛋白表达多于无或轻度骨质破坏者。MRI检查提示不同比例的实质成分的骨巨细胞瘤组织S100A8蛋白表达差异有统计学意义( P < 0.05)，即肿瘤实质成分>75%者S100A8蛋白表达高于肿瘤实质成分≤75%者。见 表 1。

S100A8蛋白和S100A9蛋白均属于钙结合蛋白S100蛋白家族成员，两者常以钙离子依赖性方式形成异源二聚体S100A8/A9蛋白复合物，可参与炎症反应，调节细胞生长分化等 ^{[ 6]} 。研究发现，在人类多种原发和浸润性肿瘤如胃癌、膀胱癌、大肠癌等均检测到S100A8和S100A9的高表达 ^{[ 1, 7, 8, 9]} 。Petersson等 ^{[ 10]} 分析卵巢肿瘤患者血清和卵巢积液，发现只有在恶性卵巢肿瘤患者的血清中及卵巢积液中能够检测到S100A8/A9，而良性卵巢囊肿患者的血清及卵巢积液中未发现S100A8/A9的表达。Kim等 ^{[ 11]} 发现在大肠腺瘤和早期大肠癌血清中S100A8和S100A9显著表达，且在大肠癌中肿瘤浸润的免疫细胞中也有高表达。这表明S100A8/A9不但与炎症相关，而且还与许多肿瘤关系密切，如胃癌、大肠癌、前列腺癌等肿瘤中S100A8、S100A9表达增加 ^{[ 12, 13]} ，S100A8、S100A9可能参与肿瘤的分化，与肿瘤侵袭性有关 ^{[ 9, 14]} 。本实验结果表明，在骨巨细胞瘤组织中，S100A8、S100A9 mRNA及其蛋白表达均增加，提示S100A8/A9也可能参与骨巨细胞瘤的发生发展，与骨巨细胞瘤的发病机制有关。

有研究显示，S100A8和S100A9在结直肠肿瘤中高表达多聚集于肿瘤的边缘，故推测它与肿瘤的侵袭活性相关，但机制不明 ^{[ 15]} 。本研究结果显示，CT检查提示不同的骨质破坏程度的骨巨细胞瘤组织S100A9蛋白表达差异有统计学意义，即肿瘤骨质破坏者S100A9蛋白表达高于无骨质破坏者，S100A9可能参与骨巨细胞瘤骨质破坏过程，与骨巨细胞瘤侵袭性具有一定的关系。同时，我们研究还发现MRI检查提示不同比例实质成分的骨巨细胞瘤组织S100A8蛋白表达差异有统计学意义，即肿瘤实质成分>75%者S100A8蛋白表达多于肿瘤实质成分≤75%者。肿瘤实质成分越多，囊变越少，可能说明病灶内肿瘤细胞相对越多，其分泌或表达较多的S100A8、S100A9蛋白，从而使肿瘤内活性成分相对较多，肿瘤生长活跃，具有较明显的侵袭性，因而骨质破坏越明显。本研究并未发现S100A8和S100A9表达与关节积液、水肿程度和肿瘤复发的相关性。

总之，本研究结果显示，骨巨细胞瘤中S100A8、S100A9 mRNA及其蛋白表达增加，S100A8及S100A9可能参与骨巨细胞瘤的发生发展，并与骨巨细胞瘤骨质破坏程度、实质成分比例有关，但其对预测肿瘤复发作用有待更深入的研究。检测骨巨细胞瘤组织中S100A8、S100A9 mRNA及蛋白表达，可提高对其侵袭性的认识，从而为临床治疗方式的选择提供一定的依据。

Funding Statement

国家自然科学基金(81072188)