高龄孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查胎儿常见非整倍体的临床意义

Abstract

目的

评估孕妇外周血胎儿游离DNA检测这一无创产前筛查（NIPS）技术在高龄孕妇产前筛查中的效率，并据此提出高龄孕妇产前筛查及诊断的优化策略。

方法

以2015年2月至2016年9月在浙江大学医学院附属妇产科医院和嘉兴市妇幼保健院行NIPS并完成妊娠结局随访的10 584名高龄孕妇为研究对象，统计NIPS在高龄孕妇中检测胎儿常见染色体非整倍体的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，并分析孕妇年龄与胎儿常见染色体非整倍体疾病的相关性。

结果

NIPS检测高龄孕妇胎儿21三体的敏感度为100.00%、特异度为99.96%、阳性预测值为91.67%、阴性预测值为100.00%；检测18三体的敏感度为100.00%、特异度为99.93%、阳性预测值为68.18%、阴性预测值为100.00%；检测13三体的敏感度为100.00%、特异度为99.97%、阳性预测值为25.00%、阴性预测值为100.00%。胎儿21三体的高风险率和真阳性率随孕妇年龄的增长而升高（均 P < 0.01）。其中，35~37岁组与38~40岁组21三体的高风险率和真阳性率差异有统计学意义（均 P < 0.05）；38~40岁组与41岁以上年龄组21三体的高风险率差异有统计学意义（ P < 0.05），但真阳性率差异无统计学意义（ P>0.05）。

结论

NIPS用于高龄孕妇的产前筛查具有良好的检测效率。对于预产期年龄38岁以下的孕妇，NIPS可作为优先选项；对于预产期年龄超过41岁的孕妇，建议选择介入性产前诊断；而对于预产期年龄为38~ < 41岁的孕妇，则可充分告知后酌情选择。

随着我国一对夫妇可生育二个孩子政策的实施，高龄孕妇的数量呈井喷式增加。初步观察显示，高龄孕妇已占产前诊断门诊的33.4%~46.0% ^{[ 1- 4]} 。根据我国《产前诊断技术管理办法》 ^{[ 5]} ，高龄孕妇是胎儿患染色体非整倍体疾病的高风险因素，应接受介入性产前诊断。然而，介入性产前诊断是一项有创检测技术，存在细胞培养周期长、细胞培养可能失败、无法实现高通量自动化检测以及有胎儿丢失的风险等不足，再加上医疗资源的供需矛盾，难以满足全部高风险和高龄孕妇的需求。因此，临床上需要有更顺应临床需求的产前筛查和诊断技术和方案。基于第二代测序技术的孕妇外周血胎儿游离DNA检测这一无创产前筛查(non-invasive prenatal screening，NIPS)技术可实现高通量自动化分析。临床观察表明，NIPS在血清学筛查高风险和低风险人群中均具有良好的表现，检测效率高于血清学筛查 ^{[ 6- 9]} 。然而，NIPS用于高龄孕妇产前筛查的评估尚不多见，在中国人群中的应用情况更是缺乏。鉴于此，本研究通过对10 584名高龄孕妇NIPS结果进行分析，评估高龄孕妇NIPS的筛查效率，并据此提出高龄孕妇产前筛查的优化方案。

2015年2月1日至2016年9月30日在浙江大学医学院附属妇产科医院和嘉兴市妇幼保健院行NIPS的孕妇共29 385名，将其中完成了妊娠结局随访的10 584名高龄孕妇(预产期年龄≥35岁)作为研究对象。研究对象预产期年龄为35~60岁(其中≥45岁者49例)，中位年龄37岁；孕龄12~30周，中位孕龄16周。按照2016年《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》 ^{[ 10]} 排除不适用人群。所有孕妇均以早孕超声检查核实孕周，孕妇年龄为按预产期修正后周岁年龄。所有入选孕妇均在充分知情的前提下，自愿选择NIPS或介入性产前诊断，NIPS高风险者接受介入性产前诊断，分娩后3个月接受妊娠结局随访。

抽取孕妇静脉血5 mL于EDTA抗凝管中，4 ℃冰箱保存，经血浆DNA提取、文库构建，采用BGISEQ-100测序平台对血浆中胎儿游离DNA片段进行高通量测序，最后通过生物信息学分析得出胎儿患染色体非整倍体疾病的风险率，常规报告21三体、18三体、13三体 ^{[ 11- 12]} 。检测结果Z值在-3.0~3.0范围内为正常，超过此范围则为异常。

NIPS高风险并接受介入性产前诊断的高龄孕妇以胎儿核型分析为标准，NIPS低风险孕妇以随访的妊娠和新生儿结局为标准，统计胎儿21三体、18三体、13三体的确诊情况。

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。不同年龄段21三体阳性率比较采用 χ ²检验， P＜0.05为差异有统计学意义。

10584名高龄孕妇胎儿常见染色体非整倍体筛查结果见 表 1。共筛查出21三体高风险孕妇57例，其中确诊44例、假阳性4例、未行产前诊断9例(其中因胎膜早破晚期难免流产1例，死胎引产1例，超声检查提示心脏异常直接引产1例，患者拒绝进一步检查出生后白血病仍拒绝核型分析1例，其余5例均为孕妇及家属拒绝进一步核型分析在外院终止妊娠)；18三体高风险孕妇28例，其中确诊15例、假阳性7例、未行产前诊断6例(其中超声检查提示多发畸形直接引产3例，超声检查提示心脏畸形直接引产1例，患者拒绝进一步核型分析在外院终止妊娠2例)；13三体高风险孕妇5例，其中确诊1例、假阳性3例、未行产前诊断1例(超声检查提示胎儿多发畸形，患者要求引产未进一步行核型分析)。

表1 胎儿常见非整倍体无创产前筛查结果

Table 1 Results of fetal common chromosomal aneuploidy screening

( n)
非整倍体类型	NIPS高风险	确诊	假阳性	未行产前诊断
21三体	57	44	4	9
18三体	28	15	7	6
13三体	5	1	3	1

NIPS筛查21三体、18三体和13三体的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值见 表 2。提示NIPS对21三体、18三体和13三体的检验效率较高。

表2 无创产前筛查对常见非整倍体的检验效率

Table 2 Performance of NIPS for screening fetal common chromosomal aneuploidies

(%)
非整倍体类型	敏感度	特异度	阳性预测值	阴性预测值
21三体	100.00	99.96	91.67	100.00
18三体	100.00	99.93	68.18	100.00
13三体	100.00	99.97	25.00	100.00

各年龄组孕妇的胎儿21三体的检出情况见 表 3。胎儿21三体的高风险率和真阳性率随孕妇年龄的增长而升高(均 P＜0.01)。其中，35~37岁年龄组与38~40岁组21三体的高风险率和真阳性率差异均有统计学意义(均 P＜0.05)，38~40岁组与41岁及以上年龄组21三体的高风险率差异有统计学意义( P＜0.05)，但真阳性率比较差异无统计学意义( P＞0.05)。

表3 不同年龄组无创产前筛查胎儿21三体的高风险率和真阳性率比较

Table 3 The high-risk rates and true positive rates of trisomy 21 in different age groups

年龄(岁)	n	高风险例数	高风险率(%)	确诊例数	真阳性率(%)
35	2459	7	0.28	6	0.24
36	2330	13	0.56	6	0.26
37	1883	6	0.32	5	0.27
38	1477	12	0.81	11	0.74
39	970	3	0.31	2	0.21
40	638	5	0.78	4	0.63
41	354	6	1.69	5	1.41
≥42	473	5	1.06	5	1.06

血清学筛查是目前应用最广泛的早、中孕期联合筛查方法。目前，国内外仍以对血清学筛查高风险孕妇行羊水穿刺或脐血穿刺获取胎儿细胞进行核型分析作为胎儿染色体是否异常的诊断标准。在我国，目前所有35周岁以上的孕妇均被纳入胎儿非整倍体高风险范畴。然而，随着我国一对夫妇可生育二个孩子政策的全面实施，高龄孕妇的数量庞大，给产前诊断机构带来了巨大的工作压力。此外，羊水穿刺或脐血穿刺属有创检查，导致胎儿丢失等并发症的发生率高达0.5%~1.0% ^{[ 13]} ，且存在感染风险，故孕妇依从性低。部分孕妇还可能存在介入性产前诊断手术禁忌证，如先兆流产、发热、出血倾向、感染未愈等，不适用此类检查。因此，临床迫切需要寻找一种更顺应临床需要的产前筛查方法及对高龄孕妇更合理的产前筛查临床路径。

NIPS是通过高通量测序技术检测孕妇外周血中胎儿游离DNA以筛查胎儿非整倍体异常的无创技术。Lo等 ^{[ 14- 15]} 早在1997年已经证实，孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，且其含量与代谢半衰期等特点均适合用于产前检查。但是，直到近年高通量测序技术的出现才使得基于胎儿游离DNA的NIPS临床应用成为可能 ^{[ 16]} 。NIPS在国内外已在多个临床试点实施并进行了大规模的数据统计。Vrachnis等 ^{[ 17]} 对7285名孕妇产前筛查的比较研究发现，NIPS对胎儿21三体的阳性预测值为80%~89%，18三体的阳性预测值为65.5%，显著高于常规血清学筛查的阳性预测值(21三体的阳性预测值为3.4%~4.2%，18三体的阳性预测值为8.3%)；同时，研究还发现NIPS对21三体和18三体的漏诊率分别为0.3%和0.2%，显著低于血清学筛查的漏诊率(分别为3.6%~5.2%和0.6%)。由此可见，NIPS对胎儿21三体和18三体的筛查效率明显高于常规的血清学产前筛查。此外，有研究显示，NIPS对高龄孕妇筛查的效率与在非高龄人群中的结果相当，考虑到侵入性产前诊断可能导致胎儿丢失的风险，高龄不应作为侵入性产前诊断的指征 ^{[ 18- 21]} 。目前，一些国外的学术组织如国际产前诊断学会(ISPD)、美国妇产科医师学会(ACOG)、英国皇家妇产科医师学会(RCOG)、美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)等已将NIPS列为所有孕妇的一线筛查手段。本文资料提示，NIPS用于筛查高龄孕妇胎儿常见非整倍体异常的效率较高，适宜在高龄孕妇中推广应用。

然而，NIPS作为一种筛查手段，其检测胎儿非整倍体高风险者，仍需进一步做羊水穿刺、脐血穿刺等有创检查，通过细胞核型分析来明确诊断。鉴于孕妇的预产期年龄与染色体疾病的发生率密切相关 ^{[ 22]} ，我们进一步研究了孕妇预产期年龄与最常见的非整倍体疾病21三体的相关性。结果发现，37岁及其以下年龄段孕妇的胎儿21三体阳性检出率非常接近，到了38岁时阳性检出率突然上升，39、40岁又相对平稳，41岁时再次上升，到42岁及以上又相对平稳，与陈铁锋等 ^{[ 1]} 对高龄孕妇行羊水细胞染色体核型分析得到的年龄分层基本一致。据此，我们建议高龄孕妇产前筛查时，对于预产期年龄在38岁以下的孕妇，NIPS可为优先选项；对于预产期年龄41岁及以上的孕妇，建议选择介入性方法；而对于预产期年龄为38~＜41岁的孕妇，可在充分告知后由其自主选择产前诊断方式为NIPS还是介入性方法。

综上所述，本研究通过对10 584名高龄孕妇的检测数据进行分析发现，NIPS用于高龄孕妇的产前筛查具有良好的效率。但是，本研究尚存在以下不足：① NIPS检测出的高风险人群中存在较大比例的未确诊病例，由于这些未确诊病例中可能有相当多为胎儿非整倍体患者, 特别是合并影像学异常或胎死宫内者，故实际NIPS检测胎儿21三体、18三体、13三体的阳性预测值应高于本文资料中的数据。在孕妇年龄与胎儿21三体发生率的相关性分析中，对确诊病例分析后所得的年龄分割点与对高风险病例分析后所得的年龄分割点不完全一致，可能与未确诊病例中存在较大比例的21三体胎儿有关。② 由于规范有序地开展NIPS的时间尚短，目前积累的病例数尚有限，尤其是18三体和13三体的发生率低，收集到的阳性病例非常有限。期待未来有更大样本量的多中心研究成果，可为优化高龄孕妇产前筛查与诊断策略提供更为充分的依据。

Funding Statement

国家重点研发计划（2016YFC1000703）；浙江省医药卫生科技计划（2018KY809）