人乳头瘤病毒相关宫颈癌的精准筛查和治疗

Abstract

宫颈癌是自身和环境共同作用下的复杂疾病。在宿主遗传易感性的基础上，高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染并整合入宿主、宿主基因组的甲基化及体细胞突变等基因组及表观基因组特征变化在宫颈癌的发生和发展中具备分子分型、早期预警及指示预后的关键作用。因此，基于第二代测序技术的HPV等分子检测及动态机器学习模型将更精准地预测真正可能致癌的患者，减轻反复筛查负担；与此同时，基因编辑技术的靶向定点切割将使HPV感染相关宫颈病变的治疗成为可能。本文回顾了HPV相关宫颈癌分子生物学研究进展，提出未来我国宫颈癌精准防治的方向。

宫颈癌是世界第四大妇科恶性肿瘤 ^{[ 1]} 。流行病学研究表明，世界宫颈癌每年新发病例约为57万，每年死亡病例超过31万，其中宫颈癌在发展中国家的发病率和病死率分别是其在发达国家的1.75倍和3倍 ^{[ 1]} 。尽管随着人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)疫苗及宫颈癌早期筛查的普及，发达国家宫颈癌的发病率和病死率逐步下降，但在发展中国家，由于HPV感染缺乏有效的预防和筛查措施，宫颈癌的发病率仍逐年上升，其防治形势不容乐观。

HPV感染是导致宫颈癌的主要因素。研究表明大多数HPV可被宿主免疫系统自发清除，只有极少数会形成持续感染并最终导致宫颈癌变 ^{[ 2]} 。目前，国际上主要通过高危型HPV DNA检测及液基细胞学(宫颈脱落细胞形态学改变)检查进行宫颈癌筛查，但这些方法的敏感度和特异度仍有局限。更为重要的是，现行的筛查方法未能充分利用导致宫颈癌变的关键分子生物学事件，无法全面针对个体信息进行风险分层，且筛查过程繁琐，指南标准复杂，必须针对全人群反复筛查才能有效降低全民发病率 ^{[ 2]} ，这对于人口众多的发展中国家是一个难以承受的经济负担。

精准医疗是建立在生命科学大数据及对疾病生物学发生和发展个体化模式充分认知的基础上，实现对疾病更为便捷、高效、个性化的预防及诊治。这种医疗模式的出现为我们探索针对HPV持续感染的分子生物学基础及病毒最终导致宫颈癌变的根本内涵、筛选高危人群进行重点筛查及靶向干预提供了契机。本文通过文献回顾，阐述HPV相关宫颈癌的分子生物学机制及临床精准筛查、诊断和治疗的研究进展。

宫颈癌是由遗传因素和环境因素共同作用导致的慢性复杂性疾病。尽管HPV感染是主要的环境风险因素，部分病例仍存在着对癌前病变或癌症进展的内在易感性。

目前关于宿主对宫颈癌易感性的研究主要集中于 HLA基因。迄今，在中国人群中开展的最大规模的宫颈癌易感性研究在HLA-DPB1/2和HLA-DPA1的180 kb区域内鉴定了包括1个4q12，1个17q12，9个6p21.3211在内的11个重要的单核苷酸多态性位点，这些多态性位点可能通过调控机体免疫系统对HPV持续感染及整合产生影响，有望作为预测宫颈癌发病风险的可靠靶点 ^{[ 3]} 。然而，目前这些遗传易感性位点促进宫颈癌发生和发展的具体通路和机制尚未可知，迫切需要全基因组关联研究深入探索。

HPV是一个大家族，其系统分类包括5个属(α、β、γ、μ和 ν)、48种和206型 ^{[ 3]} ，其中，按宫颈癌致癌风险可分为三类，即13种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，14种可疑高危型(HPV5、26、53、66、67、68、70、73、82、30、34、69、85和97)和其他低危型(HPV6、11、42、44)。在高危型HPV中，全球一半以上的宫颈癌是由HPV16感染所致，其次是HPV18。

HPV因广泛变异衍生出不同的突变株，而不同HPV亚型的突变株在宫颈癌的发病中具有重要的流行病学和癌症风险评估价值。迄今最大的HPV16亚型致癌风险分析表明，尽管A1和A2亚型感染更为普遍，但A4、C、D2、D3亚型的致癌风险更高 ^{[ 4]} 。与HPV16相反，研究显示HPV18亚型与宫颈癌风险或组织学类型并无相关性 ^{[ 5]} 。因此，后续的研究应着重于HPV亚型的致癌差异及其与种族、个体变异、地理或行为因素之间的关系。

1987年，科学家El-Awady在SiHa细胞染色体13q22上KLF5和KLF12之间的基因间区中检测到了HPV16基因组DNA的插入 ^{[ 6]} ，这是首次在人类基因组中鉴定出HPV DNA的整合。从那时起，逐渐开发出多种基于PCR的HPV整合检测方法，包括DIPS-PCR(detection of integrated papillomavirus sequences by ligation-mediated PCR)、RS-PCR(restriction site-PCR)等。基于这些方法，研究者对宫颈癌中HPV在宿主基因组的整合情况进行了初步研究，主要结论包括：①HPV DNA整合到宿主染色体中是宫颈癌发生的关键分子生物学事件 ^{[ 7]} ；②HPV的整合断裂点通常发生在病毒E1和E2区域的开放阅读框，从而导致癌基因E6和E7上调 ^{[ 5]} ；③HPV整合位点在宿主基因组上是随机分布的 ^{[ 6]} ；④HPV倾向于整合到常见的脆性位点 ^{[ 8]} ；⑤HPV更倾向于整合到转录活跃或结构简单的区域 ^{[ 7]} 。

但是，由于PCR检测是基于病毒早期编码区基因的扩增，无法检测出其他病毒区域整合到人类基因组的位点，存在很大的偏向性。随着第二代测序技术的发展，研究人员能够在大样本中进行高度敏感的HPV整合分析。有研究通过分析135个样本中HPV的整合断点，在全基因组水平绘制了HPV的整合热点图谱，揭示了HPV定点整合与宫颈癌进展的关系，为宫颈癌的精准化个体筛查和靶向治疗提供了靶点 ^{[ 8]} 。

除了HPV整合之外，宿主基因组DNA突变在鉴定癌组织和非癌组织之间的差异以及指导诊断和治疗中起着重要作用。

Ojesina等 ^{[ 9]} 通过第二代测序技术分析并揭示了 EP300(16%)、 FBXW7(15%)、 PIK3CA(14%)、 HLA-B(9%)和 p53(9%)基因突变与宫颈鳞癌的发生相关，而 PIK3CA(16%)、 ELF3(13%)、 KRAS(8%)和 CBFB(8%)基因突变与宫颈腺癌的发生相关。这些潜在的基因突变不仅可以作为宫颈癌早期诊断的标志物，对宫颈癌的预后也起到一定的提示作用，如 PIK3CA基因突变可以增加宫颈癌远处转移的风险 ^{[ 10]} 。

高危型HPV E6和E7基因与DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的功能直接相关 ^{[ 8]} 。例如，敲低HPV E6和E7基因可以降低抑癌基因的甲基化水平，通过恢复其功能逆转宫颈癌细胞系的恶性表型。进一步研究表明，宿主基因组DNA甲基化水平与宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的严重程度呈正相关。Hesselink和Bierkens开发的CADM1/MAL基因甲基化检测方法检测CIN Ⅲ和宫颈癌的敏感度分别高达100.0%和60.5% ^{[ 10- 11]} 。此外有研究显示，抑癌基因 PTCH1和 PTPRR的甲基化可以预测宫颈癌患者的不良预后 ^{[ 12- 14]} 。

随着宫颈癌的高通量测序数据的积累，从基因组到代谢组不同水平的分子表征逐渐清晰，通过综合分析可实现利用分子特征对HPV相关宫颈癌进行精确分类。

最近，癌症基因组研究中心对228例宫颈浸润癌样本进行了一项多组学分析，研究结合全基因组测序、全外显子组测序、转录组测序、MicroRNA-测序、DNA甲基化分析和反相蛋白阵列等多种数据对宫颈癌进行了分子分型，定义了三个不同分子特征的类型——低分子量角蛋白鳞状细胞癌、高分子量角蛋白鳞状细胞癌和腺癌 ^{[ 15]} 。

随着宫颈癌和癌前病变的基因组、表观基因组及转录组等数据的积累，对于HPV感染相关宫颈癌的分子分型以及疾病各阶段的分子标志物的精准策略已经基本建立。

巴氏细胞学检查作为标准的宫颈癌筛查策略已经长达半个多世纪。随着高危型HPV在宫颈癌发生中的作用受到重视，HPV和巴氏涂片联合检测以及HPV基因分型等方法被逐渐引入宫颈癌筛查体系( 图 1)。2015年，美国食品药品监督管理局第一次批准了HPV检测可作为宫颈癌筛查的首要检测手段。

迄今，至少有193种HPV检测方法可用于检测子宫颈组织中的HPV ^{[ 16]} 。然而，在这些测试中仅有69种(35.7%)曾进行临床评估 ^{[ 16]} 。Hybrid Capture 2(HC2)HPV DNA试剂对于CINⅡ以上病变的敏感度为84.9%~100%，特异度为69.5%~ 95.8% ^{[ 17]} 。Cobas 4800 HPV试剂的敏感度与HC2试剂相当，但具有更高的特异度，可降低HPV检测的交叉反应 ^{[ 18]} 。然而，由于HPV在整合时会丢失上述检测方法所依赖的L1基因，因此这些检测方法不可避免地存在假阴性结果。更为重要的是，这些方法无法检测HPV的整合情况。新兴的第二代测序技术有可能克服这些限制。然而，基于第二代测序的HPV检测技术并不完善。首先，由于基于第二代测序的HPV检测具有高度敏感性，因此必须谨慎解读测序结果，现有的软件仍要求临床操作人员具备生物信息学知识并依赖基于PCR的Sanger测序验证其分析的准确性。其次，检测成本和时间周期是限制第二代测序技术的主要问题。因此，基于第二代测序的HPV检测方法在宫颈癌常规诊断中的实施迫切需要实现文库制备及测序方案的全自动化和标准化。

由于客观性和可靠性优势，宫颈癌的新型筛查策略主要集中在分子检测上 ^{[ 19]} 。但是，这些检测方法都不能预测HPV持续感染并进展为宫颈癌的潜在人群，HPV感染的最终结局与宿主易感性、环境因素和行为模式等相关。有研究利用多元回归分析和人工智能学习算法实现了宫颈癌预测的高敏感性和特异性 ^{[ 20]} 。因此，利用大规模试验、动态生物信息学算法和综合信息处理建立HPV持续感染和宫颈癌发生的个性化风险预测模型值得进一步研究。

对于被诊断为浸润性、晚期或复发性宫颈癌的患者，传统治疗提供的选择有限，部分患者的预后并未得到改善。其中，免疫逃逸在HPV致癌的进展过程中发挥的作用不可小觑。肿瘤精准免疫治疗靶点的发现为宫颈癌患者带来了生存机会。

目前正在进行或完成临床试验的免疫疗法包括治疗性疫苗(NCT02164461、NCT02291055、NCT01304524、NCT02172911、NCT02128126、NCT00988559和NCT0078164)，靶向抗体(NCT01778439、NCT00803062和NCT01281852)，T细胞免疫检查点抑制剂(NCT01711515、NCT01693783、NCT0147121、NCT01714739、NCT02205333和NCT01693562)和获得性T细胞移植(ACT、NCT01585428)。

随着新的免疫治疗靶点和相关临床试验的不断发现和发展，希望免疫治疗能够改善晚期宫颈癌患者的生存和预后。

近年来，人工改造的基因编辑技术如锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、TAL效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和RNA引导的工程核酸酶(RGEN或CRISPR/Cas9)可用于切割HPV特定DNA序列 ^{[ 19]} 。通常，由这些核酸酶导致的双链DNA断裂会通过DNA修复(大多数情况下为NHEJ修复途径)导致HPV癌基因的破坏和HPV感染的清除( 图 2)。

在靶向HPV基因编辑工具开发的早期阶段，ZFN靶向HPV16/18型的E6或E7基因可破坏细胞系和体外培养模型中的HPV基因组，具有较高的切割和清除HPV的效率 ^{[ 21]} 。但是，ZFN的设计具有物种依赖性且模式尚不完全清楚，其构建也非常耗时耗力并且不同实验室的复制成功率较低 ^{[ 22]} 。

TALEN也可作为HPV相关宫颈病变的治疗策略。通过阴道给药将靶向HPV E7的TALEN直接局部用于K14-HPV16转基因小鼠的癌变子宫颈组织，可清除HPV感染并逆转宫颈癌变 ^{[ 23]} 。TALEN的一个潜在优势是更长的DNA结合序列比CRISPR和ZFN具有更高的特异性，但是，这也使其合成成本高并难以包入载体中进行递送，限制了其进一步的应用。

随着CRISPR/Cas系统的出现，这种技术也可用于靶向HPV的E6/E7癌基因。CRISPR/Cas系统的抗病毒效力已经在许多体外细胞培养模型以及HPV阳性肿瘤异种移植瘤中得到证实 ^{[ 24- 25]} 。同时，CRISPR相对较短的识别序列(大约20个核苷酸)使得CRISPR/Cas9系统更容易在人类基因组中产生不必要的脱靶 ^{[ 25]} ，从而限制了其进一步应用。然而，研究表明，CRISPR系统的特异性可通过成对Cas蛋白或高保真版本Cas蛋白得到改善 ^{[ 26]} 。

基于基因编辑的抗病毒治疗将来可能会在HPV相关宫颈癌变过程中发挥重要作用。如果这种治疗方法与HPV检测适当结合，HPV相关宫颈病变的患者将可以通过HPV检测确定HPV感染亚型，然后选择相应的基因编辑工具来进行治疗。相比潜在的过度治疗，包括重复筛查、阴道镜活检和冷刀锥切术，这种新的“即刻治疗”将对患者更有益。

随着新的癌症干预概念和技术的运用，宫颈癌的精确预防、诊断和治疗逐渐成为可能。澄清HPV持续感染和导致宫颈癌的分子生物学机制将有助于我们在早期阶段预测HPV感染者的结局。同时，基于HPV整合和病毒基因型的分子分型策略将促进宫颈癌精准防治的发展，临床医生能够将更多的医疗资源集中于高危患者，大大减少宫颈癌筛查和HPV疫苗接种给患者带来的心理压力和经济负担。

Funding Statement

艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项（2018ZX10301402）；国家自然科学基金（81761148025，81630060）