低盐饮食对犬类心脏组织基因表达的影响

Abstract

目的

探讨低盐饮食对哺乳动物心脏组织基因表达谱的影响，并分析差异表达基因可能涉及的分子生物学功能。

方法

从基因芯片公共数据库（GEO）中获取低盐饮食心脏组织基因芯片数据（GSE17149），将数据导入Qlucore Omics Explorer 3.1、STRING 10.0、Genclip 2.0、GCBI等分析软件，筛选低盐饮食组与正常饮食组实验动物心脏组织差异表达基因，并分析差异表达基因编码蛋白质相互作用网络等，筛选两组之间的关键节点基因。

结果

与正常饮食组比较，低盐饮食组犬心脏组织基因表达谱发生改变，在43 035个基因中共有1343个（3.12%）差异表达基因；差异表达基因蛋白质相互作用网络分析发现1个最明显的蛋白质互相作用网络，以NF-κB抑制因子-α（NFKBIA）蛋白为核心，主要发挥减弱巨噬细胞源性泡沫细胞分化、促进胆固醇排出和分解等生物学功能。

结论

低盐饮食动物心脏组织基因转录谱发生明显改变，低盐饮食可能通过上调 NFKBIA基因的表达来降低心血管疾病的风险。

长期以来，高盐饮食被认为是高血压的危险因素。数千年前的中华医药典籍《黄帝内经》记载：“是故多食咸，则脉凝泣而变色”。研究结果表明：高血压患者每日摄盐量超过6 g会增加心脏病发作、卒中和死亡的风险 ^{[ 1]} 。然而，近年来越来越多的研究发现：长期低盐饮食也是不合理的。最新研究结果显示：无论参与者是否患有高血压，相比每日摄盐量在正常范围内的受试者而言，摄盐量低于正常(3 g/d)的人群出现心脏病、中风和死亡的风险增高，低盐饮食还可促进动脉粥样硬化的形成 ^{[ 1- 2]} 。食盐对于维持机体生理功能具有不可替代的作用，同时也是人们日常饮食中不可或缺的调味剂。深入研究食盐摄入量与心血管事件的关系及作用机制具有重要意义。本研究采用生物信息学方法，对美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)基因芯片公共数据库收录的一组低盐饮食和正常饮食喂养犬的心脏组织的基因芯片数据进行深入挖掘和分析，探讨低盐饮食对哺乳动物心脏组织基因转录谱的影响及其分子生物学功能，为探讨食盐影响心血管疾病发生的机制提供参考。

以“low salt diet”和“heart”为检索词检索NCBI的基因芯片公共数据库，获得 Suematsu等于2009年12月22日提交的GSE17149(ID：200017149)基因芯片数据(共43 035个基因的表达数据)。该数据集采用Affymetrix公司人类The GeneChip ^® Canine Genome 2.0 Array基因表达芯片平台GPL3738检测获得。基因芯片数据来自于两组雄性混血实验动物犬(25~28 kg)的心脏组织RNA(正常饮食组3只，低盐饮食组4只)。低盐饮食组的干预措施为：0.05%氯化钠溶液注射两周；正常饮食组接受正常饮食，之后TRIzol法提取心脏组织的RNA标本送检。

利用QOE3.1软件分析数据集GSE17149，按照均数=0、标准差=1对原始数据进行标准化处理后行两独立样本 t检验，筛选出低盐饮食组和正常饮食组差异表达的基因[差异表达倍数值(fold change，FC)≥2, P＜0.01, q＜0.05]，然后行主成分分析和分层聚类分析。

将差异最明显的20个基因相应的蛋白质名称上传至STRING后，调节可信度和附加节点参数，绘制不同盐摄入情况下差异表达基因的蛋白质相互作用图谱，找出关键基因。

鉴于人类与犬类基因具有96%的相似性，同时无专用于犬类基因组分析数据库，故本研究采用人类基因功能和网络分析软件GenCliP 2.0进行GO功能富集分析。将两组动物心脏组织前20个差异表达的基因(低盐饮食组表达上调、下调各10个)列表上传至软件，并根据需要调节各类分析的主要参数，分析两组差异表达基因的GO功能富集状况。

在蛋白质相互作网络和GO分析的基础上，采用GCBI基因雷达分析关键基因的生物学功能。

各个样本的基因芯片数据箱式图和聚类热图见 图 1，低盐饮食组犬心脏组织转录谱表达下降明显( t=5.998， P＜0.01)，提示低盐饮食可能对哺乳动物心脏组织的基因表达产生一定影响。

QOE软件分析提示，正常饮食组和低盐饮食组有1343个(3.12%)差异表达的基因，聚类热图( 图 2)显示1343个差异表达基因可较好地区别两组动物，其中表达差异最明显的20个基因见 表 1。

表1 两组动物心脏组织前20个差异表达的基因

Table 1 Top 20 differentially expressed genes between control and low-salt groups

序号	基因名称英文缩写	中文	差异表达倍数(logFC)
1	NFKBIA	B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子α	2.29
2	DDO	D-天冬氨酸氧化酶	2.30
3	NR1H2	核受体亚科1，H2	2.32
4	FAM13B	序列相似性家族13，成员B	2.43
5	ATP2B3	质膜钙离子ATP酶3	2.90
6	IFT27	细胞纤毛内转运蛋白27	3.13
7	B3GLCT	β3-葡萄糖基转移酶	3.19
8	TMBIM1	跨膜BAX抑制剂因子基元1	3.24
9	FLNA	丝蛋白Aα	3.42
10	PCSK1N	前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 1型抑制剂	3.53
11	ATG101	自噬相关蛋白101	-8.74
12	LOC483173	组蛋白H2B2-E	-5.72
13	MAP7	微管相关蛋白7	-5.53
14	ZNF850	锌指蛋白850	-5.20
15	cOR9K3	嗅觉受体基因第9家庭K样家庭成员3	-4.90
16	CCDC79	卷曲状结构域蛋白79	-4.71
17	KAT8	K(赖氨酸)乙酰转移酶8	-4.68
18	KIF13B	驱动蛋白家族蛋白13B	-4.54
19	SDCBP2	多配体聚糖结合蛋白2	-4.33
20	CFAP44	纤毛和鞭毛相关蛋白44	-4.26

由两组动物心脏组织基因表达主成分分析图( 图 3)可见，两组动物的基因表达模式具有明显差别，X轴、Y轴、Z轴的数据方差贡献率分别为6%、6%、75%，在Z轴方向上正常饮食组和低盐饮食组表达差异最明显。提示低盐饮食会影响心脏组织转录谱的表达模式。

蛋白质相互作用网络分析可见，拓扑网络中包含1个最典型的子网络，主要与炎症反应的调节及免疫反应有关。其中，NF-κB抑制因子α(NFKBIA)与网络中的其他8个以上的蛋白存在相互作用关系，删除该节点后，网络结构涣散，见 图 4。因此推测NFKBIA是子网络的核心节点。

两组动物心脏组织前20个差异表达基因的GO功能富集状况分析显示，10个基因(50%)( NFKBIA、 TMBIM1、 FLNA、 KIF13B、 MAP7、 IFT27、 DCTN2、 NR1H2、 CCDC79、 SDCBP2)与细胞定位相关；7个基因(35%)( NFKBIA、 TMBIM1、 FLNA、 KIF13B、 MAP7、 IFT27、 DCTN2)与细胞内大分子定位、细胞内蛋白定位相关；2个基因(10%)( NFKBIA、 NR1H2)主要发挥抑制巨噬细胞源性泡沫细胞分化功能、促进胆固醇排出和分解的生物学功能，见 图 5。

采用GCBI基因雷达对 NFKBIA基因的功能进行验证。 NFKBIA基因抑制和激活调控网络见 图 6， NFKBIA基因可抑制 NFKB1、 RELA(P65)基因。

食盐为人体提供了不可或缺的钠离子，它与氯离子、钾离子等在维持酸碱平衡、人体细胞外液量、渗透压、肌肉和神经中的电生理活性中扮演着重要角色。一直以来，高盐饮食被认为是引起高血压的独立危险因素 ^{[ 3- 4]} ，所以低盐饮食一直作为健康饮食被广泛推崇。然而，近年来有研究认为，过度低盐饮食对血脂有一定的影响，可导致血管紧张素Ⅱ、三酰甘油、胆固醇、醛固酮、皮质醇等水平明显升高 ^{[ 5- 6]} ，从而增加发生心血管事件的风险。因此，低盐饮食和高盐饮食对心血管事件的影响及作用机制成为该领域的研究热点，亟待进行广泛探索和深入研究。

本研究利用基因组学分析技术对低盐饮食干预的实验动物犬的心脏组织基因芯片检测数据进行了挖掘和分析。基因表达谱提示：低盐饮食可明显改变犬心脏组织基因表达谱，共有1343个差异表达基因。前20个差异表达基因的蛋白质相互作用网络可见1个明显的蛋白质相互作用网络，以 NFKBIA基因为核心。 NFKBIA基因编码IKBα。静息状态下，IKBα通过与P65结合，使细胞质中的NF-κB处于失活状态，当受到脂多糖、活性氧等刺激时，IKBα发生磷酸化并降解，随即与P65解离，P65获得自由后进入细胞核，参与调节体内炎症反应过程。以往的研究结果显示： NFKBIA基因与多种慢性炎症相关性疾病有关，可以抑制炎性细胞因子的激活，并促进机体免疫应答。在心肌梗死患者中，CRP和可溶性细胞间黏附分子1的浓度及人类巨细胞病毒的感染率均明显高于正常人群，提示炎症反应是冠心病发生的独立危险因素 ^{[ 7]} 。感染因子通过诱导IL、TNF、黏附分子等的表达和释放，激活补体等免疫过程，导致细胞内皮损伤，引起动脉粥样硬化的发生。Gurfinkel等 ^{[ 8]} 通过随机临床试验研究也进一步证实炎症反应是心脏疾病发生的重要危险因素。本研究发现低盐饮食可明显上调心脏组织 NFKBIA基因mRNA水平，结合上述研究结果我们推测低盐饮食对降低心脏组织的炎性反应、提高心脏组织的免疫应答、预防冠心病和动脉粥样硬化具有积极作用。

GO功能富集分析进一步发现 NFKBIA、 NR1H2基因可以发挥减弱巨噬细胞源性泡沫细胞分化、促进胆固醇排出和分解的生物学功能。巨噬细胞源性泡沫细胞系吞噬了脂质的巨噬细胞，其细胞质中含有大量的脂滴，其在动脉粥样硬化的发生和发展中起着关键性作用。研究表明，泡沫细胞可以通过诱导升高IL-6、IL-8的表达水平而促发炎症反应，进而导致动脉粥样硬化发生 ^{[ 9- 10]} 。岳兵等 ^{[ 11]} 发现血管紧张素Ⅱ通过激活NF-κB信号途径，阻遏人单核细胞白细胞(THP-1)源性泡沫细胞中ATP结合盒转运子A1基因和蛋白表达，进而影响泡沫细胞内胆固醇的流出和分解。低盐饮食组心脏组织的 NFKBIA基因mRNA水平均明显升高进一步表明了低盐饮食通过上调 NFKBIA基因mRNA水平，从而激活了MAPK、PI3K-Akt、NF-κB等信号通路，机体的抗凋亡、抗炎、抗氧化应激等能力增强，进而减小了心血管事件的发生危险。

综上所述，合理低盐饮食可通过影响哺乳动物心脏组织的基因转录谱来降低心血管事件的风险，但长期低盐可能导致钠摄入不足。本研究为食盐摄入量与心血管事件的关系及作用机制提供了一定参考依据，但今后仍需开展功能验证实验深入探讨食盐摄入量对心血管事件的影响机制，为防治心血管疾病提供可靠实验依据。