Abstract
目的
探讨细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制剂SNS-032诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的效应及可能的机制。
方法
以CDK抑制剂SNS-032作用于HL-60细胞株，实验细胞分为对照组、SNS-032组、白细胞介素（IL）-6组和SNS-032+IL-6组。MTT法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡，microRNA芯片技术分析细胞microRNA的表达谱差异，蛋白质印迹法检测JAK/STAT3相关信号通路蛋白的表达。
结果
SNS-032可降低细胞存活率，诱导HL-60细胞凋亡，对照组、100nmol/L和200nmol/L的SNS-032干预组细胞凋亡率分别为（5.9±1.7）%、（12.1±3.1）%和（59.4±3.6）%。microRNA芯片分析结果显示，SNS-032显著下调HL-60细胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17和miR-378c的表达水平，显著上调miR-320a的表达水平。蛋白质印迹法显示SNS-032可抑制STAT3的磷酸化和JAK2、MCL-1、C-MYC蛋白的表达。作为JAK/STAT3通路的激活剂，IL-6联合SNS-032不能逆转后者对HL-60细胞的杀伤作用（ P＞0.05），也不能逆转SNS-032对JAK2蛋白表达和磷酸化STAT3的抑制作用。
结论
SNS-032能显著诱导人急性髓系白血病HL-60细胞发生凋亡，其机制可能与抑制JAK2和STAT3磷酸化、抑制MCL-1和C-MYC及与之相关的miR-17-92基因簇表达水平有关。
Abstract
Objective
To investigate the effects of cycle-dependent kinase (CDK) inhibitor SNS-032 on apoptosis in human acute myeloid leukemia (AML) HL-60 cells and its molecular mechanisms.
Methods
Cultured AML HL-60 cells were treated with various concentrations of SNS-032. Cell apoptosis was determined with flow cytometry; cell viability was measured by MTT assay; the profiles of microRNA expression of HL-60 cells were analyzed by microRNA microarray; the protein expressions of JAK2/STAT3 pathway were detected by Western blotting.
Results
Apoptosis of AML HL-60 cells was induced by SNS-032; the rate of apoptosis was (5.9±1.7)%, (12.1±3.1)% and (59.4±3.6)% when HL-60 cells were treated with 0, 100 and 200 nmol/L SNS-032. MicroRNA microarray analysis revealed that the levels of miR-30a, miR-183, miR-20b, miR-26b, miR-20a, miR-589, miR-107, miR-181a, miR-106a, miR-17 and miR-378c were down-regulated by SNS-032, whereas the levels of miR-320a and miR-H7* were up-regulated. Western blotting showed that SNS-032 strongly inhibited phosphorylation of STAT3 and protein expression of JAK2, C-MYC and MCL-1.
Conclusion
CDK inhibitor SNS-032 can induce apoptosis of AML HL-60 cells, which is associated with the inhibition of MCL-1, C-MYC and JAK2/STAT3, and down-regulation of miR-17-92 family.
Keywords: Leukemia, myeloid, acute; MicroRNAs; Cyclin-dependent kinases/ biosynthesis; Janus kinases; STAT3 transcription factor; Protein-tyrosine kinases/metabolism; Signal transduction; HL-60 cells; Apoptosis; Tumor cells, cultured
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人急性白血病最常见的一种类型，在分子生物学特点、临床治疗反应等方面具有明显的异质性。联合化疗、造血干细胞移植和支持治疗等手段极大改善了AML患者的预后，但仍存在治疗相关毒副作用大、治疗效果不理想和复发率高等诸多问题，促使研究者致力于探索更具靶向性的治疗方法。
细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，按其功能主要分成两大类：调控细胞周期的CDK和调控RNA转录的CDK，后者包括CDK7和CDK9，这两者参与调控RNA聚合酶Ⅱ羧基末端结构域磷酸化，而RNA聚合酶Ⅱ则是参与调节microRNA(miR)基因转录的主要因子 [ 1, 2, 3, 4] 。近年来研究发现，抑制CDK不仅抑制肿瘤细胞增殖，还能诱导细胞凋亡。Walsby等 [ 5] 报道选择性CDK抑制剂SNS-032对AML细胞有明显杀伤作用，但其机制仍不明确。本研究通过流式细胞术、microRNA芯片技术、蛋白质印迹法等观察SNS-032对人AML HL-60细胞凋亡的作用、microRNA表达谱的改变和Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3) 通路的影响，并用JAK2/STAT3通路激活剂白细胞介素6(IL-6) 进行干预，进一步对可能的分子机制进行初步探讨。
人AML细胞株HL-60由浙江大学血液病研究所保存。10%胎牛血清和RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；SNS-032购自美国Selleck化学有限公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；miRNeasyMini Kit购自美国QIAGEN公司；β-Actin单克隆抗体购自美国Sigma公司。JAK2、磷酸化STAT3(p-STAT3)、STAT3、C-MYC和MCL-1单克隆抗体购于美国Cell Signaling公司；ECL Western-blotting luminal试剂盒购于以色列Biological Industries公司；BCA蛋白定量试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司；辣根标记山羊抗兔IgG(H+L)和辣根标记山羊抗鼠IgG(H+L)购于杭州联科生物有限公司；显影粉、定影粉购自中美华东医药股份有限公司。
HL-60细胞悬浮生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，2~3天换液传代一次。取对数生长期的细胞为实验对象。实验细胞分为对照组、终浓度为100 nmol/L的SNS-032组、终浓度为20 ng/mL的IL-6组和上述浓度的SNS-032+IL-6联合组。
HL-60细胞以2×10 5/mL接种于24孔板，分别加入不同浓度的SNS-032(0、100 nmol/L和200 nmol/L)孵育24h后收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，4℃ 300× g离心7min，弃上清液。将细胞重悬于1mL 1×结合缓冲液，取100 μL细胞置于试管中，加5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙碇(PI)，轻轻混匀，室温避光反应15min，加入300μL 1×结合缓冲液，立即用流式细胞仪检测，Cellquest 1.2软件分析结果。
取对数生长期细胞，新鲜培养液洗涤后，重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，以2~5×10 5个细胞/mL的终浓度接种于96孔板，分别加入1.2所述浓度的SNS-032、IL-6、或联合加入SNS-032和IL-6，对照组用无血清RPMI 1640，每孔总体系0.2mL，处理24h，加MTT工作液20 μL/孔(终浓度0.5mg/mL)，置37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育4h，300 × g离心，小心吸弃上清液，加入二甲亚砜0.2mL/孔，吹打，使紫蓝色甲臜沉淀充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。实验重复3次，每次设复孔3个，取平均值为最终结果。
按照Trizol试剂盒和miRNeasy试剂盒说明书，分别提取各组HL-60细胞的总RNA。利用Nanodrop于波长为230nm、260nm与280nm处测定上述RNA吸光度值，对总RNA进行定量测定，通过计算260nm和280nm处的吸光度比值以及甲醛变性凝胶电泳，分析RNA质量，用于microRNA芯片检测。芯片实验和分析委托上海康成生物工程有限公司完成。采用丹麦Exiqon公司第六代microRNA芯片检测microRNA表达谱。各组实验均重复3次。与对照组相比，SNS-032作用后microRNA表达上调1.2倍或下调超过20%为差异表达。
收集药物处理后HL-60细胞5×10 6个，离心，弃上清液，用预冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，加细胞裂解液120-160μL，反复吹打，置冰上，用超声波细胞粉碎机处理(160w，持续3s，间隔5s，共3次)，至溶液不再黏稠，4℃ 700× g离心10 min，取上清液，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白质浓度后备用。制胶后，每孔加入30μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后按半干法将电泳产物转印到PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2h，加一抗(1:1000稀释)，4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10min，加二抗(1:5000稀释)，室温孵育2h，TBST洗膜10min×3次后，加ECL试剂在室温反应1 min后，曝光到X线胶片上，在暗室中一次性完成显影、定影。
采用Prism 4软件进行统计。计量资料以均数±标准差( x ± s)表示。两两比较采用Dunnett- t检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。
流式细胞术检测结果显示，加入SNS-032干预后HL-60细胞凋亡率增加。对照组、100nmol/L和200nmol/L SNS-032干预组细胞凋亡率分别为(5.9±1.7)%、(12.1±3.1)%和(59.4±3.6)%。
100 nmol SNS-032作用HL-60细胞24 h后，HL-60细胞存活率明显下降( P＜0.05)；联合IL-6后不能逆转SNS-032对细胞存活率的抑制作用( P＞0.05)。见 图 1。
microRNA芯片分析结果显示：SNS-032下调HL-60细胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17和miR-378c的表达，上调miR-320a和miR-H7 *的表达。
miR-20a和miR-17属于miR-17-92基因簇，而miR-17-92与JAK2/STAT3调控密切相关。从上述结果可知，SNS-032下调miR-20a和miR-17的表达，进一步采用蛋白质印迹法检测，结果SNS-032显著抑制JAK2蛋白的表达和其下游STAT3的磷酸化水平，IL-6并不能逆转SNS-032对HL-60细胞JAK2和磷酸化STAT3的抑制作用；同时，SNS-032对MCL-1和C-MYC蛋白也有抑制作用，见 图 2。
SNS-032是一种新型选择性CDK抑制剂，能抑制调控RNA转录的CDK，包括CDK7和CDK9的活性。2011年，Walsby等 [ 5] 报道SNS-032能有效诱导HL-60、NB4细胞株及原代AML细胞凋亡，其机制是下调CDK2、CDK7和CDK9，进而抑制RNA聚合酶Ⅱ羧基末端结构域第二位和第五位丝氨酸磷酸化，导致Caspase-3激活和细胞凋亡。我们的实验结果证实了SNS-032显著诱导HL-60细胞凋亡。由于CDK7和CDK9参与调节microRNA基因的转录 [ 6, 7] ，因此，我们研究了SNS-032干预HL-60细胞后microRNA表达谱的变化。结果表明，SNS-032显著下调HL-60细胞的11种microRNA，其中miR-20a和miR-17等与AML密切相关，而miR-20a和miR-17属于miR-17-92基因簇，该基因簇位于染色体13q31区，含有6个microRNA(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92)。近年来研究表明miR-17-92是肿瘤治疗的新靶点，在混合型白血病基因重排中高表达 [ 8, 9] ，文献报道其高表达的原因有：① 基因扩增；② MYC和/或STAT3介导其转录增加 [ 10, 11] 。基于上述理由，我们研究了SNS-032调控miR-17-92的可能机制。本研究结果显示，SNS-032作用于HL-60细胞株后抑制JAK2蛋白表达和下游STAT3的磷酸化，还抑制MCL-1和C-MYC蛋白的表达。
IL-6在JAK/STAT3通路的激活中起着非常重要的作用 [ 12] 。本实验结果还发现，IL-6不能逆转SNS-032对HL-60细胞的杀伤，也不能逆转其对JAK2蛋白和磷酸化STAT3的抑制作用。Walsby等 [ 5] 分析了SNS-032对87例AML患者原代白血病细胞的抑制作用，发现SNS-032的杀伤效应不受FAB分型、既往治疗、FLT3突变状态和核仁磷酸蛋白1(NPM1) 突变状态的影响。这些结果提示SNS-032能克服AML的高危因素。
综上所述，SNS-032作为一种新型选择性CDK抑制剂能显著诱导HL-60细胞凋亡，其机制可能与抑制JAK2和STAT3磷酸化、抑制MCL-1和C-MYC及与之相关的miR-17-92基因簇表达水平有关，但其具体机制还有待于进一步深入的研究。
Funding Statement
高等学校博士学科点专项科研基金（20120101110010）；浙江省科技厅项目（2011C23014）；浙江省医药卫生科技计划（2013KYA083）；浙江省中医药管理局科技计划（2013ZA074）
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