自噬与肿瘤关系研究新进展

Abstract

自噬是一种高度保守的细胞代谢过程，细胞中的蛋白质和细胞器被包裹在自噬体中并运送到溶酶体降解。已发现自噬与神经退行性疾病、肿瘤等多种疾病关系密切，尤其是与肿瘤的关系研究备受关注。自噬在肿瘤的发生、发展中有“双刃剑”作用，即自噬抑制肿瘤的发生但在肿瘤形成后会促进肿瘤发展。肿瘤化疗或放疗过程中会诱导自噬的发生，且一般认为是保护作用。自噬是肿瘤治疗的潜在重要靶标，但由于自噬在肿瘤中的很多作用并未明确，欲通过调控自噬来提高肿瘤疗效尚待更多研究。

自噬(autophagy)是一种自我消化现象，由Christian de Duve在1963年的溶酶体国际会议首次提出，这一现象从酵母到人类都十分保守。自噬过程中，细胞质中的蛋白质、细胞器和其他大分子等被称为自噬体或自噬小泡的双层膜囊泡包裹并运送到溶酶体降解。自噬不仅能够清除细胞内废物，还参与细胞的生长分化，在饥饿条件下为细胞提供生命活动所需的能量和原料。已有很多研究表明自噬在多种人类疾病如神经退行性疾病、感染及肿瘤等疾病中发挥保护作用 ^{[ 1]} ，其中，自噬与肿瘤的关系备受关注。根据底物进入溶酶体途径的不同可将自噬分为三类：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。巨自噬是最常见的自噬，来源于内质网、高尔基体的双层膜结构延伸形成自噬小体，自噬小体包裹受损细胞器或蛋白质，与溶酶体融合后将内容物降解。微自噬是指溶酶体膜直接内陷包裹胞内物质进行降解。分子伴侣介导的自噬降解含有特定序列——KFERQ序列(赖氨酸—苯丙氨酸—谷氨酸—精氨酸—谷氨酰胺)的蛋白 ^{[ 2]} 。其中巨自噬的功能及机制研究得最为清楚，本文以下提到的自噬都指巨自噬。

多种因素可以诱导细胞自噬的发生，包括饥饿、缺氧等，与细胞存活和死亡密切相关。自噬是一个动态的过程，分为起始、延伸、成熟、降解四个阶段。(1) 起始：来自内质网、高尔基体的双层膜结构将胞质中错误蛋白、受损细胞器等胞质成分包被，形成杯状分隔膜；(2) 延伸：分隔膜不断延伸，将被降解物完全包被形成自噬体；(3) 成熟：自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；(4) 降解：溶酶体酶将包裹的物质降解，自噬体膜循环再利用 ^{[ 3]} 。

自噬的整个过程受基因严格调控。目前已发现34种自噬相关基因(autophagy associated gene，ATG)及相应蛋白，它们在自噬中发挥不同的作用(见 表 1)。其中主要调控蛋白可分为3个复合体、两个连接系统：第一个是ATG1/ULK1激酶复合体(ULK1-mATG13-FIP200-ATG101)，该复合体的形成及活化启动自噬的发生；第二个是Ⅲ型PI3激酶复合体(VPS34-VPS15-Beclin1)，在吞噬泡的形成中发挥作用；第三个是ATG9复合体，它是惟一的跨膜蛋白，促进磷酸的转运。两个连接系统分别是ATG5-ATG12-ATG16复合体连接系统和ATG8/LC3连接系统：ATG5-ATG12-ATG16复合体的功能是促进自噬泡膜的延伸；ATG8/LC3连接系统中LC3被磷脂酰乙醇胺修饰后转变为LC3 Ⅱ，参与自噬体的形成 ^{[ 4]} 。这些自噬相关蛋白共同参与完成自噬过程。

表1 自噬相关基因及功能一览

Table 1 Autophagy associated gene and its function

酵母基因	人类同源基因	功能
Atg1	ULK1	丝/苏氨酸激酶，在隔离膜形成期间与ATG13和ATG17形成复合体
Atg2		与外周膜蛋白一同参与自噬体形成
Atg3	ATG3	介导LC3的修饰、ATG5与ATG2的结合
Atg4	ATG4/augophagins	剪切LC3碳端，暴露甘氨酸，协助LC3修饰
Atg5	ATG5	与ATG12形成复合体
Atg6	Beclin1	肿瘤抑制基因，与Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶形成复合体
Atg7	ATG7	介导ATG5与ATG12结合及LC3的修饰
Atg8	MAP/LC3	保守蛋白，通过羧基端结合磷脂酰乙醇胺，该复合物参与组成自噬体
Atg9		跨膜蛋白，参与自噬体形成
Atg10	ATG10	介导ATG5与ATG12结合，促进LC3修饰
Atg12	ATG12	与ATG5形成复合体
Atg16	ATG16L	连接ATG5-ATG12复合体形成多聚体

正常情况下，细胞具有低水平的基础自噬；压力条件下，自噬发挥控制细胞质量、组织稳态产生能量等作用。在不同压力环境下，自噬水平受到不同信号转导通路的严格调控，其中营养不足是诱导自噬的典型因素。营养缺乏导致自噬主要依赖哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路的调控，特别是mTORC1(mTOR complex 1) 这一营养感受器 ^{[ 5]} 。营养充分时，活化的mTOR与ULK1-ATG13-FIP200-ATG101复合体结合，ULK1的757位丝氨酸发生磷酸化，破坏ULK1和AMPK的相互作用，抑制ULK1的活性，抑制自噬体的形成。当营养匮乏时，mTOR失活，与ULK1-ATG13复合体分离，使ULK1和ATG13去磷酸化，ULK1-ATG13复合体活化，促进自噬启动 ^{[ 6]} 。能量变化(ATP与AMP比例)也能通过mTOR通路调节自噬。能量压力下，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被激活，活化的AMPK通过抑制mTORC1活性并直接磷酸化ULK1 317和777位的丝氨酸促进自噬的发生 ^{[ 7]} 。可见，ULK1是自噬调控信号通路的重要分子，且不同位点的磷酸化在自噬中发挥不同的作用。另一个重要的自噬调控因子是Beclin1/VPS34复合体。当 AMBRA(activating molecule in Beclin1 regulated autophagy)和 ATG14L或紫外线抵抗相关基因(ultraviolet irradiation resistance-associated gene， UVRAG)结合到复合体上，自噬激活。而当 Rubicon与 UVRAG结合到复合体上，自噬抑制。作为转录因子的胞核p53也与自噬发生相关。多个靶基因能刺激自噬发生，包括 AMPK β1和 β2亚基、结节性硬化症基因2(tuberous sclerosis complex 2， TSC2)、死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase 1， DAPK-1) 及部分 Bcl-2家族成员 ^{[ 8]} 。与胞核p53诱导自噬相比，胞质p53则表现出抑制自噬的特性。除了营养和能量，还有很多诱导自噬的因素，例如肿瘤的化疗或放疗、活性氧、内质网应激等，但是不同诱因引起的自噬的机制尚未完全明了。

在诱导因素下，自噬很快发生且其过程经历的时间相对较短(半衰期为8 min)。自噬是对外源性刺激(包括营养缺乏、细胞密度负荷、低氧、氧化应激、感染等)的适应性反应，能降解老化的细胞器和蛋白质产生氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等，为细胞存活提供物质和能量 ^{[ 9]} 。自噬作为细胞保持稳定状态的管家机制，可调控长寿命蛋白、过氧化物酶体、线粒体和内质网的更新；自噬参与一定的组织特异性融合；自噬既可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器、代谢产物，进行亚细胞水平上的重构，保护受损的细胞，同时它也可以作为一种细胞死亡程序，诱导细胞主动性死亡。因此，自噬是细胞对于环境变化的有效反应，对新陈代谢起着举足轻重的作用。

另外，自噬在免疫系统中扮演重要的角色。在淋巴结中，自噬调节免疫细胞的生存、增殖和平衡；在骨髓中，自噬是B细胞在分化过程中必需的；而在胸腺中，自噬调节特定CD4 ⁺T细胞的选择。自噬包裹入侵的病原微生物并介导其清除。在固有免疫中，自噬作用于模式识别受体的下游，促进一系列效应应答包括细胞因子的产生和吞噬作用；在适应性免疫中，自噬调控主要组织相容性复合物Ⅱ类分子的抗原提呈细胞及CD4 ⁺T细胞的活化 ^{[ 10]} 。

自噬在免疫系统和免疫功能中发挥重要作用，自噬缺陷与很多疾病有关，如在神经退行性疾病、代谢综合征患者中发现有自噬缺陷。自噬与肿瘤的关系近来一直颇受关注 ^{[ 11]} 。一般认为，自噬在肿瘤中发挥“双刃剑”的作用，即自噬既能抑制肿瘤的发生又会促进肿瘤发展，这依赖于肿瘤类型及肿瘤发展阶段。营养/能量耗竭、细胞损伤、应激诱导的自噬在癌症发展和癌症治疗中都有重要作用。研究发现，自噬相关基因 Beclin1缺失增强卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌的易感性。其他相关基因如 UVRAG、 ATG4和 LC3缺失同样会促进肿瘤形成 ^{[ 12]} ，自噬也可通过降解某些通路中的信号蛋白抑制肿瘤 ^{[ 13]} 。

自噬的调控机制与肿瘤的发生调控途径具有一定的重叠。肿瘤抑制基因包括mTOR信号上游抑制基因( PTEN、 TSC1和 TSC2)会诱导自噬；相反地，mTOR活化致癌基因产物如Ⅰ型 PI3K、 AKT基因关闭自噬。细胞原癌基因 Bcl-2和 Bcl-XL在人的癌细胞中过表达，并通过与Beclin-1结合抑制自噬 ^{[ 14]} 。营养缺乏或DNA损伤导致的肿瘤抑制基因 p53活化而激活自噬 ^{[ 15]} 。但是也有研究发现 p53能抑制本底水平的自噬 ^{[ 16]} ，这一抑制作用依赖的是细胞质中的 p53而不是细胞核中的 p53。

Beclin1是重要的自噬调控分子，是酵母菌ATG6的同源蛋白。多数乳腺癌和卵巢癌患者 Beclin1基因单拷贝缺失，因此自噬可能是肿瘤起始的制约因素。这一假设在 Beclin1敲除小鼠模型上得到了验证，杂合子小鼠更容易患各种肿瘤，即使它们还有一定的自噬能力。条件性敲除 Atg5和 Atg7的小鼠相对正常小鼠更易患肝癌。另外，抑制自噬导致p62过表达。p62能通过引起核因子κB失调、活性氧积累和DNA损伤增加等众多机制促进肿瘤发生 ^{[ 17]} 。另外，自噬缺失造成基因组不稳定也有利于肿瘤发生。

自噬的肿瘤抑制作用还可能与自噬对衰老的影响有关。Young研究小组 ^{[ 18]} 发现，在成纤维细胞中，如癌基因 Ras突变，可抑制自噬且延缓衰老。而衰老可阻挡肿瘤细胞的恶化，自噬缺失后细胞逃脱衰老发展为癌变细胞。

在肿瘤发生初期，自噬发挥肿瘤抑制作用；而在已形成的肿瘤中，自噬起相反作用。大量研究发现，在低氧、营养匮乏的恶劣微环境中，自噬促进肿瘤细胞存活。然而自噬对肿瘤细胞的保护作用不仅仅只发生在低氧、少营养情况下，Amaravadi等 ^{[ 19]} 研究表明，在小鼠淋巴瘤模型中，p53的积累或化疗均可诱导自噬发生。通过氯喹或 ATG基因干扰抑制自噬，可促进细胞死亡。因此，自噬是肿瘤治疗的重要靶点。

自噬研究受热捧的另一个重要原因是自噬在免疫应答中发挥关键作用。它不仅影响抗原供体细胞的细胞因子和危险信号的释放能力，还与胸腺及淋巴细胞的增殖、存活、活化密切相关 ^{[ 20]} 。众所周知，免疫系统在肿瘤的发展、恶化中发挥重要的调控作用，所以欲研究肿瘤与自噬的关系，必须同时考虑自噬对免疫系统的影响。研究发现在脂多糖刺激的巨噬细胞中，pellino E3泛素连接酶家族成员(pellino E3 ubiquitin protein ligase family member 3，PELI3) 被自噬降解，抑制促炎症因子白细胞介素1β的表达，从而抑制炎症进一步发展 ^{[ 21]} 。在 Atg7基因缺失的小鼠中，流感病毒和巨细胞病毒感染后不能正常形成记忆性CD8 ⁺T细胞，在高龄小鼠中用亚精胺可以恢复CD8 ⁺T细胞应答，这一方式是自噬依赖的 ^{[ 22]} 。

以靶向于表皮生长因子的毒素治疗肿瘤，前者诱导的自噬应答能促进高迁移率蛋白1(High mobility group box-1，HMGB1) 释放至胞外，HMGB1与树突细胞上的Toll样受体结合可将其激活从而增强T细胞的抗肿瘤应答 ^{[ 23]} 。

在肿瘤微环境中，激活自噬能克服不良因素，使细胞维持高水平的生长速度。如自噬能够降解氧化蛋白或损伤的线粒体，减轻活性氧引起的损伤 ^{[ 24]} 。有报道称即使在营养充足的情况下，肿瘤细胞也能产生较高水平的自噬。Yang等 ^{[ 25]} 的研究结果显示，胰腺癌细胞自主提高了本底自噬水平，且细胞的持续生长有赖于这一自噬。氯喹处理或RNA干扰敲除自噬相关基因抑制自噬，会降低细胞的增殖，且其代谢水平发生明显改变，氧化磷酸化和ATP水平显著降低。这提示自噬可能提供了细胞生长所需的重要中间代谢产物。Guo等 ^{[ 26]} 也发现了相似的结果， Ras激活的肿瘤细胞，其基础自噬增加，致瘤性增强，而相应自噬缺陷的小鼠肿瘤形成能力减弱。此外， Ras突变的不同组织来源的人肿瘤细胞系的生长依赖于自噬。然而，在人卵巢上皮细胞，高水平的 H-Ras导致细胞生长受阻，随后细胞死亡。这是由于癌基因 Ras过表达造成自噬水平提高，自噬促进了细胞死亡 ^{[ 27]} 。可见，自噬对肿瘤细胞生长的作用有一定的特异性。所以，要认清自噬在不同肿瘤类型的不同阶段中发挥的作用。

肿瘤治疗过程中所产生的耐药性及其他副作用一直是肿瘤治疗的一大难题。化疗或放疗是通过诱导肿瘤细胞凋亡、坏死、衰老等死亡方式以达到治疗肿瘤的目的。凋亡是细胞主动结束生命的过程，是维持稳态的基本方式。在移植纤维肉瘤模型中，γ辐射或化疗药物阿霉素能增加细胞凋亡，并减小肿瘤体积 ^{[ 28]} 。衰老是一种不可逆的细胞周期阻滞，同样能够限制细胞增殖。有研究证明，在淋巴瘤小鼠模型中，细胞凋亡途径病变可以导致耐药，但衰老途径发生突变后同样也可以导致耐药 ^{[ 29]} 。这说明衰老对于肿瘤治疗成功十分重要。已有报道很多化疗药物能够诱导肿瘤细胞的衰老。例如，阿霉素处理乳腺癌细胞后，p53活性升高，而端粒酶的活性降低，从而引起细胞衰老 ^{[ 30]} 。Ling等 ^{[ 31]} 的研究表明喜树碱类似物FL118通过促进MDMX的降解诱导p53/p21依赖的衰老，同时还能诱导p53非依赖的细胞凋亡，这两者都有助于抑制结肠癌细胞生长。同样，放疗或化疗能够导致自噬发生，一般认为肿瘤治疗诱导的细胞自噬可以帮助肿瘤细胞抵抗治疗。因此，科学家试图通过抑制自噬增强化疗或放疗的效果。业已证明，化疗药物和辐射能促进肿瘤细胞发生细胞保护形式的自噬 ^{[ 32]} 。在肿瘤治疗中，Wang等 ^{[ 33]} 发现化疗诱导的自噬可促进卵巢癌耐药性的产生，通过敲低 ERK抑制自噬后，可减轻卵巢癌对顺铂的耐药性。另外，顺铂处理细胞诱导的自噬，能抵抗顺铂引起的细胞死亡 ^{[ 34, 35]} 。Michaud等 ^{[ 36]} 研究发现化疗诱导的自噬能促进肿瘤细胞释放ATP，刺激抗肿瘤免疫应答。低表达 Atg5或 Atg7的移植小鼠中，化疗引起ATP释放减少，减弱针对化疗的免疫应答。通过药理作用(使用氯喹、3-甲基腺嘌呤等)或基因敲除(如敲除 Beclin1、 Atg5、 Atg7等)抑制自噬会增加肿瘤细胞对化疗或放疗的敏感性，这些结果说明了化疗或放疗诱导的自噬有一定的细胞保护作用。但是自噬也是一种程序性死亡，抑制自噬可能会达到相反的结果。近期，关于神经胶质瘤细胞的研究表明，利用短发卡RNA敲低 Beclin1和 Atg5后，DNA烷化剂替莫唑胺诱导的细胞凋亡明显减少 ^{[ 37]} 。三苯氧胺可诱导乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬，而自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤可使细胞死亡减少。用不同阶段的自噬抑制剂抑制自噬后可能导致不同的结果。在伊马替尼治疗恶性胶质瘤细胞模型中，自噬早期抑制剂3-MA可致细胞死亡减少，而自噬晚期抑制剂巴弗霉素A1却促进了细胞凋亡 ^{[ 38]} 。抑制肿瘤细胞自噬往往也会抑制正常细胞自噬，影响正常细胞的存活。很多神经退行性疾病中常常会出现自噬缺陷，所以肿瘤治疗中抑制自噬可能会对正常组织不利。目前，自噬是促进细胞死亡还是避免细胞死亡仍有很大争议，在不同肿瘤中通过诱导或抑制自噬来提高肿瘤治疗效果还存在很多疑问。

肿瘤治疗过程中诱导的自噬可能会发挥其他功能，但这些功能尚未得到明确证实。已有研究结果提示，电离辐射可以促进人工培养的乳腺癌细胞自噬，但抑制自噬不会改变细胞对辐射的敏感。Bristol等 ^{[ 39]} 的研究进一步表明，在免疫动物模型中，氯喹不会增加小鼠4T1乳腺肿瘤细胞对放疗的敏感性。也就是说某些情况下化疗和放疗诱导的自噬可能对肿瘤细胞没有影响，但这一结果还有待证实。自噬还可能通过各种机制引起细胞杀伤，可称为细胞毒性功能。近来研究表明，辐射联合维生素D或维生素D类似物(EB1089) 处理乳腺癌细胞，可以促进自噬对细胞的杀伤 ^{[ 40, 41]} 。也有其他实验室发现发挥细胞毒性功能的自噬可以杀死细胞本身或者促进凋亡发生 ^{[ 42]} 。自噬的细胞杀伤功能与治疗后活细胞数量减少、克隆形成减少有关。但是抑制发挥该种功能的自噬，并不会改变肿瘤细胞对放、化疗的敏感性。此外，研究还显示，治疗过程中，肿瘤细胞能通过自噬分泌一些激活免疫应答的细胞因子，提高药物的有效性 ^{[ 43, 44]} 。因此，肿瘤治疗中发生的自噬并不完全发挥保护功能。实际上抑制自噬未必能达到预期的治疗效果，并且有可能会减弱免疫反应并降低传统治疗的疗效。

自噬作为一种高度保守的保护机制，与肿瘤的发生、发展有着紧密的关系，在不同阶段、不同情况下会发挥不同的作用。总的来说，自噬抑制早期肿瘤的发生，但在肿瘤形成后会促进肿瘤的发展，对肿瘤的维持和治疗抵抗非常重要。肿瘤治疗会诱导自噬发生，并且在不同肿瘤细胞、不同条件下有不同作用。目前较为公认的观点是：放疗或化疗中诱导的自噬具有保护功能，抑制自噬可提高肿瘤细胞对治疗的敏感性。但是自噬作为一种程序性死亡，抑制自噬后可能会减少细胞死亡，对肿瘤治疗无益。另外，某些情况下肿瘤治疗诱导的自噬不会改变肿瘤细胞对放化疗的敏感性。综合上述，自噬在肿瘤治疗中的作用尚不十分明确，在某些情况下，自噬的功能可能会相互转换，更加大了观测难度。关于肿瘤传统疗法诱导的自噬功能的信息还不足以支持临床试验，所以抑制自噬是否是可行的治疗策略有待进一步探讨。

Funding Statement

国家自然科学基金（31471297）