淫羊藿素通过CXCR4/SDF-1信号通路促进小鼠成骨细胞成熟和矿化

Abstract

Objective

To investigate the effect of icaritin on maturation and mineralization of mouse osteoblast MC3T3-E1 cells and its mechanism.

Methods

The cultured MC3T3-E1 cells were divided into blank control group, CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4) inhibitor (AMD3100) group, icaritin group, and icaritin plus AMD3100 group. The expression of CXCR4, stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) and osteogenesis-related genes and proteins were detected by real-time RT-PCR and Western blotting after drug treatment for 24 h. The alkaline phosphatase (ALP) activity was determined with ALP kit on d3 and d6; calcium nodules were detected by alizarin red staining after drug treatment for 14 d.

Results

Real time RT-PCR showed that compared with the blank control group, relative expressions of CXCR4, SDF-1 and osteogenesis-related genes in icaritin group were significantly increased ( P < 0.05 or P < 0.01); After AMD3100 treatment, the relative expression of CXCR4 gene was decreased ( P < 0.05). Western blot showed that compared with the blank control group, relative expressions of CXCR4, SDF-1 and osteogenesis-related proteins in the icaritin group were significantly increased (all P < 0.01), but were decreased after AMD3100 was added (all P < 0.01). The ALP activity of icaritin group was significantly higher than that of blank control group (all P < 0.01) on d3 and d6 after drug treatment, while the activity of ALP was significantly decreased after AMD3100 treatment (all P < 0.01). At d14 after drug treatment, compared with the blank control group, the area of alizarin red staining was increased in the icaritin group, while it was significantly reduced after the addition of AMD3100.

Conclusion

Icaritin may promote maturation and mineralization of mouse osteoblast MC3T3-E1 cells through CXCR4/SDF-1 signaling pathway.

淫羊藿苷是中草药淫羊藿的主要有效成分，可促进骨髓基质细胞成骨性分化和成骨细胞矿化成熟，抑制破骨细胞形成和骨吸收活性，具有良好的抗骨质疏松开发应用价值 ^{[ 1- 2]} 。研究表明，淫羊藿苷的各种去糖基化代谢产物都具有高于其原形分子的成骨活性，尤以完全脱去两个糖基的苷元形式即淫羊藿素的成骨活性最高 ^{[ 3]} 。淫羊藿素为黄酮类化合物，具有雌激素样活性，可诱导细胞内雌激素受体、雌激素调节蛋白和孕激素受体等蛋白的表达 ^{[ 4- 5]} 。目前，淫羊藿素促进成骨细胞成熟和矿化的具体机制尚不明确。

趋化因子受体属于七次跨膜的G蛋白偶联受体超家族。根据结合趋化因子的种类分为CXC类、CC类、C类和CX ₃C类。基质细胞衍生因子1(SDF-1)受体CXCR4属于CXC类趋化因子受体。AMD3100作为CXCR4的特效拮抗剂，可以与CXCR4有效结合，阻断SDF-1与CXCR4的相互作用而对CXCR4没有激动作用 ^{[ 6- 7]} 。CXCR4与其配体的主要结合位点是第Ⅳ和第Ⅵ跨膜区的Asp171和Asp262，以及位于第Ⅶ跨膜区的Glu288，其中Glu288是CXCR4拮抗剂AMD3100作用的主要位点 ^{[ 8]} 。目前，已证实CXCR4/SDF-1信号通路参与间充质干细胞的成骨性分化，利用AMD3100阻断CXCR4后，间充质干细胞的成骨性分化能力显著降低 ^{[ 7, 9- 10]} 。本研究旨在用分子生物学方法探明淫羊藿素是否通过CXCR4/SDF-1信号通路促进小鼠成骨细胞成熟和矿化。

小鼠成骨细胞MC3T3-E1由中国典型培养物保藏中心提供。脱水淫羊藿素(纯度＞99%)为上海融禾医药科技发展有限公司产品；AMD3100、DMSO、胰蛋白酶为美国Sigma公司产品；FBS、α-MEM培养基为美国Gibco公司产品；BCA蛋白定量试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；RNAiso试剂、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒为日本TaKaRa公司产品；CXCR4、SDF-1、骨保护素(OPG)、Runt相关基因2(Runx2)、β-actin抗体为英国Abcam公司产品；HRP标记的二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。荧光显微镜(BX51)为日本Olympus公司产品。

MC3T3-E1细胞采用含10% FBS的α-MEM培养液于37 ℃、5%二氧化碳孵箱中培养。实验开始前24 h将细胞用PBS洗涤后换用无血清α-MEM培养基饥饿处理。设空白对照组、AMD3100组、淫羊藿素组、淫羊藿素加AMD3100组。AMD3100用PBS缓冲液溶解后，用培养基稀释至终浓度为0.02 μmol/L ^{[ 11]} ；脱水淫羊藿素用DMSO溶解后，用培养液稀释至10 μmol/L ^{[ 12]} ，且DMSO在培养液中的终浓度小于0.1%。

生长状态良好的小鼠MC3T3-E1细胞传代培养至已装盖玻片的小培养皿中，当细胞汇合度达70%左右时，弃培养基，用4%多聚甲醛固定，0.01% TrtionX-100透膜，滴加免疫荧光封闭液，室温封闭1 h。滴加一抗(1:200稀释)，4 ℃孵育过夜；加入罗丹明标记的免疫荧光二抗(1:500稀释)和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1:1000稀释)，37 ℃避光孵育1 h。每进行下一步操作前用PBS缓冲液清洗三次，5 min/次。细胞爬片梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，避光，荧光显微镜下观察。

药物处理24 h后，TRIzol提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测浓度。调整总RNA的浓度至50 mg/L，将其逆转录为cDNA(40 μL体系)。以逆转录所得到的cDNA作为标准品，经等比稀释后，分别利用 CXCR4、 SDF-1、 Runx2、 OPG的引物进行PCR反应制备标准曲线，经内参 GAPDH校正，分别求得目的基因的相对表达量。反应体系和反应条件均参照说明书设定。PCR数据分析采用ΔΔCt法，以2 ^-ΔΔCt表示。所用引物根据美国国家生物技术信息中心DNA序列数据库(GenBank)所发布的序列，由宝生物工程(大连)有限公司设计并合成( 表 1)。

表1 实时定量RT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences for real-time RT-PCR

基因	引物序列(5′-3′)	长度(bp)
CXCR4	正向：AGTGACCCTCTGAGGCGTTTG反向：GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT	1821
SDF-1	正向：GAGCCAACGTCAAACATCTGAA反向：TCCAGGTACTCTTGGATCCACTTTA	1792
Runx2	正向：CCGCACGACAACCGCACCAT反向：CGCTCCGGCCCACAACAAATCTC	5904
OPG	正向：CAGAGAAGCCACGCAAAAGTG反向：AGCTGTGTCTCCGTTTTATCCT	1487
GAPDH	正向：AAATGGTGAAGGTCGGTGTG 反向：GAATTTGCCGTGAGTGGAGT	660

MC3T3-E1传代细胞以5×10 ⁴个/mL接种于60 mm培养皿，24 h之后更换无血清α-MEM培养基培养12 h，实验组分别更换含0.02 μmol/L AMD3100、10 μmol/L淫羊藿素、0.02 μmol/L AMD3100+10 μmol/L淫羊藿素的α-MEM(10% FBS)培养基培养，每组重复三次。药物处理24 h后用RAPI裂解液提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测CXCR4、SDF-1、OPG和Runx2的蛋白表达量。将药物处理24 h的细胞样品用4 ℃预冷的PBS漂洗两遍后，加入400 μL细胞裂解液于冰上静置10 min使细胞充分裂解。4 ℃ 13 350× g离心15 min，取上清液，用BCA法进行总蛋白浓度测定。95 ℃变性8 min，各组取含20 μg蛋白的样品，经12%SDS-PAGE分离后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温下摇床振荡封闭2 h，然后分别加入CXCR4、SDF-1、OPG、Runx2、β-actin，孵育一抗(均为1:1000稀释)，4 ℃过夜。次日TBST清洗液摇床漂洗四次，8 min/次，加入HRP标记的二抗(1:10 000稀释)，室温孵育2 h，TBST清洗液摇床漂洗四次，8 min/次，用化学发光法检测目的蛋白，曝光时间视实验效果而定 ^{[ 6]} 。

药物处理3、6 d时测定细胞中ALP的活性，方法同试剂盒说明书：弃培养基，用PBS洗两次，加入基质液和缓冲液各0.5 mL，轻微振荡混匀，37 ℃孵育15 min，加入显色液1.5 mL，测波长520 nm处的吸光度值。

将传代后的细胞接种在35 mm培养皿中，待细胞形成钙化结节时(14 d)对其进行染色，具体方法如下：弃培养液，PBS冲洗两次，4%多聚甲醛固定10 min；弃固定液，加入酸碱度为8.9的0.1%茜素红染色液，37 ℃水浴1 h，流水清洗，照相记录结果 ^{[ 2]} 。

采用SPSS 20.0软件处理数据。计量资料用均数±标准差表示( x ± s)，组内不同时间点之间比较采用重复测量的方差分析；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhanes检验， P＜0.05为差异有统计学意义。

CXCR4广泛分布于小鼠成骨细胞表面和细胞质中，见 图 1。

实时定量RT-PCR检测结果显示，与空白对照组比较，淫羊藿素组 CXCR4、 SDF-1、 Runx2和 OPG基因相对表达量增加( P < 0.05或 P < 0.01)，而加入AMD3100后， CXCR4基因相对表达量减少( P < 0.05)，见 图 2。结果提示，淫羊藿素能够增加小鼠成骨细胞 CXCR4、 SDF-1和成骨相关基因的表达，而AMD3100可以抑制淫羊藿素的这种作用。

蛋白质印迹法检测结果显示，与空白对照组比较，淫羊藿素组CXCR4、SDF-1、OPG和Runx2蛋白的相对表达量增加(均 P < 0.01)，而加入AMD3100后，CXCR4、SDF-1、OPG和Runx2蛋白的相对表达量减少(均 P < 0.01)，见 图 3和 图 4。结果提示淫羊藿素能够提高小鼠成骨细胞CXCR4、SDF-1和成骨相关蛋白的表达，而AMD3100可以抑制淫羊藿素的这种作用。

药物处理第3天和第6天时，淫羊藿素组ALP活性均高于空白对照组(均 P＜0.01)，而加入AMD3100后ALP活性均降低(均 P＜0.01)，见 图 5。结果提示淫羊藿素可以提高成骨细胞ALP的活性，而AMD3100可以抑制淫羊藿素的这种作用。

药物处理14 d时，与空白对照组比较，淫羊藿素组茜素红染色面积增加，而加入AMD3100后，茜素红染色面积减少，见 图 6。结果提示淫羊藿素可提高成骨细胞的矿化能力，而AMD3100可以抑制淫羊藿素的这种作用。

淫羊藿素可以促进成骨细胞的成熟和矿化 ^{[ 2, 13]} ，但其作用机制目前尚未明确。CXCR4/SDF-1信号通路参与成骨细胞成骨相关蛋白表达和骨形成，其与骨形态发生蛋白2(BMP2)关系密切，敲除CXCR4后小鼠的骨形成能力显著降低 ^{[ 14- 15]} 。Liu等 ^{[ 16]} 研究发现，在间充质干细胞中，阻断CXCR4/SDF-1信号通路不仅可以降低ALP的活性，而且可以抑制磷酸化Smad1、Smad5、Smad8，Erk1、Erk2蛋白的表达和细胞的矿化成熟。

Runx2为转录因子，可以促进OPG等的表达，是成骨性分化的重要指标 ^{[ 17]} 。本研究结果显示，淫羊藿素可以提高CXCR4、SDF-1、OPG和Runx2的基因和蛋白表达，而加入AMD3100后，上述基因和蛋白的表达均下降，提示淫羊藿素可能通过CXCR4/SDF-1信号通路调控成骨相关基因和蛋白的表达，从而影响成骨细胞的成熟。

ALP是成骨性分化的早期标志，而钙化结节是矿化机制形成的特征性指标，是成骨细胞体外成骨表型的最终表达 ^{[ 18]} 。本研究通过检测ALP的活性，发现淫羊藿素可以显著增强成骨细胞中ALP的活性，而加入AMD3100后，ALP活性显著减弱。茜素红染色结果提示，药物处理14 d时，淫羊藿素组成骨细胞茜素红染色面积增加，而加入AMD3100后茜素红染色面积减少。上述结果提示，淫羊藿素可能通过CXCR4/SDF-1信号通路影响成骨细胞的成熟和矿化。

综上所述，淫羊藿素能够显著提高小鼠成骨细胞CXCR4的基因和蛋白表达量，并可能通过CXCR4/SDF-1信号通路提高小鼠成骨细胞成熟和矿化。但是，CXCR4/SDF-1信号通路是如何参与淫羊藿素成骨性相关信号通路的，与淫羊藿素直接作用的受体是什么，它又是如何被激活的，均有待进一步研究。此外，本研究中AMD3100组OPG和Runx2基因或蛋白表达量较空白对照组并无明显下降甚至有所升高，其中原因目前尚不清楚，需要更深入的研究。

Funding Statement

国家自然科学基金（81471090）