密封蛋白4与高危型人乳头瘤病毒联合检测对于高级别鳞状上皮内病变及宫颈鳞癌的诊断价值

Abstract

目的

探讨密封蛋白4（CLDN4）在不同级别宫颈病变组织中的表达及其与高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）联合检测的意义。

方法

选取2015年6月至2016年12月在浙江大学医学院附属邵逸夫医院妇科门诊就诊且经病理组织学检查证实的低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）和宫颈鳞癌患者的子宫颈组织标本各30份，同时选取30例慢性宫颈炎患者的子宫颈组织标本作为对照组。采用免疫组织化学法检测子宫颈组织中CLDN4蛋白表达，实时定量PCR检测HR-HPV，液基细胞学检查（TCT）检测宫颈脱落细胞学改变。采用ROC曲线分析比较TCT联合HR-HPV与CLDN4联合HR-HPV检测对HSIL和宫颈鳞癌的诊断价值。

结果

随着宫颈病变程度加重，CLDN4表达阳性率上升（ r=0.832， P < 0.05）。HR-HPV感染与CLDN4表达共阳性主要出现在HSIL和宫颈癌组。TCT联合HR-HPV和CLDN4联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的AUC分别为0.683和0.633。TCT联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为100.0%、36.7%、61.2%、100.0%、46.7%；CLDN4联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为96.7%、30.0%、58.0%、90.0%、55.0%。

结论

CLDN4表达与宫颈鳞癌及癌前病变的发生和发展相关，CLDN4联合HR-HPV检测可指导临床HSIL及宫颈鳞癌的诊断和治疗。

在我国，宫颈癌的发病率居妇科恶性肿瘤之首位，病死率居妇科恶性肿瘤的第二位，其中以鳞状细胞癌多发 ^{[ 1- 2]} 。宫颈鳞癌的发生和发展有一个渐进的演变过程，时间可以从数年到数十年，一般认为这个演变过程经过以下几个阶段：低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)、早期浸润性癌和浸润性癌。其中，LSIL和HSIL是宫颈癌的癌前病变，LSIL和部分HSIL具有可逆性，早期干预可终止癌症进程 ^{[ 3- 4]} 。临床调查发现，及时诊断和治疗可使早期癌症患者5年存活率提高至80%~90% ^{[ 5- 6]} 。因此，如何及时发现宫颈癌前病变特别是HSIL成为宫颈鳞癌防治的重点。

目前已证实，高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papilloma virus，HR-HPV)与宫颈鳞癌存在密切的关联 ^{[ 7]} 。但是，并非所有HPV感染都会发展为宫颈病变或宫颈癌，因此HPV检测诊断宫颈癌虽然敏感度高，但假阳性率也非常高。同时HPV检测不能有效区别LSIL、HSIL、宫颈鳞癌等不同的病理阶段。液基细胞学检查(thinprep cytologic test，TCT)是目前宫颈癌筛查的主要手段，但由于采样等多种原因，TCT诊断HSIL病变的准确性受到一定限制；而且TCT检测主要基于细胞形态特征，缺乏组织学特征评估，因此易受主观因素的影响，误诊率较高 ^{[ 8- 9]} 。

紧密连接蛋白是上皮细胞之间的一种重要的连接复合体，由跨膜蛋白家族(闭合蛋白和密封蛋白)、膜周蛋白家族(ZO蛋白)等构成，起着细胞旁通透屏障和维持细胞极性的作用 ^{[ 10- 11]} 。紧密连接蛋白家族由23个成员构成，在人体的各个组织和器官中均有表达，例如密封蛋白1在甲状腺中表达，密封蛋白2、3在胃肠道中表达等 ^{[ 12- 13]} 。已有许多研究发现，细胞连接破坏、密封蛋白4(CLDN4)高表达与鳞状细胞癌的发生密切相关。例如，CLDN4在喉鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、前列腺鳞状细胞癌组织中表达明显上调，提示CLDN4高表达可能会促进鳞状细胞癌的发生 ^{[ 14- 16]} 。CLDN4在宫颈鳞癌组织中是否也呈高表达状态，其对于宫颈鳞癌及癌前病变是否具有诊断价值呢？本研究选取LSIL、HSIL以及宫颈鳞癌患者的子宫颈组织标本，以慢性宫颈炎患者的子宫颈组织标本作为对照，采用免疫组织化学法检测CLDN4在子宫颈组织中的表达，并结合HR-HPV检测结果，判断其在宫颈鳞癌及癌前病变诊断中的价值。

选取于2015年6月至2016年12月在浙江大学医学院附属邵逸夫医院妇科门诊就诊的患者90例，所有患者均行HPV和TCT检测发现异常，后行组织病理学检查确诊，其中LSIL、HSIL以及宫颈鳞癌患者各30例。排除被诊断为子宫颈以外其他部位肿瘤者，以及曾接受化疗、放射治疗的患者。选取同期在浙江大学医学院附属邵逸夫医院妇科门诊就诊并诊断为慢性宫颈炎的患者30例作为对照组。各组患者年龄、吸烟史、既往肿瘤史、手术史和妊娠史差异均无统计学意义( 表 1)。

表1 各组患者基线资料比较

Table 1 Baseline data of each group

[ x ± s或 n(%)]
组别	n	年龄(岁)	吸烟史	既往肿瘤史	手术史	妊娠史
对照组	30	42±14	5(16.7)	0(0.0)	1(3.3)	22(73.3)
LSIL组	30	44±19	6(20.0)	0(0.0)	0(0.0)	21(70.0)
HSIL组	30	43±12	4(13.3)	0(0.0)	0(0.0)	25(83.3)
宫颈癌组	30	45±15	7(23.3)	0(0.0)	1(3.3)	26(86.7)
P值	—	＞0.05	＞0.05	＞0.05	＞0.05	＞0.05

“—”无相关数据.LSIL：低级别鳞状上皮内病变；HSIL：高级别鳞状上皮内病变.

HPV采样刷、取样管和Cobas 4800 HPV检测系统为瑞士Roche公司产品；细胞刷和宫颈细胞保存液瓶为泰普生物科学(中国)有限公司产品；ThinPrep 2000检测系统为美国Cytyc公司产品；兔二抗[Rabbit CLDN4(Claudin 4) ELISA Kit]为上海继和生物科技有限公司产品；DAB显色液为北京索莱宝科技有限公司产品；正置荧光显微镜(XSP-63X)为上海光学仪器厂产品。

于阴道镜下取病变部位组织标本，将标本固定于10%甲醛溶液24 h；将修块的标本块依次经过80%乙醇1 h、90%乙醇1 h、95%乙醇3 h、100%乙醇Ⅰ1 h、100%乙醇Ⅱ1 h、100%乙醇Ⅲ 1 h进行脱水处理；将标本依次经过二甲苯Ⅰ30 min、二甲苯Ⅱ30 min；透明后的标本依次通过石蜡Ⅰ1 h、石蜡Ⅱ6 h包埋；将切片机的厚度调节器调节为4 μm，连续切片；入3%过氧化氢37 ℃孵育10 min，PBS清洗3 min，重复三次。使用5% FBS(PBS稀释)37 ℃封闭1 h，倾去血清，勿洗。加入一抗，4 ℃过夜，转至室温30 min，PBS清洗3 min，重复三次。加入兔二抗，37 ℃孵育1~2 h，PBS清洗3 min，重复三次。加入DAB显色液，于显微镜下观察反应进度，待合适后自来水终止。苏木素复染细胞核，自来水冲洗，37 ℃反蓝，干燥过夜；树脂封片；正置荧光显微镜拍照。CLDN4染色阳性呈棕黄色，主要表达于细胞膜。根据染色颜色深度进行半定量分析：无色为-，淡黄色为+，棕黄色为+ +，棕褐色为+ + +。

以窥阴器暴露子宫颈，然后使用专用的HPV采样刷置于子宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈。慢慢取出宫颈刷，将其放入标有患者编号的取样管中，折断其刷头放入管中，拧紧瓶盖，置于4 ℃冰箱中保存，尽快送检。采用Cobas 4800 HPV检测系统进行HR-HPV检测，具体步骤和结果判定参照说明书。

用窥阴器张开阴道，然后用棉拭子擦去子宫颈的黏液。右手持细胞刷柄末端，将细胞刷头中央刷毛部分轻轻深插入子宫颈管内，使较短的刷毛能够完全接触到子宫颈，按同一方向旋转5~10圈后拿出。将已经刷取下脱落细胞的细胞刷放入装有细胞保存液的小瓶中进行漂洗，然后保存于4 ℃冰箱，尽快送检。

采用ThinPrep 2000检测系统检测脱落细胞学改变，具体步骤参照说明书。由专业细胞病理医生根据TBS系统阅片诊断。

所有数据均用SPSS 19.0统计软件包进行处理。计数资料以例数和百分率[ n(%)]表示，组间比较采用 χ ²检验；计量资料以均数±标准差( x ± s)表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD和SNK法，方差不齐时采用Tamhane's T2或Dunnett's T3法；有序分类资料采用Ridit分析。采用Pearson检验进行相关性分析。采用ROC曲线分析TCT联合HR-HPV和CLDN4联合HR-HPV检测的诊断价值。双侧检验 P＜0.05。

CLDN4蛋白在对照组和LSIL组中大部分为阴性表达，而在HSIL组和宫颈癌组中主要为阳性和强阳性表达( 图 1)。

半定量分析结果显示，LSIL组、HSIL组和宫颈鳞癌组CLDN4阳性率均高于对照组(均 P＜0.05)；HSIL组和宫颈癌组CLDN4阳性率高于LSIL组(均 P＜0.05)；宫颈癌组CLDN4阳性率高于HSIL组( P＜0.05)。随着宫颈病变程度加重，CLDN4阳性率上升( r＝0.832， P＜0.05)，见 表 2。结果提示，CLDN4的表达强度与宫颈病变程度相关。

表2 不同宫颈病变组织中密封蛋白4半定量分析结果

Table 2 Claudin 4 expression in cervical tissues from patients with different cervical lesions

[ n(%)]
组别	n	阴性	阳性
+	++	+++	合计
对照组	30	26(86.7)	4(13.3)	0(0.0)	0(0.0)	4(13.3)
LSIL组	30	21(70.0)	8(26.7)	1(3.3)	0(0.0)	9(30.0) *
HSIL组	30	12(40.0)	4(13.3)	8(26.7)	6(20.0)	18(60.0) *#
宫颈癌组	30	1(3.3)	3(10.0)	12(40.0)	14(46.7)	29(96.7) *#△

^*与对照组比较， P＜0.05; ^#与ISIL组比较， P＜0.05； ^△与HSIL组比较， P＜0.05.LSIL：低级别鳞状上皮内病变；HSIL：高级别鳞状上皮内病变.

对照组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌组HR-HPV感染率分别为46.7%、63.3%、93.3%和96.7%，HR-HPV感染率随着宫颈病变严重程度而增加( r=0.418， P＜0.05)，见 表 3。结果提示，HR-HPV感染与宫颈病变程度相关。

表3 不同宫颈病变组织HR-HPV检测结果比较

Table 3 High risk HPV infections in patients with different cervical lesions

[ n(%)]
组别	n	阴性	阳性
弱阳性	阳性	强阳性	合计
对照组	30	16(53.3)	3(10.0)	9(30.0)	2(6.7)	14(46.7)
LSIL组	30	11(36.7)	3(10.0)	11(36.7)	5(16.7)	19(63.3)
HSIL组	30	2(6.7)	6(20.0)	14(46.7)	8(26.7)	28(93.3)
宫颈癌组	30	1(3.3)	2(6.7)	12(40.0)	15(50.0)	29(96.7)

HR-HPV:高危型人乳头瘤病毒；LSIL：低级别鳞状上皮内病变；HSIL：高级别鳞状上皮内病变.

对照组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌组TCT检测的诊断准确度分别为30.0%、50.0%、43.3%和50.0%，见 表 4。

表4 不同宫颈病变组织液基细胞学检测效率比较

Table 4 Comparison of thinprep cytologic test detection efficiency in different cervical lesions

[ n(%)]
组别	n	ASC-H	LSIL	HSIL	宫颈鳞癌	准确度
对照组	30	9(30.0)	11(36.7)	10(33.0)	0(0.0)	9(30.0)
LSIL组	30	7(23.3)	15(50.0)	8(26.7)	0(0.0)	15(50.0)
HSIL组	30	7(23.3)	10(33.3)	13(43.3)	0(0.0)	13(43.3)
宫颈癌组	30	2(6.7)	3(10.0)	10(33.3)	15(50.0)	15(50.0)

ASC-H:非典型鳞状细胞；LSIL：低级别鳞状上皮内病变；HSIL：高级别鳞状上皮内病变.

对照组、LSIL组、HSIL组和宫颈癌组TCT联合HR-HPV检测的诊断准确度分别为13.3%、36.7%、43.3%和50.0%，见 表 5。

表5 不同宫颈病变组织液基细胞学联合HR-HPV检测的诊断效率比较

Table 5 Diagnostic value of thinprep cytologic combined with high risk HPV test in different cervical lesions

[ n(%)]
组别	n	HR-HPV阳性	准确度
ASC-H	LSIL	HSIL	宫颈鳞癌
对照组	30	4(13.3)	4(13.3)	2(6.7)	0(0.0)	4(13.3)
LSIL组	30	3(10.0)	11(36.7)	5(16.7)	0(0.0)	11(36.7)
HSIL组	30	5(16.7)	10(33.3)	13(43.3)	0(0.0)	13(43.3)
宫颈癌组	30	1(3.3)	3(10.0)	10(33.3)	15(50.0)	15(50.0)

HR-HPV:高危型人乳头瘤病毒；ASC-H：非典型鳞状细胞；LSIL：低级别鳞状上皮内病变；HSIL：高级别鳞状上皮内病变.

CLDN4和HR-HPV同时阳性均出现在HSIL组和宫颈癌组，CLDN4联合HR-HPV检测诊断HSIL组18例(60.00%)，宫颈癌组28例(93.33%)，见 表 6。

表6 不同宫颈病变组织CLDN4联合HR-HPV检测的诊断效率比较

Table 6 Diagnostic value of claudin 4 combined with high risk HPV test in different cervical lesions

[ n(%)]
组别	n	HR-HPV阳性	准确度
CLDN4-	CLDN4+	CLND4++	CLND4+++
对照组	30	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	—
LSIL组	30	19(63.3)	0(0.0)	0(0.0)	0(0.0)	—
HSIL组	30	10(33.3)	4(13.3)	8(26.7)	6(20.0)	18(60.0)
宫颈癌组	30	1(3.3)	3(10.0)	11(36.7)	14(46.7)	28(93.3)

“—”无相关数据.HR-HPV:高危型人乳头瘤病毒；CLDN4:密封蛋白4；LSIL：低级别鳞状上皮内病变；HSIL：高级别鳞状上皮内病变.

ROC曲线分析结果显示，TCT联合HR-HPV及CLDN4联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的AUC分别为0.683和0.633，见 图 2。TCT联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为100.0%、36.7%、61.2%、100.0%、55.0%，CLDN4联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为96.7%、30.0%、58.0%、90.0%、46.7%。结果提示，CLDN4联合HR-HPV与TCT联合HR-HPV检测诊断HSIL和宫颈鳞癌的价值相近。

肿瘤的发生是一个多基因多步骤的过程，宫颈癌的发生大致经历LSIL、HSIL及宫颈癌等几个阶段。如在HSIL阶段对患者进行干预治疗，可有效缓解疾病的进程，逆转肿瘤的发生。因而，早期发现、早期治疗是宫颈癌防治的重要任务。

HPV根据致癌性可分为高危型和低危型两大类。HR-HPV感染与宫颈癌的发生密切相关 ^{[ 4, 17]} 。本文资料显示，随着宫颈病变程度加重，HR-HPV感染率上升，提示HR-HPV感染与宫颈上皮内病变及宫颈癌的发生和发展有关，与文献报道一致 ^{[ 18]} 。但是，本研究发现LSIL、HSIL以及宫颈癌组HR-HPV感染率均较高，仅根据HR-HPV检测结果不能判断宫颈病变的程度。

TCT是一种高效率、高质量的现代检测技术，具有细胞采集量多、分布均匀、细胞结构及背景清晰、易于阅片等优点。然而，脱落细胞不能准确表现整个上皮的组织形态结构，因而检测结果存在一定的假阳性率和假阴性率 ^{[ 8]} 。

CLDN4是紧密连接蛋白家族中的一员，与鳞状细胞癌的发生密切相关 ^{[ 19]} ，但其在宫颈鳞癌组织中的表达情况目前报道较少。我们采用免疫组织化学法检测了不同宫颈病变患者子宫颈组织中CLDN4的表达，发现CLDN4蛋白在对照组和LSIL组中主要为阴性表达，而在HSIL组和宫颈癌组中主要为阳性和强阳性表达。随着宫颈病变程度加重，CLDN4阳性率增加，且CLDN4强阳性以及CLDN4和HR-HPV同时阳性仅发生于HSIL和宫颈癌组，说明CLDN4强阳性可能提示病变程度较高或处于HSIL向宫颈鳞癌发展的过程中。该结果对临床采取保守治疗还是手术治疗可能具有一定的参考价值，如对于CLDN4阳性、逆转可能性小的患者可行手术治疗，而对于CLDN4阴性的患者可采取保守治疗，严密监测病程进展。

本研究采用ROC曲线对CLDN4联合HR-HPV检测与TCT联合HR-HPV检测对于HSIL和宫颈鳞癌的诊断价值进行了评估，结果发现，CLDN4联合HR-HPV检测的诊断价值与TCT联合HR-HPV检测相近。由于本研究收集的样本数有限，CLDN4联合HR-HPV检测对于HSIL和宫颈鳞癌的诊断价值有待扩大样本量进一步研究。

综上所述，子宫颈组织中CLDN4表达与宫颈鳞癌及癌前病变的发生和发展相关，联合HR-HPV检测可指导HSIL及宫颈鳞癌的诊断和治疗。但是，本研究未能进一步分析HSIL患者中CLDN4表达情况与患者预后是否相关，也未能进一步探索HR-HPV感染与CLDN4表达共阳性和HR-HPV感染与CLDN4表达阴性患者的预后有无差别，有待后续进一步研究。