高表达过氧化物酶体增殖子激活受体γ诱导小鼠原代肝细胞发生脂肪变性

Abstract

目的

研究外源过氧化物酶体增殖子激活受体(PPAR)γ高表达对小鼠原代肝细胞脂肪变性的影响。

方法

从5~6周龄C57BL/6J小鼠分离培养原代肝细胞, 分别用LacZ腺病毒(Ad/LacZ)或PPARγ腺病毒(Ad/PPARγ)感染细胞48 h, 油红O染色检测原代肝细胞脂肪积聚情况; 实时定量PCR和蛋白质印迹法分析PPARγ、成脂相关基因aP2和CideA等mRNA和蛋白表达水平。

结果

原代分离培养的小鼠肝细胞透光度好, 胞核圆且透亮, 细胞呈圆形生长, 有双核, 连接成片状或岛状。用Ad/LacZ或Ad/PPARγ感染48 h后, Ad/LacZ组肝细胞几乎无脂肪积聚, 而Ad/PPARγ感染肝细胞中有大量脂肪滴沉积。外源PPARγ刺激作用下, 肝细胞中PPARγ、aP2、FGF21、CideA mRNA表达增加, 而adiponectin mRNA表达下降(均 P < 0.05)。Ad/PPARγ感染后, PPARγ和aP2蛋白表达也增加。

结论

高表达PPARγ诱导小鼠原代肝细胞脂肪变性和脂肪相关基因表达。

肝脏是机体新陈代谢的中心站，发挥去氧化、解毒、储存肝糖、合成分泌性蛋白质等作用。众多研究表明，肝脏是脂质代谢的主要调控器官，调控脂肪生成、脂肪酸氧化、脂蛋白摄取和分泌等各个方面 ^{[ 1, 2]} 。肝脏脂肪代谢一旦发生紊乱，就会导致肥胖、脂肪肝、2型糖尿病和动脉粥样硬化等代谢综合征 ^{[ 3]} 。肝细胞是肝脏的实质细胞，占肝脏体积及数量的80%。肝细胞内代谢活跃，可合成人体必需的凝血因子、脂肪酸、胆固醇和磷脂等，并贮存糖原和脂类等。因而，研究肝细胞的脂肪代谢具有重要意义。

研究发现，肝脏脂肪代谢主要受过氧化物酶体增殖子激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)家族调控 ^{[ 4]} 。PPAR家族主要有三个成员：PPARα、PPARγ和PPARβ/δ。PPARα和PPARβ/δ主要参与脂肪酸氧化代谢与能量消耗，而PPARγ主要参与脂肪细胞分化和能量储存 ^{[ 5, 6]} 。文献报道，外源表达PPARγ能促使NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化，并诱导脂肪生成相关基因的表达 ^{[ 7]} 。在正常肝脏中，PPARγ表达水平比较低，但在病理状态下，如脂肪肝模型(ob/ob和PPARα ^-/-)小鼠肝脏中PPARγ的表达明显增加 ^{[ 8, 9]} 。AZIP小鼠是一种脂肪缺乏性糖尿病小鼠模型，具有严重的胰岛素抵抗、高血糖和高脂血症。特异性敲除其肝脏PPARγ能缓解肝脏脂肪积聚 ^{[ 10]} 。外源表达PPARγ能够促进小鼠脂肪肝的形成 ^{[ 11]} 。那么，高表达PPARγ是否会导致原代肝细胞脂肪变性，并诱导脂肪特异性基因的大量表达呢？

本实验利用原代培养的C57BL/6J小鼠肝细胞，通过感染Ad/LacZ和Ad/PPARγ，研究了外源高表达PPARγ对肝细胞脂肪变性和成脂相关基因表达的影响。

5~6周龄，体质量为20 g左右的SPF级C57BL/6J小鼠由西安交通大学医学部医学实验动物中心SPF级动物房提供。小鼠在12 h/12 h明暗交替的环境中饲养，自由饮水。实验遵从西安交通大学动物中心的动物伦理规定以及相关条例，处理程序均符合美国NIH实验动物管理法和陕西省实验动物管理办法。

Hank's平衡盐溶液购自美国Hyclone公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自美国Gibco公司；胰酶抑制剂、胶原酶Ⅱ购自美国Sigma公司；RNAiso Plus、反转录酶试剂盒和SYBR试剂均购自日本TaKaRa公司；aP2和β-actin抗体购自美国Santa Cruz生物公司；PPARγ抗体购自英国abcam生物公司；引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Nikon Eclipse TE2000-U倒置显微镜购自日本尼康公司；Thermal Cycler Dice TP-800购自日本TaKaRa公司。

原代肝细胞取自C57BL/6J小鼠肝脏，用原位胶原酶灌流法分离肝细胞。首先，37 ℃预热溶液Ⅰ(不含钙离子和镁离子的Hank’s平衡盐溶液加入0.5 mmol/L EDTA)和溶液Ⅱ(含钙离子和镁离子的Hank’s平衡盐溶液加入10 mmol/L Hepes液、84 U/mL胶原酶Ⅱ和0.13 mg/mL胰酶抑制剂)；然后，用苯巴比妥麻醉小鼠，打开腹部暴露出门静脉和下腔静脉，用12号针头插入门静脉，开始灌流溶液Ⅰ，同时剪断下腔静脉；用溶液Ⅰ灌流4 min，溶液Ⅱ灌流6 min；之后，钝性分离取出肝脏，用小梳子轻轻刮肝脏，使肝细胞分离出来，过滤细胞悬液，50× g离心5 min；弃上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞计数，接种；接种后4 h，待细胞贴壁，更换培养液，去掉死细胞和没有贴壁的细胞，感染Ad/LacZ或Ad/PPARγ 12 h，更换为正常培养液，继续培养36 h，收集细胞。

从二氧化碳培养箱中取出Ad/LacZ或Ad/PPARγ感染的原代肝细胞，弃掉培养液，用PBS冲洗三次，10%甲醛固定5 min；蒸馏水轻轻冲洗三次，加入100%丙二醇5 min，0.5%油红O染液60 ℃孵育8 min；之后，用85%丙二醇洗涤5 min，蒸馏水轻轻冲洗三次，用倒置显微镜观察拍照。

从小鼠肝细胞中提取总RNA检测RNA浓度及纯度；取1 μg总RNA进行反转录；做实时定量PCR，每个样品设置三个重复，以18S核糖体RNA为内参。20 μL实时定量PCR反应体系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，灭菌双蒸水6.4 μL，10 μmol/L的正向和反向引物各0.8 μL(引物序列见 表 1)，cDNA 2.0 μL，PCR引物见 表 1。运用2 ^-ΔΔCt来分析基因相对表达水平，ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct内参) _处理组-(Ct靶基因-Ct内参) _未处理组。

表1 实时定量PCR引物

Table 1 Primers for Real time PCR

基因名称	引物序列(5’-3’)
PPARγ	正向：CCACAGTTGATTTCTCCAGCATTTC
反向：CAGGTTCTACTTTGATCGCACTTTG
aP2	正向：GAAGTGGGAGTGGGCTTTGC
反向：TGTGGTCGACTTTCCATCCC
FGF21	正向：CTGCTGGGGGTCTACCAAG
反向：CTGCGCCTACCACTGTTCC
CideA	正向：TGACATTCATGGGATTGCAGAC
反向：GGCCAGTTGTGATGACTAAGAC
adiponectin	正向：GATGGCACTCCTGGAGAGAA
反向：TCTCCAGGCTCTCCTTTCCT
Hkdc1	正向：GCCCACATTCGTCAGGGCCA
反向：GGTGAAGCCCAGAGGCAGCTT
18S	正向：AAACGGCTACCACATCCAAG
反向：CCTCCAATGGATCCTCGTTA

收集肝细胞蛋白样品，加入细胞裂解液，16 200× g 4 ℃离心20 min，取上清液进行蛋白定量。之后，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴3~5 min使蛋白变性。取20 μg总蛋白样品，用4%~20% SDS-PAGE电泳约90 min，用硝酸纤维素膜转膜，5%牛奶封闭液封闭60 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，使用ECL试剂发光，在暗室中用暗盒压片、洗片，扫描记录结果。

实验数据以均数±标准差( x ± s)表示，用Student's t 检验对两组数据进行差异性检验， P < 0.05为差异有统计学意义。

采用原位胶原酶灌流法从C57BL/6J小鼠肝脏分离获取原代肝细胞。细胞接种6 h后开始贴壁，显微镜下观察细胞小而均匀、透光度好，细胞核圆形且透亮。细胞呈圆形生长，有双核，连接成片状或岛状( 图 1A， 1B)。Ad/LacZ或Ad/PPARγ感染12 h后，细胞仍然健康，贴壁细胞伸出多个伪足，呈多边形，相邻细胞连接成小片状( 图 1C， 1D)。

Ad/LacZ或Ad/PPARγ感染肝细胞48 h后，油红O染色显示，Ad/LacZ感染肝细胞几乎无脂肪积聚( 图 2A， 2B)。相反，Ad/PPARγ感染的小鼠肝细胞中有大量的脂肪积聚( 图 2C， 2D)。这些现象提示，外源高表达PPARγ能够增加肝细胞脂肪合成，促进肝细胞脂肪变性。

实时定量PCR检测结果表明，与Ad/LacZ感染比较，Ad/PPARγ感染的原代肝细胞中PPARγ mRNA表达升高276倍，aP2 mRNA表达升高192倍，FGF21 mRNA表达升高5.92倍，CideA mRNA表达升高5.41倍；而adiponectin的mRNA表达水平下降；Hkdc1 mRNA表达在两组间差异无统计学意义。见 表 2。

表2 Ad/PPARγ感染的原代肝细胞成脂基因mRNA表达变化

Table 2 Experssion of adipogenic related genes in Ad/PPARγ infected primary hepatocytes

( x ± s)
基因	Ad/LacZ感染	Ad/PPARγ感染
PPARγ	1.00±0.07	276.00±11.46 **
aP2	1.00±0.03	192.00±6.59 **
FGF21	1.00±0.16	5.92±0.46 *
CideA	1.00±0.05	5.41±1.31 *
adiponectin	1.00±0.15	0.42±0.06 *
Hkdc1	1.00±0.16	0.94±0.13
与Ad/LacZ感染比较， * P < 0.05， ** P < 0.01.

蛋白质印迹法检测结果表明，原代肝细胞Ad/PPARγ感染后，PPARγ、aP2蛋白表达增加；但在Ad/LacZ感染的原代肝细胞中几乎检测不到PPARγ、aP2蛋白表达，见 图 3。这些结果提示，外源PPARγ能刺激小鼠肝细胞脂肪变性所需的基因和蛋白表达。

PPARγ是脂肪组织发育和脂肪细胞分化所必需的转录因子 ^{[ 12]} 。研究发现，脂肪细胞分化诱导PPARγ表达，PPARγ通过刺激成脂关键基因表达，促进成熟脂肪细胞脂质的生成和储存 ^{[ 7, 13]} 。在培养的成纤维细胞中外源表达PPARγ能促进脂肪生成，并诱导成脂相关基因表达。PPARγ激动剂能以剂量依赖的方式促使PPARγ表达的细胞向成脂分化 ^{[ 7]} 。与此一致，PPARγ嵌合体小鼠表现出脂肪萎缩、脂肪肝和多处出血 ^{[ 14]} 。PPARγ缺失的细胞不能生成脂肪 ^{[ 13]} 。在肝脏中，虽然PPARγ表达较少，但也发挥着重要调控作用。PPARγ表达增加是脂肪肝的一个重要指标 ^{[ 10]} 。ob/ob小鼠呈现脂肪肝，这种表型与肝脏中PPARγ及脂肪生成基因如脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶等表达的增加密切相关 ^{[ 10, 15]} 。体内研究表明，给小鼠尾静脉注射PPARγ导致脂肪肝生成，并诱导脂肪特异性基因和成脂相关基因的强烈表达 ^{[ 16, 17]} 。本研究中，外源给予PPARγ刺激，能够诱导原代肝细胞发生脂肪变性，且表达成脂相关基因，如PPARγ、aP2和CideA等。这是研究肝细胞脂质代谢的另外一种新形式。

PPARγ信号通路调控脂肪生成、胆固醇代谢、脂肪酸运输、脂肪酸氧化、脂肪细胞分化等多种脂类活动 ^{[ 12]} 。aP2是PPARγ的直接靶基因，在脂肪细胞中高表达，是脂肪细胞分化的标志基因，参与调控细胞内脂肪酸代谢。脂滴作为细胞质内主要的动态内含物，是细胞内脂肪的贮存库，脂滴表面覆盖有一些蛋白，称之为脂滴相关蛋白 ^{[ 18]} 。在甘油三酯合成过程中，脂滴蛋白覆盖在新生脂滴表面，发挥脂质储存功能 ^{[ 18]} 。研究发现，脂肪肝营养障碍小鼠的脂肪肝中脂滴相关蛋白表达显著上升 ^{[ 19]} 。脂滴相关蛋白主要包括PAT蛋白家族和Cide蛋白家族。研究报道，Cide蛋白家族成员CideA定位于脂滴表面，主要调控脂滴大小和脂肪水解。为了探讨高表达PPARγ诱导肝细胞脂肪变性的分子机制，我们也检测了脂滴相关蛋白的表达。结果显示，在PPARγ高表达的原代肝细胞中，脂肪分化的标志基因aP2和脂滴蛋白CideA表达水平升高，表明PPARγ能诱导脂肪合成相关基因的表达，促进肝细胞脂肪变性。

除了脂滴相关蛋白之外，研究发现，其他代谢通路也影响肝脏脂质积聚 ^{[ 1, 20]} 。代谢激素内分泌亚家族成员FGF21是肝脏葡萄糖和脂肪代谢的另一个关键调控子 ^{[ 21, 22]} 。FGF21通过降低甘油三酯水平来逆转肝脏的脂肪变性。FGF21减轻脂肪肝的这一功能主要是通过抑制SREBP-1和肝脏生脂通路及葡萄糖生成通路来实现的 ^{[ 22]} 。而且，在高脂日粮诱导的肥胖小鼠中，FGF21通过促进脂肪酸氧化和提高胰岛素敏感性来增加能量消耗 ^{[ 22]} 。本研究表明，肝细胞高表达PPARγ促进FGF21的表达，可能与FGF21是PPARγ的靶基因有关，也可能是肝脏脂肪变性的一种保护性反馈作用。

adiponectin是一种脂肪细胞分泌因子，参与调节血糖水平以及脂肪酸分解代谢，其表达量和血浆水平与肥胖和胰岛素抵抗成反比 ^{[ 23]} 。脂肪组织高表达adiponectin转基因小鼠脂肪细胞分化受阻，能量消耗增加 ^{[ 24]} 。adiponectin在治疗2型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝和动脉粥样硬化方面具有重要作用 ^{[ 25, 26]} 。有报道adiponectin能够通过降低肥胖小鼠肌肉和肝脏甘油三酯水平来降低胰岛素抵抗 ^{[ 27]} 。与以上研究一致，本研究中，我们发现在肝细胞脂肪变性过程中，adiponectin表达减少。此外，Hkdc1具有己糖激酶活性，在糖代谢中发挥重要调控作用。以往研究表明，外源表达PPARγ能够促进小鼠脂肪肝的形成，基因芯片和实时定量PCR检测结果表明Hkdc1在高表达PPARγ的肝脏组织中显著上调 ^{[ 11]} 。所以，PPARγ可能调控Hkdc1。然而，本研究结果显示，原代肝细胞中PPARγ高表达后，Hkdc1表达并无变化，可能由于体内与体外实验差别的缘故。

综上所述，高表达PPARγ能够诱导小鼠肝细胞脂肪变性，其分子生物学机制之一是通过PPARγ信号通路激活后，脂肪生成基因的表达增加，导致细胞质中脂滴过度积聚。本研究可以为深入研究肝脏脂质代谢分子生物学机制奠定实验基础。

Funding Statement

国家自然科学基金(81200207);中央高校基本科研业务费专项资金