锦花清热胶囊抗内毒素作用实验研究

Abstract

目的

探讨锦花清热胶囊的解热和抗内毒素作用。

方法

选健康雄性新西兰兔30只，采用注射脂多糖法建模，然后将所有新西兰兔分为五组：模型对照组（等渗氯化钠溶液），阳性对照组（阿司匹林0.2 g/kg），锦花清热胶囊大、中、小剂量组（分别含生药6.0、3.0、1.5 g/kg），每组6只，观察锦花清热胶囊对内毒素所致发热新西兰兔的降温作用；取昆明小鼠50只，分为五组：模型对照组（等渗氯化钠溶液），阳性对照组（阿司匹林0.2 g/kg），锦花清热胶囊大、中、小剂量组（分别含生药6.0、3.0、1.5 g/kg），每组10只，采用显色基质法检测锦花清热胶囊对昆明小鼠血浆中内毒素的降解率。

结果

新西兰兔解热实验结果显示，锦花清热胶囊大、中剂量组在60 min后降温作用显著，其中大剂量组在300 min时已经接近基础体温；小剂量组在180 min后开始有降温作用，提示锦花清热胶囊对发热新西兰兔有降温作用；昆明小鼠抗内毒素实验结果显示，锦花清热胶囊大、中、小剂量组在30 min时内毒素的降解率为（56.73±3.12）%、（47.23±1.77）%、（21.08±2.30）%，60 min时为（82.76±1.00）%、（64.75±1.77）%、（38.21±1.57）%，提示锦花清热胶囊对昆明小鼠有降低内毒素的作用。

结论

锦花清热胶囊有显著的解热和抗内毒素作用，可以为临床治疗热毒类疾病提供依据。

我国中医中药治疗疾病具有悠久的历史，临床疗效确切，副作用小、毒性低、安全可靠，备受大众认可。有研究显示，中药及复方制剂有直接对抗内毒素的作用，能提高机体防护能力及降低内毒素的活性 ^{[ 1- 2]} 。其中，金银花、连翘提取物能导致内毒素结构破坏 ^{[ 3- 4]} ，对内毒素所致的发热小鼠、大鼠均有明显的解热作用 ^{[ 5- 6]} 。金银花中的主要成分绿原酸对内毒素作用下的肠黏膜微血管内皮细胞功能有保护作用 ^{[ 7]} ，连翘酯苷A对内毒素血症急性肺损伤也有保护作用 ^{[ 8]} 。锦花清热胶囊是由锦灯笼、金银花、连翘等六味中药组方的中药复方制剂，有清热泻火、凉血、解毒、疏散风热等功效，临床用于痰热、风热感冒等病症 ^{[ 9]} 。前期实验已证实该制剂毒性极低 ^{[ 10]} ，含有绿原酸、连翘酯苷、木樨草苷、酸浆苦味素、阿魏酸、桔梗皂苷等多种药效成分，具有较强的清热、解毒及抗氧化作用。笔者根据其功效及主治，对其进行抗内毒素药效研究，为临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

T-6紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；电子肛温计购自欧姆龙 (中国) 有限公司；兔固定箱购自北京合力科创科技发展有限公司；显色基质鲎试剂盒、内毒素和吸取试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；脂多糖购自西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司；阿司匹林肠溶片购自大同市利群药业有限责任公司；锦花清热胶囊购自黑龙江省仁合堂药业有限责任公司 (批号20140801)。

1.2 新西兰兔解热实验

1.2.1 实验动物及造模方法

新西兰兔，雄性，体质量为 (2.5±0.4) kg，由哈尔滨医科大学动物中心提供，于动物实验中心适应性饲养3 d后开始实验。选取基础体温为38.2~39.2 ℃的新西兰兔30只，单笼饲养，自由饮水，每天同一时段将新西兰兔固定于兔箱5 h以适应环境，连续3 d，实验前12 h禁食不禁水，实验当日测肛温三次，取均值作为基础体温。测量体温时，将新西兰兔固定于兔箱内，略微抬高兔臀部，将末端涂有少量凡士林的肛温计插入兔肛门约6 cm处测量肛温。通过在兔耳缘静脉注射脂多糖0.02 μg/kg (1 mL/kg) 的方法造模。

1.2.2 动物分组及给药方法

锦花清热胶囊使用时倾出内容物，加蒸馏水制成质量浓度为0.153 g/mL的混悬液，4 ℃保存备用，使用时用蒸馏水适当稀释。将新西兰兔分为五组，即：模型对照组 (等渗氯化钠溶液)，阳性对照组 (阿司匹林0.2 g/kg)，锦花清热胶囊大、中、小剂量组 (分别含生药6.0、3.0、1.5 g/kg)，每组6只。各组动物造模1 h后灌胃给药，给药容积为1 mL/kg，并于30、60、120、180、240、300 min时测量兔肛温，计算体温变化 ( ΔT)。 ΔT=给药后体温-基础体温，其中基础体温为动物造模前正常体温。

1.3 显色基质法检测锦花清热胶囊降解小鼠内毒素作用

1.3.1 实验动物及造模方法

昆明小鼠，雌雄不拘，体质量为 (20.0±2.0) g，由哈尔滨医科大学动物中心提供，于动物实验中心适应性饲养3 d后开始实验。通过在小鼠尾静脉注射脂多糖0.35 mg/kg的方法造模。

1.3.2 动物分组及给药方法

取昆明小鼠50只，分为五组，每组10只，即：模型对照组 (等渗氯化钠溶液)，阳性对照组 (阿司匹林0.2 g/kg)，锦花清热胶囊大、中、小剂量组 (分别含生药6.0、3.0、1.5 g/kg)。各组动物尾静脉注射脂多糖 (0.35 μg/kg) 后1 h灌胃给药。各组分两次取血，5只在给药后30 min取血，5只在给药后60 min取血。

1.3.3 标准曲线可靠性试验与样品测定

(1) 内毒素标准溶液配制：取细菌内毒素工作品一支 (10 EU/支)，按内毒素工作品使用说明书，加细菌内毒素检查用水稀释为10 EU/mL的内毒素溶液，然后进一步稀释为0.10、0.25、0.50和1.00 EU/mL的溶液。

(2) 血液处理：吸取试剂盒配套血液抗凝剂1 mL于无热原试管中，用无热原注射器抽取静脉血1 mL注入无热原试管中并与抗凝剂混匀，置于冰水中，加盖，迅速低温离心2 min (603× g)，吸取上清液0.2 mL，加入0.8 mL配套样本处理液，混匀，封闭管口，70 ℃水浴加热10 min后，冰水浴冷却待用。

(3) 样品测定：取无热原试管，分别加入0.10 mL细菌内毒素检查用水 (阴性对照)、内毒素标准溶液 (供建立标准曲线用) 和待测样品，每组溶液平行管3支。再加入0.10 mL鲎试剂溶液，混匀，37 ℃温育10 min。温育结束加入0.10 mL显色基质溶液，混匀，37 ℃温育6 min。温育结束后，加入0.50 mL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入0.50 mL偶氮化试剂2溶液，混匀，加入0.50 mL偶氮化试剂3溶液，静置5 min，于545 nm波长处读取吸光度值。

1.4 干扰试验检测样品阳性干扰率

阳性对照组：加入高浓度组样品溶液0.05 mL、内毒素1.00 EU/mL (设为λm) 溶液0.05 mL；待测样品组：加入高浓度组样品溶液0.05 mL、细菌内毒素检查用水0.05 mL，每组溶液平行管3支，按1.3.3中的方法操作，测出阳性对照组溶液内毒素浓度值 (设为 Cs)，待测样品组溶液内毒素浓度值 (设为 Ct)。计算该实验条件下回收率 R， R=( Cs- Ct)/ λm×100%。当 R为50%~200%时，认为在此试验条件下待测样品溶液不存在干扰作用。

1.5 统计学方法

采用PASW 18.0软件进行统计学分析。各组数据经方差齐性检验呈正态分布，以均数±标准差 ( x ± s) 表示，组内不同时间点比较采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析， P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后各组动物的体征变化

新西兰兔造模后各组动物体征变化明显，体温持续上升，90 min左右出现耸毛、呼吸加快、舌边尖红等表现，同时可见兔眼、耳朵发红，用手接触兔子的身体会有烫手的感觉，饮水次数增加，且个别家兔出现呼吸急促、鼻煽、躁动等症状，提示造模成功。

2.2 给药后各组动物的体温变化

新西兰兔解热实验结果显示，阳性对照组的体温在给药后30 min与模型对照组比较差异有统计学意义 ( P < 0.05)，提示阿司匹林开始发挥解热作用，且随时间延长，解热效果更明显 ( P < 0.01)，在给药后240 min和300 min时动物恢复至基础体温。与模型对照组比较，锦花清热胶囊大、中剂量组给药后60 min时体温变化差异有统计学意义 ( P < 0.05)，且随时间延长，体温变化更趋向基础体温，到300 min时接近基础体温；锦花清热胶囊小剂量组在给药后120 min之前体温虽有所下降，但不显著，在给药后180 min时体温变化差异有统计学意义 ( P < 0.05)，见 表 1。给药后不同时间间差异有统计学意义 ( F=1372.362, P < 0.01), 时间与锦花清热胶囊剂量之间存在交互效应 ( F=46.697, P < 0.01), 锦花清热胶囊剂量间差异有统计学意义 ( F=121.115, P < 0.01)。从趋势图 ( 图 1) 上看，阳性对照组降温效果最明显，其次为锦花清热胶囊大、中、小剂量组，各组动物体温随时间变化的趋势大致相同，随时间的延长降温趋势愈加明显。

表1 治疗后各组新西兰兔体温变化比较

( x ± s，℃)
组别	n	基础体温	ΔT
30 min	60 min	120 min	180 min	240 min	300 min
模型对照组	6	38.28±0.15	1.40±0.13	1.19±0.10	1.17±0.07	1.12±0.09	0.97±0.07	0.91±0.08
阳性对照组	6	38.38±0.12	1.07±0.14 *	0.68±0.09 *	0.28±0.04 *	0.12±0.02 *	0.06±0.01 *	0.05±0.01 *
大剂量组	6	38.47±0.26	1.19±0.11	0.92±0.09 *#	0.71±0.08 *#	0.43±0.05 *#	0.22±0.03 *#	0.06±0.01 *
中剂量组	6	38.33±0.27	1.22±0.10	1.09±0.11 *#	0.93±0.09 *#	0.78±0.06 *#	0.54±0.04 *#	0.41±0.02 *#
小剂量组	6	38.54±0.23	1.29±0.12	1.17±0.08 #	1.03±0.10 #	0.89±0.07 *#	0.75±0.05 *#	0.59±0.04 *#

与模型对照组比较， ^* P < 0.05；与阳性对照组比较， ^# P < 0.05.

2.3 各组标准曲线可靠性试验结果

根据吸光度值 ( y) 与内毒素标准品浓度 ( x) 得到回归方程： y=0.7499x+0.0669， r=0.9932(>0.980)，两变量的相关性较好，且样品组的吸光度值大于阴性对照组，故内毒素标准品浓度在0.1~1.0 EU/mL范围内试验结果有效。

2.4 给药后各组干扰试验结果

显色基质法实验结果显示，按初始浓度 λm=0.50 EU/mL计算，各组样品 R分别为133%、116%、128%，均在50%~200%范围内，提示在此实验条件下各组样品溶液不存在干扰作用。

2.5 各组内毒素测定结果

各组分别在给药后30、60 min测得吸光度值见 表 2，通过回归方程计算内毒素浓度，设药物对内毒素的降解率为 D， Co表示模型对照组的内毒素浓度， Ct表示锦花清热胶囊各剂量组的内毒素浓度，则 D=( Co- Ct)/ Co×100%。结果显示，各组降解率给药后30、60 min时组间差异均有统计学意义 ( F=287.723、655.066， P < 0.05)。提示锦花清热胶囊在小鼠体内能减少内毒素的作用，且存在量效关系。

表2 各组内毒素测定结果比较

( x ± s)
组别	n	30 min		60 min
吸光度值	内毒素浓度 (EU/mL)	内毒素降解率 (%)	吸光度值	内毒素浓度 (EU/mL)	内毒素降解率 (%)
模型对照组	5	0.718±0.010	0.869±0.013	0		0.661±0.013	0.793±0.017	0
阳性对照组	5	0.294±0.006	0.302±0.008	65.16±1.46		0.190±0.013	0.164±0.017	79.34±1.86
大剂量组	5	0.349±0.020	0.376±0.026	56.73±3.12		0.169±0.007	0.137±0.009	82.76±1.00
中剂量组	5	0.411±0.015	0.458±0.020	47.23±1.77		0.276±0.012	0.279±0.016	64.75±1.77
小剂量组	5	0.581±0.012	0.685±0.016	21.08±2.30		0.434±0.015	0.490±0.019	38.21±1.57

3 讨论

咽干、咽痛、音哑、痰热、咳嗽是常见病和多发病，久症不愈会转为慢性病或高危病症，危及患者的健康和生命。化学药物治疗虽疗效显著，但常伴有较强的不良反应，而中药虽显效慢，但疗效确切，副作用小。我国传统中医理论认为，外邪、热毒是致病的重要原因。锦花清热胶囊根据中医治法治则，具有清热解毒、疏散风热、生津利咽、消肿散结作用，并且毒副作用小，可以提高患者用药的安全性。我们对锦花清热胶囊的解热和抗内毒素作用进行了实验研究。

本研究采用脂多糖来制作动物发热模型。脂多糖是脂质与多糖的复合物，为细菌内毒素的主要成分，注入动物体内后作用于巨噬细胞等，释放的细胞因子作用于下丘脑的体温调节中枢核苷酸系统，使体内前列腺素E合成增加，从而导致发热，是公认的致热源之一。由于各种动物机体对内毒素的反应差异很大，引起动物发热的剂量也差异极大，因此本文对新西兰兔与昆明小鼠选用不同的内毒素剂量。

锦花清热胶囊对脂多糖所致新西兰兔发热实验结果显示，锦花清热胶囊小、中、大剂量组具有不同程度的解热作用，小剂量组效果偏弱，中、大剂量组效果增强，且大剂量组在给药后300 min时作用效果已经较为理想，降温效果接近阳性对照组，说明锦花清热胶囊具有明显的解热作用，并且量效关系明确。锦花清热胶囊解热作用的机制可能是通过所含的金银花成分下调IL-1β诱导前列腺素E受体3表达 ^{[ 11]} ，从而影响下丘脑对体温中枢的作用而实现的；连翘可下调下丘脑中环腺苷酸 (cAMP) 含量 ^{[ 12]} ，亦可降低动物体温。

在小鼠显色基质法实验中，给药后30 min时，阳性对照组的内毒素降解率最高，其次是锦花清热胶囊大、中、小剂量组；给药后60 min时，锦花清热胶囊大剂量组的内毒素降解率最高，其次是阳性对照组，锦花清热胶囊中、小剂量组。由此可见，锦花清热胶囊对小鼠体内内毒素的降解有明显作用。

随着大众对中医药治疗的认同，中医药的市场需求会越来越大，开发高效、低毒的中药既能满足市场需求，为大众提供安全药品、推动中药现代化，又能服务社会大众，带来良好的社会效益。锦花清热胶囊具有抗内毒素作用，能有效降低发热新西兰兔体温，以及降低小鼠体内内毒素活性，疗效确切显著，可用于治疗由外邪、热毒引起的咽干、咽痛、音哑以及由于痰热、外邪内毒感冒所致的咳嗽等疾病，是一种良好的中药复方制剂。

Funding Statement

黑龙江省应用技术研究与开发计划引导项目（GC13C121）