孕早期增塑剂DEHP暴露降低长链非编码RNA RP24-315D19.10表达影响子宫内膜蜕膜反应

Abstract

目的

探索孕早期增塑剂邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）暴露对小鼠子宫内膜蜕膜反应的影响及长链非编码RNA RP24-315D19.10的作用。

方法

构建DEHP（1000 mg·kg^－1·d^－1）暴露的早孕小鼠模型，取妊娠第6天子宫，通过苏木精-伊红染色和免疫荧光检测其对小鼠子宫内膜蜕膜区病理变化及相关分子表达。构建DEHP暴露（0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μmol/L）的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型，通过光学显微镜和鬼笔环肽染色观察细胞形态变化，免疫荧光、实时逆转录PCR、蛋白质印迹法检测蜕膜反应标志蛋白的表达情况。实时逆转录PCR分别检测RP24-315D19.10在蜕膜组织和蜕膜细胞中的表达。利用在线工具lncLocator和RNA荧光原位杂交检测RP24-315D19.10的细胞定位，并运用在线工具AnnoLnc2预测与RP24-315D19.10相结合的微RNA（miRNA）。

结果

DEHP暴露组的胚胎着床点数、子宫湿重、子宫面积显著低于空白对照组，蜕膜反应标志蛋白基质金属蛋白酶、同源异型框A10的表达也明显少于空白对照组（均P<0.05）。随着DEHP浓度增加，蜕膜细胞中dtprp的表达逐渐降低。2.5 μmol/L DEHP暴露组中基质细胞向蜕膜细胞的形态转化受到明显抑制，蜕膜反应标志蛋白同源异型框A10、骨形成蛋白2及增殖细胞核抗原表达水平显著低于空白对照组（均P<0.05）。DEHP暴露的蜕膜组织和蜕膜细胞中RP24-315D19.10的表达显著减少（均P<0.05）。RP24-315D19.10主要定位于细胞质，与45个miRNA有潜在结合位点，其中miR-138-5p、miR-155-5p、miR-183-5p及miR-223-3p与子宫内膜蜕膜反应有关。

结论

孕早期DEHP暴露导致小鼠蜕膜反应损伤可能与RP24-315D19.10表达下调有关。

DEHP是一种在塑料制品中广泛应用的增塑剂，由于其较弱的非共价结合能力，在环境中普遍存在^［1］，可通过消化道摄入、呼吸道吸入及皮肤接触等途径进入人体并在体内富集^［2］。研究发现，DEHP具有抗雄激素活性作用，可导致男性睾丸发育不良、精子畸形、精子数减少^［3］。DEHP也具有增强雌激素活性作用^［4］，可引起性激素分泌紊乱^［5］，改变卵巢和子宫功能，进一步引发多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等疾病^［6］。有研究发现，孕期DEHP暴露可导致低出生体重及妊娠失败等不良妊娠结局^［7］。

子宫内膜蜕膜反应是指子宫内膜从不接受态转化为支持胚胎植入的接受态而进行的一系列形态和功能转变，以适应胚胎的侵袭和生长，是成功妊娠的关键因素。母体蜕膜反应缺陷会导致先兆子痫、复发性流产等不良妊娠结局^［8］。前期研究发现，孕早期DEHP暴露可导致小鼠子宫内膜容受性降低和着床胚胎数减少^［9］，而DEHP暴露导致的着床胚胎数减少是否与子宫内膜的蜕膜反应有关目前尚未可知。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸、不具有蛋白质编码潜能的RNA转录本^［10］。lncRNA在多种生物过程和疾病中发挥着关键作用，包括细胞分化、组织器官发育、癌症转移等^［11］。越来越多的研究证据表明，lncRNA在子宫内膜蜕膜反应中发挥重要作用^［12-13］。目前有研究发现DEHP可能调控lncRNA的表达^［14］，同时发现lncRNA RP24-315D19.10可通过hnRNPA2B1促进子宫内膜蜕膜反应^［15］。那么孕早期DEHP暴露是否通过调控RP24-315D19.10的表达从而影响子宫内膜蜕膜反应？本研究通过构建DEHP暴露的早孕小鼠模型及小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜反应诱导模型，通过体内、体外实验探索DEHP暴露对小鼠子宫内膜蜕膜反应的影响及lncRNA RP24-315D19.10在其中发挥的作用。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂和仪器

DEHP和玉米油为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；无酚红DMEM/F-12培养基、胰蛋白酶、雌二醇、孕酮、牛血清白蛋白和TriZol裂解液为美国Sigma-Aldrich公司产品；碳吸附胎牛血清为以色列Biological Industries公司产品；胶原酶为美国Gibco公司产品；HBSS、柠檬酸钠抗原修复液、HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗小鼠IgG为武汉博士德生物工程有限公司产品；HE染色试剂盒、PBS粉末、封闭用羊血清和小鼠单克隆抗体β-actin为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；兔单克隆抗体MMP9和HOXA10抗体为美国CST公司产品；兔多克隆抗体BMP2为英国Abcam公司产品；异硫氰酸标记的鬼笔环肽为美国Thermo Fisher公司产品；RIPA裂解液、抗荧光淬灭封片液（含DAPI）为上海碧云天生物技术有限公司产品；PCR试剂盒和逆转录试剂盒为日本TaKaRa公司产品；引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司；FISH试剂盒（含探针）为上海吉玛制药技术有限公司产品。荧光定量PCR仪、凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品；光学显微镜照相系统为日本Olympus公司产品；激光共聚焦显微镜为日本Nikon公司产品。

1.2. 动物实验

1.2.1. 动物来源及分组干预

7~8周龄无特定病原体级雌雄CD-1小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号SCXK（京2021-0006）］。小鼠在温度（22±2）℃、12 h光照/12 h黑暗环境中饲养，自由摄食和饮水。下午5:00将动情期CD-1雌鼠与同品系雄鼠按3∶1比例进行合笼交配，次日上午9:00查出阴道栓的雌鼠记妊娠第1天。将妊娠小鼠随机分为空白对照组和DEHP暴露组。从妊娠第1天至妊娠第5天，每天上午通过灌胃的方式分别给予玉米油和用玉米油配制的DEHP（1000 mg·kg^－1·d^－1）^［9］。于妊娠第6天上午处死小鼠，取出相应的子宫组织进行拍照、称重及包埋，剩余组织在－80 ℃冰箱中保存备用。研究过程遵循重庆医科大学伦理委员会准则（20200408），研究方案通过重庆医科大学伦理委员会审查（IACUC-CQMU-2023-01017）。

1.2.2. HE染色观察子宫内膜蜕膜区病理学变化

将组织切片依次放入二甲苯1、2中浸泡脱蜡各1 h（56 ℃）；将组织切片依次置于100%、100%、95%、85%、75%乙醇中浸泡5 min进行水化，流水浸泡5 min；将组织切片置于苏木精染液中浸染2~3 min进行细胞核染色，流水冲洗去除多余蓝色染液；盐酸乙醇分色1 s，饱和碳酸锂返蓝10 s；伊红染液浸泡15 s进行细胞质染色，流水冲洗去除多余红色染液，于显微镜下观察染色情况；将玻片置于37 ℃烤箱中30 min，再放于二甲苯1、2中各透明5 min；使用中性树胶进行封片，室温晾干保存。

1.2.3. 免疫荧光法观察子宫内膜蜕膜区蜕膜标志蛋白MMP9和HOXA10表达

将组织切片放入二甲苯1中浸泡过夜，然后放入二甲苯2中浸泡4 h（56 ℃）脱蜡；将组织切片依次置于100%、100%、95%、85%、75%乙醇中浸泡5 min进行水化，流水浸泡10 min后，三蒸水浸泡10 min；将组织切片插入柠檬酸钠抗原修复液中，于微波炉中高火加热至沸腾4~5 min，中低火间断沸腾15 min，自然冷却至室温；PBS浸洗三次后，滴加封闭用羊血清，37 ℃水浴锅封闭70 min；滴加一抗（MMP9、HOXA10），37 ℃水浴过夜；次日PBS洗片后滴加荧光二抗，于37 ℃水浴锅孵育70 min；PBS清洗组织切片后，使用含DAPI的抗荧光淬灭剂进行细胞核染色及封片，4 ℃下避光保存。

1.2.4. 实时逆转录PCR检测子宫内膜RP24-315D19.10表达

使用TriZol提取小鼠子宫内膜组织总RNA，并检测其浓度和纯度。使用PrimerScript RT^TM Master Mix逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq^TMⅡ（TliRNaseH Plus）试剂盒在荧光定量PCR 仪上进行实时荧光定量PCR，以β-actin作为总RNA内参，采用2^－ΔΔCt法计算各基因的相对表达量，引物序列见表1。

表1.

引物及探针序列

基因（方法）	序列（5$\mathrm{´}$→3$\mathrm{´}$）
β-actin（实时逆 转录PCR）	正向：GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG
	反向：ATGCCACAGGATTCCATACC
dtprp（实时逆 转录PCR）	正向：TACCCACGTAAGGTCATC
	反向：CTCAGAGCCAGAAATCA
RP24-315D19.10（实时逆 转录PCR）	正向：TTGCTTGCTGTGGCTGCTTCTC
	反向：GGCAGAACACTCCGACACATA CAG
18S（FISH）	CTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTC
RP24-315D19.10 （FISH）	TGA+TGATGGC+TGTAAAGCA+TAG GGCAA

PCR：聚合酶链反应；dtprp：蜕膜催乳素相关蛋白；FISH：荧光原位杂交.

1.3. 细胞实验

1.3.1. 原代小鼠子宫内膜基质细胞的来源及分组干预

7~8周龄雌性昆明小鼠购买并代养于重庆医科大学动物实验中心［实验动物生产许可号SCXK（渝）2018-0003，实验动物使用许可号SYXK（渝）2018-0003］。按照文献［16］报道的方法分离原代小鼠子宫内膜基质细胞，具体步骤如下：①取8周龄昆明雌鼠脱颈处死，取子宫组织，HBSS缓冲溶液清洗后剪碎；②加入适量胰蛋白酶，4 ℃中消化2 h，37 ℃中继续消化30 min；③枪头反复吹打组织10 min，加入适量胶原酶，37 ℃消化30 min；④70 μm滤器过滤消化后的组织，取滤液进行离心并用HBSS清洗；⑤弃上清液，取2 mL 20%培养基（含20%血清、青-链霉素及两性霉素、DF12 培养基）重悬细胞；⑥六孔板每孔加入约100 μL细胞悬液，使细胞数保持在（3~4）×10⁵个，20%培养基培养；⑦细胞贴壁1 h后用HBSS清洗两次，更换培养基，置于5%二氧化碳、37 ℃孵箱中培养。

原代小鼠子宫内膜基质细胞分组分别加入0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μmol/L DEHP，构建DEHP暴露的体外蜕膜诱导细胞模型，并设空白对照组。依据文献［17］报道的方法，加入10 nmol/L雌二醇和1 μmol/L孕酮对细胞进行蜕膜诱导，每24 h更换一次培养基，连续暴露72 h后收集细胞在光学显微镜下观察并进行后续实验。

1.3.2. 实时逆转录PCR检测子宫内膜基质细胞蜕膜标志基因dtprp和RP24-315D19.10表达

按上述方法构建DEHP暴露的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型，细胞处理72 h后加入TriZol提取细胞总RNA，并检测其浓度和纯度。使用PrimerScript RT^TM Master Mix逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq^TMⅡ（TliRNaseH Plus）试剂盒在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应，以β-actin作为总RNA内参，采用2^－ΔΔCt法计算各基因的相对表达量，引物序列见表1。

1.3.3. 鬼笔环肽染色观察子宫内膜基质细胞骨架形态

将分离得到的小鼠子宫内膜基质细胞接种到无菌细胞爬片上，按上述方法构建DEHP暴露的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型；加入4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗三次；使用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽避光染色1 h；PBS清洗细胞爬片后，使用含DAPI的抗荧光猝灭剂进行细胞核染色及封片，4 ℃避光保存。

1.3.4. 免疫荧光法观察子宫内膜基质细胞中蜕膜标志蛋白BMP2表达

将分离得到的原代小鼠子宫内膜基质细胞接种到无菌细胞爬片上，按上述方法构建DEHP暴露的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型；加入4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗三次；加入0.5% TritonX-100室温通透10 min，PBS清洗三次；加入5%牛血清白蛋白于37 ℃水浴锅封闭1 h；加入一抗（BMP2）后，4 ℃孵育过夜；次日PBS洗片后加入荧光二抗，37 ℃水浴锅避光孵育1 h；PBS清洗细胞爬片后，使用含DAPI的抗荧光淬灭剂进行细胞核染色及封片，4 ℃避光保存。

1.3.5. 蛋白质印迹法检测子宫内膜基质细胞中蜕膜标志蛋白表达

按上述方法构建DEHP暴露的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型，细胞处理72 h后加入蛋白裂解液收集细胞蛋白样品，根据蛋白相对分子质量配制相应浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶，调整电压至80 V进行电泳；将凝胶转移至PVDF膜上，调整电流至250 mA进行电转，电转时间根据目的蛋白相对分子质量而定（蛋白相对分子质量∶电转时间=1∶1.0~1.5）；使用5%脱脂牛奶37 ℃摇床封闭1.5 h，一抗4 ℃孵育过夜；次日使用PBST洗三次后，二抗37 ℃摇床孵育1 h；采用化学发光法进行凝胶成像仪显色与图像采集，采用QuantityOne 4.5.0进行灰度值分析。

1.4. 在线工具lncLocator2.0和RNA FISH检测细胞中RP24-315D19.10定位

利用在线工具lncLocator2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator2/index.html）预测RP24-315D19.10的细胞定位。同时，进一步利用RNA FISH验证RP24-315D19.10的细胞定位，按照RNA FISH试剂盒（SA-Biotin系统）操作说明进行实验，步骤如下：①将分离得到的小鼠子宫内膜基质细胞接种到无菌细胞爬片上，按上述方法构建DEHP暴露的原代小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型；②加入4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗两次；③加入0.5% TritonX-100室温通透15 min，PBS清洗两次；④加入1×封闭液于37 ℃水浴锅封闭30 min；⑤加入2×缓冲液C，37 ℃培养箱放置30 min；⑥缓冲液E提前在73 ℃水浴锅孵育30 min至澄清透亮；⑦将RP24-315D19.10杂交探针储存液稀释至1 μmol/L，放入75 ℃水浴锅变性10 min，然后将SA-Cy3按比例加入PBS中，37 ℃孵育30 min；⑧将上述10 μL探针工作液和90 μL缓冲液E混匀，加入孔板中，于37 ℃培养箱避光杂交过夜；⑨次日吸弃探针混合液，加入0.1%缓冲液F于37 ℃避光洗涤10 min；⑩加入 2×缓冲液C，60 ℃避光洗涤三次，每次10 min；⑪加入2×缓冲液C，37 ℃避光洗涤三次，每次10 min；⑫在洁净载玻片上滴加含DAPI的荧光抗淬灭剂，将细胞爬片从孔板中取出后倒扣于载玻片上，封片胶封片后于荧光显微镜下观察。RP24-315D19.10杂交探针序列见表1。

1.5. 在线工具AnnoLnc2预测与RP24-315D19.10相结合的miRNA

利用在线工具AnnoLnc2（http：//annolnc.gao-lab.org/index.php）预测与RP24-315D19.10相结合的miRNA，使用Cytoscape3.6.1构建lncRNA-miRNA共表达网络，通过检索相关文献筛选与蜕膜反应相关的miRNA。

1.6. 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布的计量数据以均数±标准差（$\overline{x}\pm s$）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 孕早期DEHP暴露导致孕鼠胚胎着床点数减少

与空白对照组比较，妊娠第6天DEHP暴露组的胚胎在子宫两侧分布稀疏且不均匀，胚胎拥挤生长（图1），统计胚胎着床点数发现，DEHP暴露组胚胎着床点数显著少于空白对照组，分别为（13.43±1.27）和（11.86±1.57）（P<0.05）。结果表明，孕早期DEHP暴露导致小鼠胚胎着床点数减少。

图1. DEHP暴露组和空白对照组孕第6天胚胎着床大体图.

空白对照组胚胎分布均匀，无拥挤生长；而DEHP暴露组胚胎在子宫两侧分布，或稀疏或拥挤生长，呈不均匀分布. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯.

2.2. 孕早期DEHP暴露导致孕鼠子宫内膜蜕膜反应损伤

DEHP暴露组子宫湿重显著低于空白对照组，分别为（0.22±0.02）和（0.19±0.01）g（P<0.01），子宫面积也显著小于空白对照组，分别为（1.39±0.15）和（1.22±0.23）cm²（P<0.05）。HE染色结果显示，空白对照组蜕膜组织中细胞大而圆、排列紧密、细胞质丰富且染色均匀，而DEHP暴露组蜕膜组织质地疏松，细胞较小且蜕膜区面积明显变小，见图2。免疫荧光结果显示，DEHP暴露组中蜕膜标志蛋白MMP9和HOXA10主要分布在非蜕膜区，其在蜕膜区的表达比空白对照组明显降低，见图3。以上结果表明，孕早期DEHP暴露可导致小鼠子宫内膜蜕膜反应损伤。

图2. DEHP暴露孕鼠孕第6天子宫内膜蜕膜区病理学改变（HE染色）.

黄色方框指示蜕膜区，空白对照组蜕膜组织中细胞大而圆、排列紧密且细胞质丰富，而DEHP暴露组蜕膜组织质地疏松，细胞较小且蜕膜区面积明显变小；左图标尺=100 μm，右图标尺=50 μm. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯.

图3. DEHP暴露孕鼠孕第6天子宫内膜蜕膜标志蛋白MMP9、HOXA10表达（免疫荧光染色）.

空白对照组MMP9和HOXA10分布广泛且主要分布在蜕膜区，而DEHP暴露组中MMP9和HOXA10主要分布在非蜕膜区，其在蜕膜区的表达明显少于空白对照组. 标尺=100 μm. DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚；MMP：基质金属蛋白酶；HOXA10：同源异形框A10.

2.3. DEHP暴露导致小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜反应损伤

基于体外构建DEHP暴露的小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜诱导模型，实时逆转录PCR检测dtprp表达结果，随着DEHP浓度从0.1、0.5 μmol/L增加至2.5、12.5、62.5 μmol/L，蜕膜细胞中dtprp的表达分别从0.81±0.74、0.56±0.41减少至0.30±0.24、0.16±0.2、0.10±0.16。其中，与空白对照组（1.00±0.73）比较，2.5、12.5、62.5 μmol/L DEHP暴露蜕膜细胞中dtprp表达均显著减少（均P<0.01）。选择2.5 μmol/L DEHP构建的DEHP暴露组进行后续研究。

光学显微镜观察细胞形态发现，空白对照组和DEHP暴露组的小鼠子宫内膜基质细胞在0 h时均为成纤维样梭形，胞体小，放射状生长；体外诱导72 h后，空白对照组细胞变大变圆，细胞质丰富，呈现明显的蜕膜样变化，而DEHP暴露组细胞仍呈扁平梭形，细胞质不丰富，蜕膜反应不明显。见图4。通过鬼笔环肽对细胞的纤维状肌动蛋白进行荧光染色发现，与空白对照组比较，DEHP暴露组细胞骨架明显变小、双核细胞数减少，蜕膜反应明显受抑制（图5）。免疫荧光结果显示蜕膜标志蛋白BMP2在DEHP暴露组中的表达明显低于空白对照组（图6）。蛋白质印迹法结果显示，DEHP暴露组中蜕膜标志蛋白HOXA10、BMP2及增殖标志蛋白PCNA蛋白表达均比空白对照组减少（均P<0.05），见图7、表2。以上结果表明，DEHP暴露抑制了小鼠子宫内膜基质细胞的体外蜕膜反应。

图4. DEHP暴露组和空白对照组子宫内膜基质细胞显微镜下形态.

空白对照组和DEHP暴露组的子宫内膜基质细胞在0 h时均为成纤维样梭形，胞体小，放射状生长；体外诱导72 h后，空白对照组细胞变大变圆，细胞质丰富，呈现明显的蜕膜样变化，而DEHP暴露组细胞仍呈扁平梭形，细胞质不丰富，蜕膜反应不明显.标尺=20 μm. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯.

图5. DEHP暴露组和空白对照组细胞骨架形态（鬼笔环肽染色）.

空白对照组蜕膜细胞细胞核大而圆、细胞质丰富，而DEHP暴露组细胞骨架明显变小、双核细胞数减少. 标尺=50 μm. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯；DAPI：4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚.

图6. DEHP暴露组和空白对照组细胞蜕膜标志蛋白BMP2表达（免疫荧光染色）.

与空白对照组比较，DEHP暴露组中BMP2表达明显减少，分布范围明显缩小. 标尺=50 μm. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯；BMP：骨形成蛋白；DAPI：4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚.

图7. DEHP暴露组和空白对照组细胞蜕膜标志蛋白HOXA10、BMP2及增殖标志蛋白PCNA蛋白表达电泳图.

DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯；HOXA10：同源异形框A10；BMP：骨形成蛋白；PCNA：增殖细胞核抗原.

表2.

DEHP暴露组与空白对照组子宫内膜蜕膜细胞HOXA10、BMP2及PCNA蛋白表达量比较

组 别	n	HOXA10	BMP2	PCNA
空白对照组	4	0.52±0.32	0.51±0.17	0.93±0.23
DEHP暴露组	4	0.35±0.34*	0.37±0.08*	0.63±0.35*

与空白对照组比较，^*P<0.05. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯；HOXA10：同源异形框A10；BMP：骨形成蛋白；PCNA：增殖细胞核抗原.

$\overline{x}\pm s$

2.4. DEHP暴露导致孕鼠蜕膜组织及蜕膜细胞中RP24-315D19.10表达下调

实时逆转录PCR检测体内和体外模型中子宫内膜RP24-315D19.10的表达发现，DEHP暴露组蜕膜组织及蜕膜细胞中RP24-315D19.10表达相比空白对照组均显著降低（均P<0.05），见表3。结果提示，DEHP暴露下调RP24-315D19.10的表达可能与孕鼠子宫内膜基质细胞蜕膜反应损伤有关。

表3.

DEHP暴露组与空白对照组蜕膜组织和蜕膜细胞lncRNA RP24-315D19.10表达量

组 别	蜕膜组织（n=6）	蜕膜细胞（n=11）
空白对照组	0.99±0.32	1.12±0.91
DEHP暴露组	0.53±0.23*	0.41±0.33*

与空白对照组比较，^*P<0.05. DEHP：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯.

$\overline{x}\pm s$

2.5. 细胞中RP24-315D19.10定位及其结合的miRNA预测

lncLocator预测结果显示，RP24-315D19.10主要定位于细胞质，可能性约为0.66。通过RNA FISH对RP24-315D19.10在小鼠子宫内膜蜕膜细胞中的定位进行验证发现，RP24-315D19.10主要分布在细胞质中，且在DEHP暴露组中表达下调（图8）。通过在线预测工具AnnoLnc2对可能与RP24-315D19.10相结合的miRNA进行预测，发现有45个可能与其结合的miRNA（图9），其中miR-138-5p、miR-155-5p、miR-183-5p及miR-223-3p与子宫内膜蜕膜反应有关。以上结果提示，RP24-315D19.10可能与miRNA结合进而影响子宫内膜蜕膜反应。

图8. RP24-315D19.10在子宫内膜蜕膜细胞的亚细胞定位（免疫组织化学染色）.

RNA荧光原位杂交发现RP24-315D19.10主要分布在细胞质中，DEHP暴露组RP24-315D19.10表达下调但不改变其细胞定位. 标尺=50 μm.

图9. AnnoLnc2预测与RP24-315D19.10潜在结合的miRNA网络图.

3. 讨论

DEHP作为一种环境内分泌干扰物，在生物体内发挥类雌激素作用，可导致雌激素生物合成通路中断和下丘脑-垂体-卵巢轴失衡^［18］，从而引起青春期提前、生育能力下降、流产率增加、胎儿生长受限等雌性生殖系统损害^［19-20］。与男性相比，女性在日常生活中更多暴露于含有DEHP的化妆品和洗涤用品中，导致女性的DEHP暴露量增加。Aimuzi等^［21］研究表明，DEHP暴露可能与不明原因的复发性流产风险增加有关。Santos等^［22］发现，妊娠期DEHP暴露会导致胎儿生长受限及低出生体重。Li等^［9］研究发现，1000 mg·kg^－1·d^－1 DEHP暴露导致小鼠胚胎着床数相比对照组显著减少，DEHP暴露可导致胚胎着床受损。而子宫内膜蜕膜反应的正常进行对胚胎着床、妊娠建立和维持起着至关重要作用^［23］。且Lavogina等^［24］研究发现，存在于育龄妇女血液循环中的内分泌干扰物可以抑制体外人子宫内膜基质细胞的蜕膜反应。故本研究对1000 mg·kg^－1·d^－1 DEHP暴露的孕第6天小鼠胚胎着床点数、子宫湿重、子宫面积、蜕膜区面积和蜕膜标志蛋白的表达情况进行分析发现，与正常小鼠比较，DEHP暴露小鼠的这些指标均不同程度抑制，证实DEHP暴露会损伤小鼠子宫内膜蜕膜反应。本研究还构建了DEHP暴露的小鼠子宫内膜基质细胞体外蜕膜诱导模型，进一步验证DEHP暴露对子宫内膜基质细胞蜕膜反应的影响。细胞形态及蜕膜标志蛋白的表达情况均表明，DEHP暴露显著抑制了子宫内膜基质细胞蜕膜反应。

lncRNA在表观遗传控制和转录、翻译、RNA代谢调控、干细胞维持与分化、细胞自噬与凋亡、胚胎发育等方面发挥着重要作用^［25］。研究表明，lncRNA也参与了子宫内膜蜕膜反应过程，如lncRNA Hand2os1在小鼠妊娠第6~8天蜕膜细胞中表达明显上调，并且过表达Hand2os1显著增加了蜕膜标志蛋白Prl8a2和Prl3c1的表达，促进了子宫内膜基质细胞的体外蜕膜反应^［26］。lncRNA lncSAMD11-1：1与PIP4K2A的相互作用可能通过抑制Akt和FoxO1的磷酸化来稳定FoxO1的核定位，从而促进蜕膜反应^［27］。同样，课题组前期研究发现RP24-315D19.10参与子宫内膜蜕膜反应调控^［15］。本研究进一步探索DEHP暴露是否通过调控RP24-315D19.10表达影响子宫内膜蜕膜反应。通过实时逆转录PCR检测RP24-315D19.10在蜕膜组织及蜕膜细胞中的表达发现，DEHP暴露导致RP24-315D19.10的表达显著下调。在线预测工具lncLocator及RNA FISH发现RP24-315D19.10主要定位在细胞质，且DEHP暴露不影响其细胞定位。lncRNA的功能与其亚细胞定位密切相关，细胞核中lncRNA在表观遗传和转录水平调控基因表达，细胞质中lncRNA在转录后和翻译水平调控基因表达^［28］。在细胞质中，lncRNA主要通过与miRNA竞争性结合，作为miRNA海绵抑制相应miRNA与靶mRNA的结合，进而促进靶mRNA的翻译^［29］。故本研究通过AnnoLnc2预测发现可能与RP24-315D19.10结合的miRNA有45个，这45个miRNA参与多种生物学过程，如miR-9-5p、miR-214-5p等与癌症的增殖、侵袭和转移相关，miR-129-5p、miR-135-5p等与成骨分化、再生相关，miR-199-5p与精子发生相关^［30-32］。有研究表明，miR-138-5p在人蜕膜基质细胞中可通过调节GPR124以及激活炎症小体NOD样受体蛋白3、IL-18和IL-1β信号调节胚胎着床和早期妊娠^［33］。miR-155-5p可以促进蜕膜基质细胞的生长和增殖，同时还可以通过抑制核因子κB信号通路抑制蜕膜基质细胞凋亡^［34］。miR-183-5p可能通过下调其靶蛋白CTNNA2的表达调控小鼠子宫内膜容受性，进一步促进胚胎着床^［35］。miR-223-3p在子宫中可靶向LIF，抑制LIF蛋白表达和胞饮突形成，这可能导致胚胎着床数减少和子宫容受性降低^［36］。这些miRNA都直接或间接参与了子宫内膜蜕膜反应调控，提示RP24-315D19.10可能与miRNA相互作用从而参与DEHP暴露对子宫内膜蜕膜反应的损伤。而RP24-315D19.10具体靶向哪个miRNA从而参与调控DEHP引起的蜕膜反应损伤仍须进一步探索。

综上所述，本研究初步探讨了lncRNA RP24-315D19.10在孕早期DEHP暴露对小鼠子宫内膜蜕膜反应损伤中发挥的作用，从而为后续深入探讨RP24-315D19.10介导的竞争内源性RNA网络调节子宫内膜蜕膜反应的具体机制提供了依据，而RP24-315D19.10靶向的具体miRNA仍有待后续进一步探索。

［缩略语］

邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯［di（2-ethyl）hexyl phthalate， DEHP］；长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）；微RNA（microRNA，miRNA，miR）；异质核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2B1）；杜氏改良培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）；Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）；苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）；同源异形框A10（homeobox A10，HOXA10）；骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）；4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚（4$\mathrm{´}$，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）；蜕膜催乳素相关蛋白（decidual prolactin-related protein，dtprp）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene-fluoride，PVDF）；含吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST）；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）；叉头框蛋白O1（Forkhead box protein O1，FoxO1）；白介素（interleukin，IL）；白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests