补肾化痰方通过调控肠道菌及PPARγ通路治疗多囊卵巢综合征的机制

Abstract

目的

探究补肾化痰方对多囊卵巢综合征（PCOS）模型小鼠肠道菌群多样性的调节作用及其治疗PCOS的相关机制。

方法

24只无特定病原体级成年雌性C57BL/6J小鼠随机分为三组：空白对照组、模型对照组（使用来曲唑联合高脂饲料诱导）、中药治疗组（造模结束后连续灌服补肾化痰方混悬液35 d）。采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠性激素水平；苏木精-伊红染色后光镜下观察卵巢形态；收集各组小鼠结肠内粪便，采用16S rRNA测序进行肠道菌群检测；气相色谱-质谱法检测短链脂肪酸含量；免疫组织化学法检测结肠过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）表达；实时逆转录聚合酶链反应法检测肠道上皮黏蛋白2、闭合蛋白1和紧密连接蛋白1（ZO-1）、PPARγ的mRNA表达；蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、PPARγ蛋白表达。

结果

与空白对照组比较，模型对照组体重、血清卵泡刺激素、黄体生成素和睾酮水平均升高，血清雌二醇水平降低（均P<0.01），光镜下卵巢结构符合PCOS病理特征；中药治疗组血清性激素水平和卵巢结构较模型对照组改善。模型对照组肠道菌群多样性较空白对照组发生变化。与空白对照组比较，在门水平，模型对照组厚壁菌丰度下降，疣微菌、变形菌、放线菌丰度升高（均P<0.05）；在属水平，模型对照组乳酸菌丰度显著下降，阿克曼菌、乳梭菌、乳球菌、产粪甾醇真细菌丰度升高（均P<0.05）。补肾化痰方治疗后小鼠肠道菌群紊乱状态得到一定程度的改善。与空白对照组比较，模型对照组粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量均下降（均P<0.05），而中药治疗组乙酸、丙酸、丁酸含量较模型对照组均增加，其中丙酸和丁酸含量与模型对照组差异有统计学意义（均P<0.05）。与空白对照组比较，模型对照组肠道PPARγ表达降低，ZO-1 mRNA表达增加，黏蛋白2、闭合蛋白1 mRNA表达减少，iNOS蛋白表达增加（均P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组PPARγ 蛋白表达增加，闭合蛋白1、黏蛋白2 mRNA表达显著增加（均P<0.05），ZO-1 mRNA表达减少，iNOS蛋白表达减少。

结论

来曲唑联合高脂饲料诱导的PCOS小鼠存在菌群失调状态，补肾化痰方通过调节肠道菌群种属分布可能有助于提高短链脂肪酸水平从而激活肠PPARγ通路，改善肠屏障功能，达到治疗PCOS的目的。

PCOS是育龄期妇女常见的生殖内分泌疾病，是无排卵性不孕的主要原因^［1］，严重影响女性的生殖与心理健康。中医药治疗PCOS历史悠久，具体可分为辨证分型治疗、调周法治疗、经验方治疗、针药结合、中西医结合治疗等^［2］。国医大师夏桂成教授经过六十余年的临床实践，认为 PCOS病机以肾虚为本、痰湿为标，因此创制补肾化痰方。临床研究证实，该方能降低PCOS患者高雄激素水平，显著改善胰岛素抵抗，促进卵泡发育，从而提高临床妊娠率^［3-4］，其机制可能与激活PPARγ/Akt通路有关^［5］。

随着肠道菌群与疾病的相关性逐渐成为研究热点，肠道菌群失衡与PCOS之间关系也受到研究者们的关注。研究表明，PCOS患者肠道微生物群的组成发生了变化，肠道菌群可能参与并影响PCOS的发展过程^［6］。PCOS患者肠道菌群的失调主要表现为α多样性减少、兼性厌氧菌丰度增加，产生脂多糖的细菌增加、形成孢子的物种减少，代谢产物短链脂肪酸可通过激活PPARγ信号、降低一氧化氮合酶的表达促进结肠厌氧环境恢复^［7］；而肠上皮PPARγ信号的缺失会导致结肠上皮细胞氧合作用增加，促进兼性厌氧肠杆菌增殖，最终导致肠屏障功能损坏、肠内稳态破坏^［8］。

本研究利用16S rRNA高通量测序分析PCOS小鼠肠道菌群的结构特点，旨在揭示肠道菌、短链脂肪酸、肠屏障功能、PPARγ信号在补肾化痰方治疗PCOS中的作用及潜在机制。

1. 材料与方法

1.1. 动物、药物、试剂及仪器

无特定病原体级雌性C57BL/6J小鼠24只（3周龄，体重15~20 g）由南京中医药大学动物中心提供，屏障环境适应性喂养1周后进行实验。本研究通过南京中医药大学动物护理和使用委员会审查（012071002387）。

来曲唑（批号HI9991001）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品；补肾化痰方颗粒剂（仙灵脾10 g、仙茅10 g、苍术10 g、半夏6 g、陈皮6 g、九节菖蒲10 g、香附10 g、川芎6 g、泽泻10 g、鹿角霜10 g、胆南星6 g、砂仁3 g、炒白术6 g、淮山药6 g）由南京中医药大学附属医院药剂科提供；高脂饲料为南京金益柏生物科技有限公司产品。BCA蛋白定量试剂盒（货号PICPI23223）为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；预染的已知分子量标准蛋白（货号SM1811）为加拿大Fermentas公司产品；iNOS多克隆抗体（货号18985-1-AP）、PPARγ多克隆抗体（货号16643-1-AP）为武汉三鹰生物技术有限公司产品；HRP标记羊抗兔二抗（货号BA1054）为武汉博士德生物工程有限公司产品；小鼠黄体生成素ELISA检测试剂盒（货号MM-44039M1）、小鼠雌二醇ELISA检测试剂盒（货号MM-0566M1）、小鼠睾酮ELISA检测试剂盒（货号MM-0569M1）、小鼠卵泡刺激素ELISA检测试剂盒（货号MM-0579M1）均为南京宏哲生物科技有限公司产品；乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基戊酸、甲基叔丁基醚均为上海拜力生物科技有限公司产品。

低温冷冻离心机（型号TG-16M）为上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品；漩涡振荡器（型号K30）为上海青浦沪西仪器厂产品；酶标仪（型号MULTISKAN MK3）为美国ThermoFisher Scientific公司产品；移液枪为美国Gilson公司产品；显微镜（奥林巴斯BX53型生物显微镜）、电泳仪电源（型号DYY-7C）、垂直电泳槽（型号DYCZ-24DN）、电转仪（型号DYCZ-40）均为北京六一仪器厂产品；水平摇床（型号TS-1）为江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司产品；磁力搅拌器（型号T8-1）为江苏省金坛市中大仪器厂产品；电子天平（型号CPA）为北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；气相色谱-质谱仪（型号7890B-7000D）为美国Agilent公司产品。

1.2. 模型制备及干预措施

24只小鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、中药治疗组，每组8只。模型对照组和中药治疗组适应性喂养1周后（即小鼠4周龄时），将来曲唑溶于1%羧甲基纤维素中，按1 mg·kg^－1·d^－1剂量连续灌服35 d，并予高脂饲料喂养。中药治疗组造模结束后，将补肾化痰方混悬液溶于5%等渗氯化钠溶液中，按1 mg·kg^－1·d^－1剂量（参考临床等效剂量）连续灌服35 d。

1.3. ELISA法检测小鼠性激素水平

各组末次给药后，禁食12 h，颈椎脱臼法处死并从眼眶后静脉丛采血0.5~1.0 mL，分两份装入离心管。室温下血液自然凝固10~20 min，3000×g离心20 min。收集上清，－80 ℃保存备用。ELISA法检测各组血清卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇和睾酮水平。操作步骤如下：每孔各加入标准品或待测血清样品100 μL，将反应板充分混匀后37 ℃下静止120 min；用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，使用滤纸印干；每孔加入第一抗体工作液10 μL，将反应板充分混匀后37 ℃下静止60 min；同前洗板；每孔加入酶标抗体工作液100 μL，将反应板置于37 ℃下30 min；同前洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗处反应15 min；每孔加入100 μL种植液混匀；30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光度；计算结果。

1.4. HE染色观察卵巢组织学特征

各组末次给药后，禁食12 h，选取小鼠右侧卵巢进行HE染色。4%多聚甲醛固定各组小鼠右侧卵巢，将固定好的卵巢组织进行石蜡包埋，石蜡变为固态后进行切片，厚度4~6 μm，切完后的卵巢切片放入载玻片上使用40 ℃的温水浸泡使组织充分伸展；将卵巢切片放入二甲苯中，充分浸泡10 min，之后更换二甲苯溶液继续浸泡10 min；将浸泡过二甲苯的卵巢切片放入无水乙醇中浸泡5 min，再依次置于95%、85%、70%的乙醇溶液中浸泡5 min以达到充分水化；用磷酸盐缓冲液浸泡、清洗切片5 min，共三次。每个组织切片滴加100 μL苏木精染色液，充分染色10 min，染色后使用蒸馏水清洗多余的染色液，之后再用1%盐酸乙醇进行分化，分化后使用弱碱性促蓝液加入切片中，让细胞核染蓝色，反蓝结束后使用清水充分清洗切片。加入伊红染液，充分染色3 min，之后分别使用80%、95%、无水乙醇进行梯度脱水，分别脱水5 s、2 min、2 min；脱水后的切片使用二甲苯浸泡两次，每次4 min，之后风干切片并使用中性树胶封片；光镜下观察卵巢组织学特征。

1.5. 16S rRNA测序检测肠道菌群多样性

各组末次给药后，禁食12 h，收集结肠内新鲜粪便1~2枚，经液氮速冻后转移至－80 ℃保存备用。采用16S rRNA测序检测肠道菌群多样性，步骤如下：①基因DNA提取；②PCR扩增：按指定测序区域（16S V3~V4），合成带有barcode的特异引物或带有错位碱基的融合引物，进行PCR扩增并进行纯化；③构建Novaseq文库；④Novaseq上机测序。

1.6. 生物信息学方法分析测序数据

1.6.1. 粪便标本完整性分析

采用稀释曲线比较测序数据量不同标本中的物种丰富度，用以说明标本的测序数据量是否合理，明确标本的测序深度；采用香农-维纳多样性指数曲线反映各标本在不同测序数据量时的微生物多样性。

1.6.2. 肠道菌群多样性分析

采用α多样性分析的Chao1、Observed_species、香农-维纳多样性指数、PD_whole_tree评估单个标本所含微生物物种的多样性/丰富度以及每种微生物所占比例/均匀度。其中，Chao1指数和Observed_species指数用于估计群落中物种丰富度；香农-维纳多样性指数反映物种的丰富度和均匀度，数值越大，说明群落多样性越高；PD_whole_tree指数兼顾物种丰度以及进化距离的多样性，数值越大，群落多样性越高。β多样性分析采用基于距离矩阵（欧式距离以外的其他距离）的主坐标分析和非度量多维尺度法来评估标本间菌群组成和分布差异。

1.6.3. 菌群组成结构及差异菌群分析

基于标本物种相对丰度分析标本之间的物种差异。

1.6.4. 菌群多级物种线性判别分析

采用线性判别分析效应大小^［9］进行多级物种差异分析，以筛选生物标志物。

1.7. 气相色谱-质谱法检测短链脂肪酸含量

称取粪便标本20 mg于2 mL EP管中，加入0.5%磷酸（v/v）溶液1 mL，加入一颗小钢珠，20 Hz下球磨仪10 s，重复2次，涡旋10 min混匀（所有涡旋操作都将涡旋仪频率调到最大），再在冰浴下超声5 min；12 000×g、4 ℃离心10 min，取上清液100 μL加入到对应的1.5 mL离心管中，加入500 μL含内标的甲基叔丁基醚，涡旋3 min。冰浴下超声5 min；12 000×g、4 ℃离心10 min；吸取上层清液200 μL到标记编号的玻璃内衬管的进样瓶中，－20 ℃冰箱保存，待气相色谱-质谱分析。气相色谱-质谱条件：进样量2 μL；分流模式为1∶1；柱流速1.2 mL/min；柱箱升温程序：90 ℃保持1 min，以25 ℃/min的速率提高到100 ℃，以20 ℃/min的速率提高到150 ℃，保持36 s，运行3 min后以25 ℃/min的速率提高到200 ℃，保持30 s；前进样口温度200 ℃；传输线温度和离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃。

1.8. 免疫组织化学法定性检测结肠组织PPARγ蛋白表达

各组末次给药后，禁食12 h，取小鼠结肠2 cm，分两段保存备用。使用3%过氧化氢浸泡切片30 min（避免过氧化氢酶在后续染色过程造成非特异性背景染色），使用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5 min；滴加抗原修复液覆盖组织标本切片，室温下孵育5~8 min，再用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5 min；滴加10%山羊血清，室温下封闭0.5 h，封闭结束后，使用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5 min；滴加一抗工作液，室温条件下孵育2 h，孵育结束后，使用PBST洗三次，每次10 min；滴加二抗工作液，室温孵育1 h，孵育结束后，使用PBST洗三次，每次10 min；向处理好的切片上滴加新鲜配制的DAB溶液显色1~2 min；使用双蒸水缓慢清洗，滴加苏木精复染，然后水洗返蓝，干燥；使用梯度乙醇和二甲苯进行进脱水，干燥处理，使用中性树脂封片；镜检，光镜下呈棕褐色为阳性结果。

1.9. 实时逆转录PCR法检测肠道上皮黏蛋白2、闭合蛋白1和ZO-1、PPARγ mRNA表达

按照逆转录试剂盒要求操作，提取总RNA及逆转录合成模板cDNA，使用SYBR法进行荧光定量PCR，采用实时PCR仪进行PCR检测。均以36B4基因作为内参，以2^－ΔΔCt法计算数据。每个标本重复三次，每个实验重复三次。引物序列见表1。

表1.

引物序列一览

基因名称	引物序列
黏蛋白2	正向：CAAGCTGGACCCCTCTTACA
	反向：GCTTACATCTGGGCAAGTGG
ZO-1	正向：CCAGAGCCTCAGAAACCTCA
	反向：CTAGAGAAGTTGGGCTGGCT
闭合蛋白1	正向：ATGTATGGCGGAGAGATGCA
	反向：CTCTGTCCCAAGCAAGTGTG
PPARγ	正向：AGGGCGATCTTGACAGGAAA
	反向：CGAAACTGGCACCCTTGAAA
36B4	正向：GAAACTGCTGCCTCACATCCG
	反向：GCTGGCACAGTGACCTCACACG

ZO：紧密连接蛋白；PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体.

1.10. 蛋白质印迹法定量检测结肠组织iNOS、PPARγ蛋白表达

将小鼠结肠组织裂解剪成碎片匀浆，离心后提取组织蛋白。胶板洗涤吹干，装于胶架上；制备胶体缓慢加入玻璃板中，插入梳子，室温凝固约1 h后，用双蒸水清洗；将玻璃板装入电泳槽，插上电源进行预电泳，60 V恒压空跑30 min；蛋白标本预热混匀后，用移液枪将蛋白标本和标准蛋白加入上样孔，继续60 V恒压电泳，待指示条带进入下层胶后，改为120 V恒压电泳；将PVDF膜放入含甲醇的培养皿中浸泡后，将分离胶放置在转膜夹的滤纸上，接着铺上PVDF膜，夹上转膜夹并装入电泳槽。低温冰预350 mA恒流，转膜78~108 min；转膜结束后，取出PVDF膜放入含封闭液的盒子里，室温封闭1 h；裁剪目的蛋白条带，加入对应抗体稀释液，4 ℃孵育过夜，次日用适量PBST洗膜三次，每次约5 min；弃PBST后，加入HRP标记二抗，室温孵育1~1.5 h后用适量PBST洗膜三次，每次约5 min；ECL显色液A液、B液等体积混匀，避光反应，通过扫膜仪曝光显色。用AlphaEaseFC软件对蛋白表达量进行相关统计和灰度分析。

1.11. 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（$\overline{x}\pm s$）表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以中位数（上下四分位数）［M（Q ₁，Q ₃）］表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 补肾化痰方对PCOS模型鼠临床和病理特征的影响

与空白对照组比较，模型对照组体重增加（P<0.01），血清卵泡刺激素、黄体生成素和睾酮水平均升高（P<0.01），血清雌二醇水平降低（P<0.01），见表2。空白对照组卵巢镜下可见不同发育阶段的卵泡，成熟卵泡结构完整，且外周颗粒细胞层排列整齐、结构致密；模型对照组卵巢镜下可观察到表面呈多囊样改变，具体表现为卵泡囊状扩张且数量增加，次级卵泡、窦卵泡和闭锁卵泡数增多（P<0.01），黄体数减少，并且卵泡颗粒细胞层数减少、排列疏松。见表2、3和图1。结果提示，PCOS小鼠建模成功。

表2.

三组体重及血清性激素水平比较

组 别	n	体重（g）	卵泡刺激素（mIU/mL）	黄体生成素（mIU/mL）	雌二醇（pmol/L）	睾酮（ng/mL）
空白对照组	6	18.57±0.89	45.50±7.53	19.44±4.29	40.79±4.82	6.62±1.70
模型对照组	6	20.57±1.21**	74.98±7.86**	34.04±5.23**	20.89±8.88**	17.46±2.05**
中药治疗组	6	19.00±0.58	66.96±9.17**	25.14±3.82*##	24.71±10.36**	12.59±4.02**##

与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型对照组比较，^##P<0.01.

$\overline{x}\pm s$

表3.

三组卵巢内不同发育阶段卵泡数比较

组 别	n	原始卵泡	初级卵泡	次级卵泡	窦卵泡	闭锁卵泡
空白对照组	5	1.00（1.00，2.00）	2.00（1.00，3.00）	3.00（1.75，3.25）	3.00（3.00，4.00）	0.00（0.00，1.00）
模型对照组	5	2.00（1.00，2.25）	1.00（0.75，1.25）	5.00（3.75，6.00）**	7.50（7.00，10.00）**	3.00（1.75，3.00）**
中药治疗组	5	1.00（1.00，2.00）*##	1.00（0.00，1.00）	4.00（2.00，5.00）##	7.00（3.00，10.00）##	2.00（1.00，3.00）#

与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01.

M（Q ₁，Q ₃）

图1. 三组卵巢组织结构比较（HE染色）.

空白对照组卵巢可见不同发育阶段的卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡），成熟卵泡结构完整，且外周颗粒细胞层排列整齐、结构致密；模型对照组卵巢内卵泡囊状扩张且数量增加，小卵泡和闭锁卵泡数显著增多，黄体数减少，并且卵泡颗粒细胞层数减少、排列疏松，呈现出多囊样改变；中药治疗组卵巢中囊状卵泡减少，黄体数增加，卵泡膜略增厚，外周颗粒细胞层结构较模型对照组明显改善.标尺=100 μm. HE染色：苏木精-伊红染色.

与模型对照组比较，中药治疗组血清黄体生成素和睾酮水平降低（均P<0.01），卵巢HE染色镜下可见囊状卵泡减少，原始卵泡、次级卵泡、窦卵泡和闭锁卵泡数减少（P<0.01），黄体数增加，卵泡膜略增厚，外周颗粒细胞层结构较模型对照组有明显改善。见表2、3和图1。结果提示，补肾化痰方对PCOS有改善作用。

2.2. 补肾化痰方对模型鼠肠道菌群丰富度和多样性的影响

稀释曲线和香农-维纳多样性指数曲线均表明测序数据合理，可以反映标本中绝大多数的微生物信息（图2）。α多样性分析结果显示，与空白对照组比较，模型对照组肠道菌落丰度和多样性均减少，其中Chao指数和Observed_species显著降低（P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组PD_whole_tree指数升高，但Chao1指数、香农-维纳多样性指数进一步降低，见表4。β多样性分析结果显示，主坐标分析图中，各标本解释度值PC1和PC2分别为88.15%和7.31%，三组之间标本距离明显，提示PCOS小鼠肠道菌群较正常对照组明显改变，而中药治疗可在整体上改变PCOS小鼠肠道菌群状况，见图3。

图2. 三组肠道菌群标本测序的稀释曲线和香农-维纳多样性指数曲线.

表4.

三组肠道菌群α多样性比较

组 别	n	Chao1	Observed_ species	PD_whole_ tree	香农-维纳多样性指数
空白对照组	5	422.35±188.88	310.56±138.88	20.29±9.07	1.06±0.47
模型对照组	5	172.66±77.22*	158.24±70.76*	4.14±1.85	0.99±0.44
中药治疗组	5	66.08±29.55**#	86.77±38.80**	4.74±2.12	0.41±0.18**#

与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05.

$\overline{x}\pm s$

图3. 三组肠道菌群β多样性比较（n=5）.

A：主坐标（PC）分析图；B：非度量多维尺度（NMDS）法图.

2.3. 补肾化痰方对模型鼠肠道菌群结构的影响

图4展示了线性判别分析中大于阈值4且有差异（阈值为0.05）的物种。其中，乳杆菌、厚壁菌等差异菌群可能在维持小鼠健康肠道微生态中发挥了重要作用，而疣微菌、阿克曼菌等差异菌群可能在PCOS发生中发挥了重要作用。

图4. 三组肠道菌群线性判别分析分数直方图.

在门水平，各组肠道菌群组成均以厚壁菌、疣微菌、拟杆菌为主。与空白对照组比较，模型对照组厚壁菌丰度显著减少，疣微菌、变形菌及放线菌丰度显著增加（P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组肠道菌群中厚壁菌、拟杆菌丰度增加，疣微菌、变形菌及放线菌丰度均减少，但差异无统计学意义。见图5、6。

图5. 三组肠道菌群门、属水平构成（n=5）.

A：门水平肠道菌群构成；B：属水平肠道菌群构成.

图6. 三组门水平、属水平肠道细菌优势菌群相对丰度比较（n=5）.

A：门水平肠道细菌优势菌群相对丰度比较；B：属水平肠道细菌优势菌群相对丰度比较. ^*P<0.05，^**P<0.01.

在属水平，乳酸菌属、阿克曼菌、拟杆菌属为相对丰度最大的细菌。与空白对照组比较，模型对照组乳酸菌丰度显著减少（P<0.01），阿克曼菌、乳梭菌属、乳球菌属、产粪甾醇真细菌丰度显著增加（均P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组乳酸菌和未分类菌丰度均显著增加（P<0.05），阿克曼菌、乳梭菌属、乳球菌属、产粪甾醇真细菌丰度均减少。见图5、6。

上述结果提示，门水平厚壁菌、疣微菌、变形菌和放线菌可能与PCOS的发生发展相关，属水平乳酸菌属、阿克曼菌、乳梭菌属、乳球菌属和产粪甾醇真细菌可能与PCOS的发生相关，补肾化痰方可能通过调节这些菌群的丰度而改善PCOS肠道菌群紊乱。

2.4. 补肾化痰方对模型鼠短链脂肪酸含量的影响

与空白对照组比较，模型对照组粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量均显著减少（均P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组乙酸、丙酸、丁酸含量均增加，其中丙酸和丁酸含量与模型对照组差异有统计学意义（均P<0.05），见表5。结果提示，补肾化痰方可能通过调节肠道菌群种属分布而提高短链脂肪酸水平。

表5.

三组粪便中短链脂肪酸含量比较

组 别	n	乙 酸	丙 酸	丁 酸
空白对照组	5	1.28±0.17	0.33±0.04	0.36±0.19
模型对照组	6	0.37±0.11**	0.18±0.04**	0.11±0.03*
中药治疗组	6	0.58±0.21**	0.26±0.05*#	0.20±0.04#

与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型对照组比较，^#P<0.05.

$\overline{x}\pm s$，mg/g

2.5. 补肾化痰方对模型鼠结肠组织PPARγ表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组结肠PPARγ表达显著减少（P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组结肠PPARγ蛋白表达增加，但PPARγ mRNA表达减少，见图7、8和表6。结果提示，PPARγ信号通路可能参与了PCOS的发生及进展过程，补肾化痰方可能通过激活PPARγ信号发挥作用。

图7. 三组结肠上皮细胞中PPARγ表达（免疫组织化学染色）.

空白对照组结肠细胞形态正常，PPARγ染色范围较大；模型对照组结肠细胞PPARγ染色范围明显缩小，呈浅褐色；中药治疗组PPARγ染色范围较模型对照组增大. PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体.

图8. 三组结肠上皮细胞中PPARγ蛋白电泳图.

PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体.

表6.

三组小鼠结肠组织中PPARγ表达量比较

组 别	n	PPARγ蛋白	PPARγ mRNA
空白对照组	5	0.35±0.20	0.64±0.26
模型对照组	5	0.23±0.13*	0.53±0.27**
中药治疗组	5	0.30±0.18	0.15±0.07##**

与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型对照组比较，^##P<0.01. PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体.

$\overline{x}\pm s$

2.6. 补肾化痰方对模型鼠肠道上皮黏蛋白2、ZO-1、闭合蛋白1 mRNA表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组ZO-1 mRNA表达增加（P<0.05），黏蛋白2、闭合蛋白1 mRNA表达减少；与模型对照组比较，中药治疗组闭合蛋白1、黏蛋白2 mRNA表达增加（均P<0.05），ZO-1 mRNA表达减少。见表7。结果提示，补肾化痰方通过增加模型鼠肠道上皮中黏蛋白2、闭合蛋白1表达和降低ZO-1表达抑制PCOS的进展。

表7.

三组肠道上皮中黏蛋白2、ZO-1、闭合蛋白1 mRNA水平比较

组 别	n	黏蛋白2	ZO-1	闭合蛋白1
空白对照组	5	0.61±0.25	0.63±0.37	1.04±0.42
模型对照组	5	0.43±0.21	1.32±0.48*	0.41±0.21
中药治疗组	5	0.53±0.24#	1.22±0.53	0.56±0.25##

与空白对照组比较，^*P<0.05；与模型对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01. ZO：紧密连接蛋白.

$\overline{x}\pm s$

2.7. 补肾化痰方对模型鼠肠道组织中iNOS蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组肠道组织中iNOS表达增加，分别为1.25±1.62和3.33±3.54，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组比较，中药治疗组iNOS蛋白表达减少（1.59±1.16），但两组间差异无统计学意义（P>0.05），见图9。结果提示，模型对照组中硝酸盐生成加速，肠屏障功能破坏，补肾化痰方干预后减少了iNOS蛋白表达。

图9. 三组结肠组织中iNOS蛋白电泳图.

iNOS：诱导型一氧化氮合酶.

3. 讨论

PCOS作为育龄期妇女临床最常见的生殖内分泌疾病，不仅会影响生殖功能，造成不孕，而且还与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、心脑血管疾病等发生密切相关。李天鹤等^［10］总结近年来的文献发现，肠道菌群对性激素、免疫和代谢均有影响，肠道菌群多样性和丰度的改变在PCOS发生发展过程中发挥了重要作用，通过对肠道菌群的检测，可能对PCOS的预测及其远期并发症有一定的指导意义。

根据PCOS临床及病理特征，目前主要有以下几种造模方法^［11］，包括雌雄激素造模法、胰岛素联合hCG造模法、孕激素联合hCG造模法、芳香化酶抑制剂造模法。Kafali等^［12］首次使用非甾体类芳香化酶抑制剂来曲唑诱导雌性大鼠PCOS模型，是目前较为全面反映PCOS患者内分泌状态及卵巢局部病理改变的模型。研究表明，使用来曲唑构建PCOS动物模型有以下优点：来曲唑能够抑制雄激素向雌激素的转化，从而提高雄激素的水平；来曲唑诱导的模型与PCOS有许多相似的特征，如无排卵、多囊样卵巢、促黄体生成素增加，以及体重增加、胰岛素血症和胰岛素抵抗等一系列相似的代谢特征^［13-14］。因此，本研究使用来曲唑和高脂饲料构建PCOS模型。

虽然大多临床和动物研究结果均表明PCOS患者肠道菌群α多样性减少^{［6，15-16］}，但也有不同研究结果。如有学者使用Chao-1、Ace、香农-维纳多样性指数、Sobs四个指数来反映α多样性，结果显示Sobs在PCOS模型组显著增加^［17］。本文资料显示，与空白对照组比较，模型对照组肠道菌群α多样性减少，其中Chao指数和Observed_species指数差异有统计学意义；中药治疗组肠道菌群PD_whole_tree指数升高，但其他三个指数仍降低。提示与空白对照组比较，模型对照组肠道菌群α多样性发生了显著变化，中药治疗后肠道菌群α多样性改善程度并不显著，可能与中药干预时间较短、中药浓度较小等相关。β多样性分析结果显示，三组之间标本距离明显，提示PCOS小鼠肠道菌群发生了整体改变，且中药治疗组与模型对照组比较有一定的改变。在门水平，啮齿类动物和人类的肠道菌群组成十分相似，均以拟杆菌和厚壁菌为主（约占80%），还有少量疣微菌^［18］。本文资料显示，厚壁菌、疣微菌和拟杆菌是三组小鼠门水平相对丰度最高的三个细菌，与以往研究结果基本一致。Torres等^［19］用来曲唑造模后，发现成年雌性小鼠肠道菌群中多类细菌的平均相对丰度发生显著变化，包括毛螺旋菌科、瘤胃菌科和消化菌科相对丰度的增加以及乳酸菌相对丰度的减少。本文资料显示，与空白对照组比较，在门水平，模型对照组厚壁菌丰度显著减少，疣微菌、变形菌及放线菌丰度显著升高，而中药治疗组肠道菌群中厚壁菌、拟杆菌丰度升高，疣微菌、变形菌及放线菌丰度下降；在属水平，模型对照组乳酸菌属丰度显著下降，而中药治疗组乳酸菌属丰度增加，与以往研究基本一致。综上，来曲唑联合高脂饮食诱导的PCOS模型小鼠存在肠道菌群失衡状态，而中药治疗会改变小鼠的肠道菌群。

研究表明，肠道菌群的失衡会导致肠屏障功能受损，而肠屏障功能的受损会导致细菌或有毒细菌产物从肠道入血液引起全身炎症，参与多种疾病的起病与发展^［20］。肠道微生态失衡假说认为，PCOS患者摄入过度高脂饮食，通过诱导肠道微生物分泌大量的脂多糖，导致肠黏膜屏障受损，肠道ZO-1、闭合蛋白表达改变，肠道通透性增加，促使脂多糖进入全身循环，加重炎症；反之，改善饮食习惯，修复肠黏膜屏障功能，能够改善全身炎症从而起到改善PCOS的作用^［21-22］。肠黏液层是肠道抵御肠内致病菌及有害物质入侵的第一道屏障，黏蛋白2是构成肠黏液层最重要的蛋白，其表达量和结构的改变与肠黏膜屏障损伤密切相关。健康肠道中厌氧菌（厚壁菌门、拟杆菌门等）占主导地位，其通过限制硝酸盐和氧气的产生^［8，23］，抑制致病菌（肠杆菌科细菌、沙门菌等）过度繁殖，同时分解膳食纤维，产生短链脂肪酸，而短链脂肪酸能促进肠上皮黏蛋白2表达，维护肠道化学屏障^［24］。丁酸作为短链脂肪酸的主要成分之一，能促进益生菌（双歧杆菌和乳酸杆菌）黏附，减少大肠杆菌的黏附^［25］，亦能促进肠黏膜屏障相关蛋白（闭合蛋白、ZO-1）的表达^［26］，从而降低小鼠肠道通透性。本文资料显示，与空白对照组比较，模型对照组肠道菌群中厚壁菌丰度显著下降，粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量均显著减少，黏蛋白2和闭合蛋白1 mRNA表达下降；而中药治疗组肠道内厚壁菌、拟杆菌丰度较模型对照组显著增加，粪便中丙酸、丁酸含量增加，黏蛋白2和闭合蛋白1 mRNA表达增加。结果提示，PCOS小鼠肠道菌群中厚壁菌显著减少，可能通过减少短链脂肪酸含量、抑制黏蛋白2、ZO-1和闭合蛋白1的表达，从而破坏肠黏膜的屏障功能；补肾化痰方治疗后，益生菌拟杆菌显著增加，促进短链脂肪酸产生，修复PCOS小鼠肠黏膜屏障功能，从而抑制PCOS的发生发展。

Mariana等^［8］发现，机会致病菌菌肠杆菌科细菌利用硝酸盐作为氧气来源，进行有氧呼吸。短链脂肪酸的主要成分丁酸通过抑制结肠上皮细胞一氧化氮合酶的表达减少iNOS的产生，而iNOS是产生硝酸盐的关键因素^［27］。随后，有研究者筛选了丁酸盐作用的信号通路，发现PPARγ在肠道高表达，该通路在抑制肠道硝酸盐的生成方面起重要作用。短链脂肪酸中丁酸激活肠道PPARγ通路，使宿主肠道中的氧气和硝酸盐含量减少，抑制肠杆菌科细菌获取硝酸盐及氧气进行有氧呼吸，进一步阻止肠杆菌科细菌过度增殖，保护肠道屏障功能，降低肠道通透性^［28］。本文资料显示，模型对照组肠道PPARγ表达降低，iNOS表达增加；而中药治疗组肠道PPARγ表达增加，iNOS表达减少。由此可见，补肾化痰方可通过增加肠道菌群中益生菌拟杆菌的丰度、调节菌群结构、增加短链脂肪酸激活肠PPARγ通路、减少iNOS表达，从而降低肠道通透性，保护肠屏障功能，延缓PCOS的进展；此外，硝酸盐含量减少可以抑制肠杆菌科细菌的增殖，维持肠道菌群稳态。

综上所述，本研究从中医整体观念出发，从肠道菌群、短链脂肪酸、PPARγ信号、肠屏障功能多个角度，阐述了补肾化痰方治疗PCOS的机制。来曲唑联合高脂饲料构建的PCOS模型小鼠肠道菌群整体结构发生变化；门水平厚壁菌相对丰度显著下降，疣微菌、变形杆菌和放线菌相对丰度显著升高。补肾化痰方可能通过改善PCOS肠道菌群结构，增加短链脂肪酸从而增强其激活肠道PPARγ信号的作用，使肠上皮细胞iNOS表达下调，降低肠道通透性，改善肠屏障功能，最终减缓PCOS的进展。本文部分结果与已有研究不完全一致，可能与造模方法、样本数量等因素相关。今后我们将进一步完善实验方案、加大样本量，并结合临床试验深入探究补肾化痰方对PCOS的作用靶点及具体通路，以期为PCOS的临床诊治提供理论依据。

［缩略语］

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）；过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPARγ）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）；苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；含吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline with Tween-20，PBST）；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）；紧密连接蛋白（zonula occludens，ZO）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）；人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests