miRNA-3679抑制下游ZADH2-靶基因促进肝癌细胞增殖的机制研究

Abstract

目的

寻找miRNA-3679与肝癌细胞系之间的关系，并验证其下游靶基因。

方法

通过PCR检测miRNA-3679在肝癌细胞系中的表达，使用ENCORI、miRDB、TargetScan数据库预测miRNA-3679的下游靶基因；通过qPCR检测（空白对照组、转染组及转染阴性对照组）转染靶基因表达水平确定靶基因为含锌结合醇脱氢酶结构域-2（ZADH2）；Western blot检测转染miRNA-3679抑制剂后ZADH2蛋白表达；EdU染色检测转染miRNA-3679抑制剂及同时转染miRNA-3679、ZADH2抑制剂后对细胞增殖的影响；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；流式细胞术检测细胞凋亡。

结果

miRNA-3679在肝癌细胞系中的表达水平均高于正常人肝细胞株（P<0.05），数据库中共筛选出6个在肝癌中下调的基因：GLUD1、B3GAT1、SLC46A3、MAP2K3、ATF5、ZADH2；qPCR检测转染miRNA-3679抑制剂后ZADH2表达升高（P<0.01）；转染miR-3679抑制剂后荧光素酶活性升高（P<0.01）；Western blot检测miR-3679 inhibitor组中的ZADH2蛋白表达高于NC组（P<0.01）；EdU分析检测miRNA-3679 inhibitor组阳性细胞数低于NC组及Inhibitor NC组（P<0.05）；miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组克隆计数多于miR-3679 inhibitor组（P<0.01）；流式细胞术检测提示miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组细胞凋亡数目低于miR-3679 inhibitor组（P<0.01）。

结论

miRNA-3679在肝癌细胞中显著高表达，可直接作用于ZADH2基因并影响其表达，且通过抑制ZADH2发挥促进HCC细胞的增殖及抑制其凋亡。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）占原发性肝脏肿瘤的85.90%，HCC的发病率在全球范围内所有癌症中排名第六，死亡率为第三，总体五年生存率低于10%^[1]；有约一半以上发生在中国，是我国第四位常见恶性肿瘤及第二位肿瘤致死病因^[2]。HCC的发生发展机制复杂，许多信号转导通路均有参与，但目前具体机制尚不清楚，故缺乏能够有效抗肿瘤的药物^[3]。自2007年第一代肝细胞癌的靶向药物索拉菲尼问世以来，虽在10余年的发展中有了多靶点药物及新药的开发，但靶向药物治疗效果远未达到我们的预期水平，这与HCC肿瘤细胞存在明显的分子异质性、多种遗传畸变有关^[4]。随着分子生物学的进展，更多在HCC的发生与发展中的关键靶点被发现，对HCC的发生及发展有了较深入的研究^[5]；但目前对HCC发生、发展的分子机制尚不明确，因此，对HCC的发生与发展相关分子机制研究，寻找潜在的治疗靶点，对HCC的预防及治疗等均有着重要意义。

微小RNA（micro-ribonucleic acid, miRNA）在肝癌的发生发展中扮演着重要角色，它既可以促进又可以抑制肝癌的发生发展，也可以预测肝癌的进程^[6-11]；miRNA-3679是miRNA家族成员之一，目前已有其在肺鳞癌^[12]、冠状动脉钙化^[13]、骨质疏松^[14]、结肠癌^[15]、胰腺癌^[16]等方面有所研究，但均未涉及到与下游靶基因关系验证及机制研究，其与HCC的关系、是否影响其进展等，目前国内外未见相关文献报道。本课题前期已经证实miRNA-3679可能影响HCC的发生与发展（待发表），因此，本实验将对miRNA-3679在肝癌细胞系中的表达、下游靶基因的寻找及验证做深入探讨。

1. 材料和方法

1.1. 主要材料

人正常肝细胞系、肝癌细胞系SNU-475、SNU-398、Hep3B、Smmc-7721、HepG2（上海博谷生物科技有限公司）；miRNA第一链cDNA合成试剂盒、miRNA荧光定量PCR试剂盒（上海生工），miR-3679-Forward序列为（西安擎科泽西生物科技有限公司设计）：5′-TGAGGATATGGCAGGGAAGGGGA-3′；miR-3679-Reverse：Universaloligod T primer；GAPDH-Reverse：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′；GAPDH-Forward：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′；B3GAT1-Forward：5′-GTCCCATTACTGGGTGTCCA-3′；B3GAT1-Reverse：5′-ATCGCTAGGATGTCCCGTCT-3′；SLC46A3-Forward：5′-GTCGAGTTCGACGGGAAAGT-3′；SLC46A3-Reverse：5′-GGTAGGTAGCTGTATTCCCACG-3′；MAP2K3-Forward：5′-AAGTTCTCAGTTGGCCCGTG-3′；MAP2K3-Reverse：5′-CTTCCTCTTGGATTTTCCGCC-3′；ATF5-Forward：5′-AGAGTCAGGAGGAGGAAACCA-3′；ATF5-Reverse：5′-CACAAAGGGGTCGAGGCTAC-3′；ZADH2-Forward：5′-TAGAATCCTGCGCTCACTGC-3′；ZADH2-Reverse：5′-GGATTCGCGCATTTGGAGAC-3′。Lipofectamine 3000（Invitrogen公司）；GAPDH monoclonal antibody，ZADH2 polyclonal antibody（一抗，Proteintech公司）；Anti-rabbit IgG antibody（二抗，Biosharp公司）；Annexin Ⅴ- FITC/PI凋亡检测试剂盒（索莱宝），BeyoClick^TMEdU-488细胞增殖检测试剂盒（碧云天）；pGL3-ZADH2-WT及突变后的pGL3-ZADH2-MUT质粒由西安基恩科生物科技有限公司构建。

1.2. 方法

1.2.1. 生物信息学分析miRNA-3679的下游靶基因

使用ENCORI、miRDB、TargetScan三个数据库（ENCORI：http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=mRNA&flag=none&clade=mammal&genome=human&assembly=hg19&miRNA=HSA-MIR-3679-5P&clipNum=1&deNum=0&panNum=0&proNum=1&program=None&target=all；miRDB：http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi?searchType=miRNA&searchBox=hsa-miR-3679-5p&full=1；TargetScan：http://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_72/targetscan.cgi?species=Human&mir_nc=miR-1185-5p）分别预测miRNA-3679的下游靶基因，预测结果取交集后得到62个潜在靶基因；使用TCGA数据库分析这62个潜在靶基因，筛选得到在肝癌中下调的基因。

1.2.2. 荧光定量PCR（quantitative real-time, qPCR）

通过qPCR检测miR-3679在正常人肝细胞及肝癌细胞系中的表达，并检测1.2.1中筛选出的下游靶基因在Hep3B细胞（未转染miR-3679抑制剂组和转染miR-3679抑制剂组）中的表达水平。采用Trizol法提取RNA，Nanodrop 2000检测肝癌细胞系RNA浓度及纯度；反转录：根据表1配制反应体系；定量PCR：在qPCR管中配制如下混合液（表2）；结果处理及判读：ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待测样本）−CT（内标基因，待测样本），B=CT（目的基因，对照样本）−CT（内标基因，对照样本），K=A−B，表达倍数=2−K，结果判读：相对定量PCR是比较2个或者2个以上标本mRNA含量的变化，mRNA的含量与表达倍数呈正比。

表 1. Reverse transcription reaction system.

反转录反应体系

Reagent	Reaction system	Final concentration
dNTP mix (2.5 mmol/L each)	4 μL	500 μmol/L each
Primer mix	2 μL
RNA template	X μL	50 pg-5 μg
5×RT buffer	4 μL	1×
DTT (0.1 mol/L)	2 μL	10 mmol/L
HiFiScript (200 U/μL)	1 μL
RNase-free water	Fill up to 20 μL

表 2. Quantitative PCR reaction system.

定量PCR反应体系

Reagent	Reaction system
*Obtained by reverse transcription.
2×ChamQ SYBR qPCR master mix	10 μL
Primer1 (10 µmol/L)	0.5 μL
Primer2 (10 µmol/L)	0.5 μL
cDNA*	1 μL
RNase-free water	8 μL

1.2.3. 细胞转染

培养Hep3B、SMMC-7721及ZADH2突变后（ZADH2-MUT）的肝癌细胞株至70%后，待转染；使用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine®3000试剂（2管），在每管已稀释的Lipofectamine®3000试剂中加入稀释的DNA（1∶1）；室温孵育5 min；加入脂质体复合物至细胞中；37 ℃孵育细胞2~4 d，然后分析转染细胞。

1.2.4. 双荧光素酶报告基因检测

按5×10⁴/孔将Hep3B细胞铺于24孔板中，待培养至细胞融汇至90%时，按转染试剂盒中的操作说明，分别将构建的pGL3-ZADH2-WT、pGL3-ZADH2-MUT转染上述细胞，即为ZADH2突变组（ZADH2-MUT）及ZADH2野生型组（ZADH2-WT），同时转染内参海肾荧光素酶载体（比例为实验质粒︰内参质粒=100∶1），每组分别做3个复孔，转染24 h以后，PBS液洗细胞3次后，检测各组荧光素酶的活性（按照Dual-Luciferase@Reporter Assay System说明书进行）。

1.2.5. EdU染色

分为miR-3679组、同时抑制miR-3679及ZADH2（miR-3679 inhibitor+si-ZADH2）组及空白对照组（NC组），将Hep 3B和SMMC-7721细胞分别接种至24孔板，24 h后转染，配制2×的EdU工作液；将37 ℃预热的2×的EdU工作液（20 µmol/L），等体积加入24孔板中孵育2 h，多聚甲醛室温固定15 min；去除固定液，洗涤，每孔加入1 mL含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育10～15 min；1 mL PBS洗涤细胞；按照说明书配制Click Additive Solution和Click反应液；每孔加入0.5 mL Click反应液；室温避光孵育30 min；PBS洗涤3次；每孔加入含0.5 mL 0.1 µg/mL DAPI的PBS溶液，室温避光染色5 min；吸除DAPI溶液，避光条件下用PBS洗涤3次；荧光显微镜观察拍照并阳性细胞计数。

1.2.6. 细胞克隆实验

分组同1.2.5。接种：按照300个/孔的细胞接种至6孔板里混匀，孵育48 h；细胞转染；继续培养箱孵育72 h；克隆生长：显微镜下观察，当培养皿中出现可见的克隆时（超过50个细胞为一个克隆），终止培养。固定染色。拍照计数：计数着色成功的克隆（蓝紫色的成簇细胞）。

1.2.7. 流式细胞术

分组同1.2.5。细胞接种24孔板，每组接种1孔，细胞密度为5×10⁴/孔，加500 μL培养液；24 h后转染，操作同前；按照分组，各孔在培养48 h后经预热PBS洗涤后消化收集细胞；用1 mL 1×的Binding Buffer悬浮细胞，300×g离心10 min，弃上清；用1 mL 1×的Binding Buffer重悬细胞，使细胞的密度达到1×10⁶ mL^－1；每管加入100 μL细胞（1×10⁵个）；再向管中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC；室温，避光，轻轻地混匀，10 min；加入5 μL PI，室温，避光，孵育5 min；加入PBS至500 μL，轻轻混匀；在1 h内用流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.2.8. Western blot

取NC及miR-3679 inhibitor组Hep3B细胞，加入100 μL Ripa蛋白提取液，取上清液，BCA法测定蛋白浓度；所有蛋白样品调至相等浓度后上样，分别上样10 μL进行电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭，加入一抗ZADH2抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜，洗膜后加入合适的二抗，并选择HRP标记的抗体，按相应比例稀释，室温轻摇1 h；采用HRP-ECL发光法鉴定。检测目的蛋白条带与内参蛋白GAPDH条带灰度值的比值，为目的蛋白的相对表达量。

1.2.9. 统计学方法

两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. qPCR检测miR-3679在正常人肝细胞及肝癌细胞系中的表达

qPCR检测结果显示，在肝癌细胞系中miR-3679的表达水平均高于正常人肝细胞株，其中Hep3B、Smmc-7721及HepG2细胞系中高表达有统计学意义（P<0.05），且在Hep3B和Smmc-7721中高表达尤为显著（P<0.01，图1）。

图 1.

Expression of miR-3679 in human normal hepatocytes and hepatoma cell lines

qPCR检测miR-3679的表达

* P<0.05, ** P<0.01. n=3.

2.2. 生物信息学分析miRNA-3679的下游靶基因

使用ENCORI、miRDB、TargetScan三个数据库预测,再使用TCGA数据库分析，最终筛选得到6个在肝癌中下调的基因：GLUD1、B3GAT1、SLC46A3、MAP2K3、ATF5、ZADH2（图2）。

图 2.

Bioinformatics analysis of downstream target genes of miRNA-3679

生物信息学分析miRNA-3679的下游靶基因

GLUD1: Glutamate dehydrogenase 1; B3GAT1: Beta-1,3-glucoronyltransferase 1; SLC46A3: Solute carrier family 46 member 3; MAP2K3: Mitogen-activated protein kinase kinase 3; ATF5: Activating transcription factor 5; ZADH2: Zinc binding alcohol dehydrogensae domain containing2.

2.3. qPCR检测相关基因的表达

2.3.1. 转染miRNA-3679抑制剂（P3000^TM试剂）对Hep3B、Smmc-7721细胞中mi-RNA3679的表达

miRNA-3679 inhibitor组的miRNA-3679在Hep3B及Smmc-7721表达水平低于转染阴性对照（Inhibitor NC）组（图3，P<0.05）。

图 3.

Expression of miRNA-3679 in Hep3B and Smmc-7721 cells

各组miRNA-3679的表达

　　* P<0.05. n=3.

2.3.2. qPCR检测抑制miRNA-3679后下游靶基因的表达水平

转染miRNA-3679抑制剂后Hep3B细胞SLC46A3、ATF5的表达无差异，GLUD1、B3GAT1、MAP2K3和ZADH2的表达升高（P<0.05），以ZADH2差异尤为明显（P<0.01，图4），因此选择ZADH2为后续实验靶基因。

图 4.

Expression levels of downstream target genes after inhibition of miRNA-3679

qPCR检测抑制miRNA-3679后下游靶基因的表达水平

* P<0.05, ** P<0.01. n=3. GLUD1, B3GAT1, SLC46A3, MAP2K3, ATF5, ZADH2: Denote the same as those in Fig 2.

2.4. 双荧光素酶报告基因检测下游ZADH2-靶基因与miRNA-3679的直接相互作用

将构建好的重组质粒转染Hep3B细胞，转染miR-3679 inhibitor后，荧光素酶活性显著升高（P<0.01）；而ZADH2基因与miR-3679的结合位点突变后，转染miR-3679 inhibitor则对荧光素酶活性不再产生影响（P>0.05，图5）。

图 5.

The expression of ZADH2 in Hep3B cell lines was determined by luciferase activity test

荧光素酶活性检测Hep3B细胞株ZADH2的表达

A: Wild-type and mutant ZADH2 and miRNA-3679 gene sequences; B: The expression of ZADH2 (n=3); ** P<0.01.

2.5. Western blot检测各组蛋白表达

miR-3679 inhibitor组中Hep3B细胞ZADH2蛋白表达高于NC组（P<0.01，图6）。

图 6.

ZADH2 protein expression in each group was determined by Western blot (n=3)

Western blot检测ZADH2蛋白表达（n=3）

2.6. EdU实验检测细胞增殖

miRNA-3679 inhibitor组阳性细胞数低于NC组及Inhibitor NC组及miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组（图7，P<0.01）。

图 7.

EdU analysis for determining cell proliferation in each group. ×200

EdU分析检测各组细胞增殖情况。 ×200

** P<0.01. n=3.

2.7. 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

miR-3679 inhibitor组中克隆计数少于NC组（P<0.01），但miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组克隆计数多于miR-3679 inhibitor组（图8，P<0.01）。

图 8.

Colony formation assay for determining cell clones in each group

克隆形成实验检测细胞克隆

** P<0.01. n=3.

2.8. 流式细胞术检测细胞凋亡

miR-3679 inhibitor组细胞凋亡率高于NC组及miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组（图9，P<0.01）。

图 9.

Determining apoptosis by flow cytometry (FITC-Annexin Ⅴ/PI)

流式细胞术（FITC-Annexin Ⅴ/PI）检测细胞凋亡

** P<0.01. n=3.

3. 讨论

3.1. miR-3679在肝癌细胞珠中的表达及下游靶基因的选定

微小RNA是由19-24个核苷酸组成的一类内源性非编码RNA，通过与靶基因的3′非翻译区（3′-untranslated region, 3′-UTR）结合，可抑制靶基因的表达或促进其降解，参与细胞内的转录后调节^[17]。miRNA虽然不能直接编码蛋白质，但目前估计有约30%的人类编码基因受miRNA的调控^[18]，通过转录后调节超过60%的人体蛋白质编码基因^[19]，因此，miRNA参与机体多种生理病理过程及生物学功能。本课题假设miRNA-3679参与HCC的发生与发展，采用细胞学实验证实，在HCC细胞系（SNU-475、SNU-398、Hep3B、Smmc-7721、HepG2）中miRNA-3679的表达水平均高于人正常肝细胞（HL-7702），但在Hep3B、Smmc-7721、HepG2细胞株中的高表达（P<0.05），且在Hep3B、Smmc-7721中高表达尤为显著（P<0.01）。因此，我们后期实验选用肝癌细胞株（Hep3B、Smmc-7721）作为主要研究对象，以行机制等相关研究；且说明miRNA-3679可能在HCC的发生与发展中起着重要作用，并有可能作为潜在预后标记物之一，为下一步实验奠定基础。

通过ENCORI、miRDB、TargetScan三个数据库分别预测miR-3679的下游靶基因，预测结果取交集后得到62个潜在靶基因；使用TCGA数据库分析这62个潜在靶基因，筛选得到6个在HCC中下调的基因：GLUD1、B3GAT1、SLC46A3、MAP2K3、ATF5、ZADH2；为寻找这6个下调基因中与miR-3679关系最为密切的基因，qPCR检测转染miRNA-3679抑制剂（Lipofectamine 3000）后Hep3B细胞下游基因（GLUD1、B3GAT1、SLC46A3、MAP2K3、ATF5、ZADH2）的表达水平，结果显示：ZADH2表达显著升高（P<0.01）。因此，我们选择ZADH2作为miRNA-3679的潜在靶基因为研究对象，并进一步验证相互关系。

ZADH2基因以可塑性相关基因蛋白-3（plasticity-related gene 3, PRG-3）被我们熟知（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=ZADH2）。PRG-3是PRGs家族中的一员，目前已发现5种可塑性相关基因蛋白（PRG1-5），均属于脂质磷酸酯酶超家族，主要表达于中枢神经系统；在其它脏器如肝脏、心脏、肺部都有表达^[20]。CHOI等^[21]报道ZADH2基因异常与血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)的升高有关，而VEGF在肿瘤的增殖、转移及侵袭等方面发挥重要作用^[22]。由此推断ZADH2可能在肿瘤的发生与发展中扮演重要角色。查阅相关文献，以ZADH2及PRG-3相关文献报道较少，且未见与其它脏器肿瘤报道，本研究通过生物信息学分析miRNA-3679下游靶基因，进一步用细胞培养验证抑制miRNA-3679后在Hep3B细胞中ZADH2的高表达，故将ZADH2作为潜在靶基因，并验证miRNA-3679与ZADH2的关系及对HCC细胞增殖、存活及凋亡等影响。

3.2. miRNA-3679通过抑制ZADH2发挥促进HCC细胞增殖、克隆能力

为验证miR-3679与ZADH2的相互作用，荧光素酶活性检测结果提示转染miR-3679 inhibitor后，荧光素酶活性显著升高，而ZADH2基因与miR-3679的结合位点突变后，转染miR-3679 inhibitor则对荧光素酶活性不再产生影响；由此说明miR-3679可通过预测的位点直接调控ZADH2的水平。为进一步验证miRNA-3679可调控ZADH2的表达，Western blot检测miR-3679 inhibitor组中的ZADH2蛋白表达高于NC组，实验结果提示：抑制miRNA-3679可促进ZADH2基因的表达并通过该路径发挥生物学效应。肿瘤细胞的增殖、克隆能力及细胞存活能力与肿瘤的侵袭性密切相关，细胞周期的调控与肿瘤的发生及发展关系密切，调控受损可导致机体细胞的恶性增殖、侵袭性增加及凋亡的异常等^[23]；肿瘤发生与发展常伴随肿瘤细胞的凋亡受抑制；因此，对肿瘤细胞的增殖、存活、细胞周期及细胞凋亡的研究，有助于阐述肿瘤的发生及发展机制，以靶向干预，提高HCC治疗的预后。EdU分析检测结果显示miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组阳性细胞数低于NC组及miRNA-3679 inhibitor组（P<0.01）；克隆形成实验说明抑制miRNA-3679后可抑制HCC细胞的克隆能力，但阻断ZADH2后可明显减弱其抑制作用，但仍低于NC组，说明可能还有其它通路调控HCC细胞增殖，但不是主要通路；因此，我们推断：miRNA-3679可通过抑制下游ZADH2发挥HCC细胞增殖与克隆的作用。

细胞凋亡是受多种基因精确调控的主动的、程序化的死亡过程^[24]；传统的凋亡包含三大途径，即Bax和B细胞淋巴瘤2相关蛋白X（Bcl-XL）介导的信号通路，线粒体、死亡受体诱导的及经内质网途径介导，涉及活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生和MAPK家族参与胞内信号转导通路，肿瘤发生与发展常伴随肿瘤细胞的凋亡受抑制^[25]；研究表明，HCC细胞的凋亡与组织学分级、淋巴结转移、临床分期等密切相关；为了解miRNA-3679与ZADH2对肿瘤细胞凋亡的影响，流式细胞术提示miR-3679 inhibitor组及miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组细胞凋亡数目均大于NC组（P<0.01）；miR-3679 inhibitor+si-ZADH2组低于miR-3679 inhibitor组（P<0.01）。结果提示，抑制miR-3679可促进Hep3B和Smmc-7721细胞的凋亡，但抑制ZADH2后明显抑制miR-3679的抑制细胞凋亡作用，说明miRNA-3679通过抑制ZADH2发挥抑制HCC细胞凋亡作用。

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利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突